Přenos MRNA ve velkém měřítku mezi Haloxylon Ammodendron (Chenopodiaceae) a bylinným kořenem Holoparazit Cistanche Deserticola (Orobanchaceae)
Feb 07, 2023
Zvýraznění
•Deset tisíc mRNA se přenáší mezi Haloxylon ammodendron a kořenovým parazitemCistanche deserticola
•Mobilita RNA a funkční analýza byly provedeny v systému slunečnice-Orobanche cumana
•CdNLR1 a CdNLR2 by způsobily kořenově specifickou HR a ovlivnily parazitní rovnováhu
souhrn
Byly ukázány výměny mRNA mezi hostitelem a kmenovými parazity, ale ne kořenovými parazity.Cistanche deserticola(Orobanchaceae) je aholoparazitická bylinakterý parazituje na kořenech dřeviny Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae). Použili jsme sekvenování transkriptomu a bioinformatické analýzy k identifikaci téměř deseti tisíc mobilních mRNA. Zdá se, že množství transkriptů je hnací silou pro přenos a výměny mRNA nastávají prostřednictvím haustoriálního spojení. Mobilita vybraných mRNA byla potvrzena in situ a v heterologním parazitickém systému slunečnice-Orobanche cumana. ČtyřiC. deserticola→H. Zdá se, že mobilní mRNA ammodendronu usnadňují vývoj haustoria. Zajímavé je, že dvě mobilní mRNA předpokládaných genů rezistence CdNLR1 a CdNLR2 způsobují kořenově specifickou hypersenzitivní reakci a zpomalují vývoj parazitů, což může přispívat k parazitické rovnováze. Tato studie poskytuje důkazy o rozsáhlém přenosu mRNA mezi dřevitým hostitelem a kořenovým parazitem a demonstruje funkční význam šestiC. deserticolageny v interakcích hostitel-parazit.
Oblasti předmětu
Biologie rostlinInterakce rostlin s organismyOmikaTranskriptomika
Úvod
Stále více důkazů naznačuje význam makromolekul, jako jsou proteiny a mRNA v komunikaci na krátkou i dlouhou vzdálenost v rostlinách.1 Plazmodesmata jsou považována za transportní kanály na krátkou vzdálenost, zatímco cévní systém provádí molekulární transport na dlouhou vzdálenost mezi distálními tkáněmi.2 ,3 Uvádí se, že mRNA se přenáší ve floému.4 Nedávné studie ukázaly, že struktura kmenové smyčky původu tRNA poskytla mRNA transportní kapacitu na dlouhé vzdálenosti.5 AtRRP44A, podjednotka exozomu RNA, interagovala s plasmodesmaty a ke zprostředkování přenosu mRNA KNOTTED1 (KN1) z buňky do buňky.6
Parazitické rostliny tvoří asi 1 procento kvetoucích rostlin. Nejdůležitějším rysem parazitických rostlin je specializovaná struktura zvaná haustorium, která vytváří fyzické a fyziologické spojovací kanály mezi hostitelem a parazitickými rostlinami, a tak dominuje většině jejich interakcí.7 Parazitické rostliny se spoléhají na to, že hostitel udržuje svůj růst, absorbuje vodu a živiny, jako jsou fotosyntáty, aminokyseliny a další intermediární metabolity z hostitele přes haustorium.8 Haustoria také fungují jako spojovací most mezi hostiteli pro přenos signálních molekul, jako je signál býložravců.9 Bylo také prokázáno, že biomolekuly včetně proteinů a RNA se vyměňují obousměrně prostřednictvím spojení hostitel-parazit. Nejčasnějším příkladem přenosu RNA mezi hostitelem a parazitickými rostlinami je přenos RNA viru z infikovaného hostitele do neinfikované rostliny prostřednictvím dodder.10 Byly ukázány malé RNA (sRNA), jako je malá interference RNA (siRNA) a mikroRNA (miRNA). pohybovat se mezi hostitelem a parazitem a regulovat tak expresi cílových genů v recipientních organismech.11,12,13 Pokud jde o přenos mRNA, mobilní mRNA z hostitele rajčete, dýně a vojtěšky do parazita Cuscuta chinensis byly prokázány u několika genů v počátečním test.14 Prostřednictvím mikročipové analýzy Roney et al. zjistili, že 474 mRNA bylo přeneseno z rajčat do dodder.14 Rozsáhlé identifikace přenosových mRNA však bylo dosaženo pouze s využitím technologie sekvenování nové generace. Kim a kol. použili technologii sekvenování transkriptomu k identifikaci rozsáhlého a obousměrného přenosu mRNA mezi parazitem Cuscuta pentagona a hostiteli, jako je Arabidopsis thaliana a rajče.15 Funkční význam transferových mRNA v interakcích hostitel-parazit však nebyl jasný.
Orobanchaceae je největší parazitická čeleď krytosemenných, ve které jsou mnozí fakultativní nebo obligátní kořenoví parazité.16 Cistanche je celosvětový rod holoparazitických pouštních rostlin v Orobanchaceae. C. deserticola je holoparazit, který parazituje na kořenech dřevnatého psamofytu Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae).17 Bylo prokázáno, že gen chloroplastu rpoC2 byl přenesen z H. ammodendron do C. deserticola horizontálním přenosem genů.18 Zde jsme identifikovali téměř deset tisíc mobilních mRNA mezi C. deserticola a H. ammodendron prostřednictvím sekvenování transkriptomu nové generace a bioinformatické analýzy. Mobilní mRNA byly zjišťovány vícenásobným sekvenčním seřazením, PCR validací a zejména využitím parazitického systému slunečnice-Orobanche cumana. U několika genů byla tímto heterologním parazitickým systémem prokázána také funkce mobilních mRNA. K dnešnímu dni byly zprávy o funkční výměně mRNA mezi hostitelem a parazitem velmi omezené. Naše studie proto poskytuje nový pohled na parazitní mechanismus z pohledu mobilních mRNA.
Výsledek
Identifikace mobilních mRNA mezi C. deserticola a H. ammodendron
Těsné fyzické spojení kořene hostitele H. ammodendron a parazita C. deserticola znemožňuje jejich oddělení v haustoriu. Proto jsme zkombinovali vysoce výkonné sekvenování RNA (RNA-seq) a postupnou bioinformatickou klasifikaci, abychom identifikovali mobilní transkripty mezi hostitelem a parazitem. Byly odebrány čtyři různé sady vzorků pro analýzy RNA-seq na platformě Illumina HiSeq2500. Patří mezi ně kořenová tkáň hostitele bez parazitů H. ammodendron (HA), sukulentní stonekC. deserticola(CD), kořenová tkáň hostitele H. ammodendron parazitovaná sC. deserticola(HC) a haustoriální rozhraní (HI). U vzorků HC a CD byly příslušné kořeny hostitele a kmen parazita odebrány 1 cm odparazitní křižovatka(Obrázek 1A).
Obrázek 1. Analýza RNA-seq a potvrzení mobilních RNA
(A) Ilustrace vybraných tkání pro analýzu RNA-seq. CD, čerstvé sukulentní stonky C. deserticola poblíž haustoriálního spojení; HC, kořeny H. ammodendron infikované CD; HI, haustoriální rozhraní. Jsou vyznačeny stupnice.
(B) Nástin strategií pro sestavení sekvencí a potvrzení mobilních RNA. RNA-seq, sekvenování RNA nové generace. ISO-Seq, sekvenování transkriptomu v plné délce. HA, kořeny neparazitovaného H. ammodendron. HA.FL_NR, transkriptomová sekvence plné délky H. ammodendron. CD.FL_NR, kompletní transkriptomová sekvence C. deserticola.
(C) Predikce ORF a další potvrzení výsledku sestavení. Pro predikci ORF byl použit vyhledávač ORF (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) a nad sestavené unigeny s hodnotou prahu exprese (FPKM větší nebo rovno 0,3 ) byly křížově zkontrolovány. Překrývající se unigeny byly dále filtrovány duálním BLASTN (hodnota E=1e−10) proti unigenům Cis a HAC.
(D) Vennovy diagramy ukazující společné a odlišné sady transkriptů mezi vzorky CD, HA a HC.
Spolehlivá identifikace zdrojové tkáně pro daný transkript z interagujících organismů je náročný problém. Proto Ikeue a spol. vyvinuli užitečnou bioinformatickou metodu pro rozlišení hostitelských a parazitních transkriptů.19Zde jsme použili modifikovaný bioinformatický přístup, který je založen na jejich metodě k identifikaci mobilních mRNA mezi nimiC. deserticola aH. ammodendron(Obrázek 1B). Z výše uvedených knihoven bylo vygenerováno celkem 723 382 940 čistých čtení (tabulka S2) a tato čtení byla sestavena pomocí různých strategií (obrázek 1B). Výsledkem bylo, že všech deset vzorků bylo hybridně sestaveno do 222 899 unigenů (dále označovaných jako "kombinované", tabulka S3).C. deserticolaaH. ammodendronvzorky byly také sestaveny do 107 752 a 194 720 unigenů, v daném pořadí (označovaných dále jako „Cis" a „HAC", tabulka S3). Pro vizualizaci variace i podobnosti pro všechny vzorky jsme provedli analýzu hlavních složek (PCA) na normalizovaných hodnotách FPKM všech detekovaných genů v "kombinovaných unigenech". Graf PCA ukázal, že data pro tři biologické replikáty byla těsně seskupena a byla oddělena v různých vzorcích, zejména mezi nimiH. ammodendronaC. deserticola(Obrázek S1). Mezitím předpověď ORF ukázala, že se předpokládá, že 149 825 (67,23 procent) "kombinovaných" unigenů kóduje domnělé proteiny (obrázek 1C). Individuálně sestavené unigeny s hodnotou prahu exprese FPKM větší nebo rovnou 0.3 ze čtyř různých vzorků byly křížově zkontrolovány s výsledky predikce ORF (tabulky S4–S6). Tato analýza zjistila, že 69,01–75,90 procent unigenů ze čtyř vzorků CD, HC, HA a HI mělo domnělý ORF (obrázek 1C). Bylo provedeno sekvenování transkriptomu v plné délce a data, CD_FL proC. deserticolaa HA_FL proH. ammodendron, byly použity pro opravu chyb sestavy pro oba hostiteleH. ammodendrona parazitC. deserticolaprotože oba druhy postrádají genomická data (tabulky S8–S11). Když byly přiřazené unigeny shora čtyři vzorky filtrovány duálním BLASTN (hodnota E=1e−10) oproti Cis, HAC, CD_FL a HA_FL, 94,78–99.00 procent z nich mělo spolehlivé konsenzuální sekvence (obrázek 1C a tabulka S7). Na základě výše uvedené analýzy bylo nakonec získáno 17 379 (14 810 exkluzivních HA a 2 569 obsahujících HA) společných unigenů z HC a CD pomocí analýzy Vennova diagramu unigenů z CD, HC a HA (obrázek 1D). Mezi nimi je bývalých 14 810 unigenů s největší pravděpodobností původem z parazitního CD kvůli jejich nepřítomnosti v HA, ale část z nich může také představovat mobilní mRNA HC→CD, které jsou přítomny pouze v HC, ale ne v HA kvůli jejich up-regulaci. na uchycení parazita. Posledních 2 569 unigenů s největší pravděpodobností představuje jednosměrné HC→CD transferové mRNA, protože jsou také přítomny v HA. Ostatní unigeny byly vyloučeny z kandidátních mobilních mRNA, protože nebyly sdíleny mezi HC a CD. Měli bychom také poznamenat, že 14 810 společných unigenů v [HC, CD] převyšovalo 166 společných unigenů v [HA, CD] 89krát, což vysoce naznačuje spolehlivost našich analýz, protože ta byla logicky nemožná a byla způsobena nevyhnutelnými chybami unigenu. montážní nebo bioinformatické analýzy (obrázek 1D).
Původ domnělých mobilních mRNA byl dále potvrzen duálními analýzami BLAST pro přiřazení jejich sekvenčního původu (obrázek 1B a tabulka S12). Vzhledem k nedostatku genomických dat pro hostitele i parazita jsme použili dostupná sekvenční data pro organismy čeledi Chenopodiaceae a Orobanchaceae, ke kterýmH. ammodendronaC. deserticolapatří resp. Naší hypotézou je, že mobilní mRNAH. ammodendronpůvodu mají s největší pravděpodobností vyšší homologie se svými ortology z jiných druhů Chenopodiaceae než ty z druhů Orobanchaceae, zatímco u mobilní mRNA je tomu naopakC. deserticolapůvodu a konzervované ortologové mají pravděpodobně vysokou podobnost jak s Orobanchaceae, tak s Chenopodiaceae. Tato analýza by nám mohla pomoci zjistit původ mobilních mRNA, protože by mohly být přiřazeny k úrovni rodiny pomocí vyhledávání homologie. Pro potvrzení naší hypotézy byl pomocí OrthoFinder zkonstruován fylogenetický strom třiceti sedmi druhů, včetně šesti druhů Orobanchaceae a čtyř druhů Chenopodiaceae. Vzdálená evoluční vzdálenost mezi druhy Orobanchaceae a Chenopodiaceae potvrdila spolehlivost naší hypotézy (obrázek 2A a tabulka S13). Analýza ztráty genů ukázala, že transkripty pro mnoho ortoskupin a genů souvisejících s fotosyntézou chyběly vC. deserticola(Obrázky 2B a 2C, tabulka S14, data S2 a S3). Navíc analýza Vennova diagramu meziC. deserticolaa tři další sekvenované parazitické rostliny také ukázaly, že 53,84 procenta (926/1 720) chybějících ortoskupin vC. deserticolachyběly také v dalších třech parazitických rostlinách, konkrétně 50,81 procenta (755/1486), 48,09 procenta (377/784) a 50.00 procent (260/520) vC. australis, Asijská strigaaPhtheirospermum japonicumrespektive (obrázek S2). Tyto výsledky nejen ukázaly parazitickou vlastnost tohoto druhu, ale také spolehlivost sestavení unigenu z našich analýz a také podpořily naši hypotézu použít relativní rostlinné druhy pro potvrzení původu sekvence. Proto byly kandidátní transferové unigeny z výše uvedených analýz odděleny duálním BLASTN (hodnota E=1e−10) proti sbírce veřejně dostupných souborů sekvenčních dat z Orobanchaceae (přepis zTriphysaria versicolor, Striga hermonthica a Phelipanche aegyptiaca; Sekvence EST a mRNA z NCBI) a Chenopodiaceae (transkriptom nové generace a plné délkyH. ammodendron; EST a mRNA sekvence z NCBI) (obrázek 1B a tabulka S12). V důsledku toho bylo potvrzeno, že 7 496 unigenů pochází z parazitaC. deserticola, což představuje 9,66 procenta (7 496/77 615) a 13,70 procenta (7 496/54 721) unigenů v cílových HC vzorcích a zdrojovém CD; a 2 370 unigenů bylo přiřazeno k hostiteliH. ammodendron, což představuje 3,38 procenta (2 370/70 119) a 4,15 procenta (2 370/57 091) unigenů ve vzorcích zdrojového HC a cílového CD (obrázky 2D a 2E, tabulky S7, S12 a S15). Společných 2 931 unigenů bylo příliš homologních, než aby je bylo možné přiřadit přesnému zdrojovému organismu. Tyto výsledky ukázaly, že téměř deset tisíc (7 496 plus 2,370 = 9,866) unigenů by se mohlo přenést mezi kořenovými parazitickými rostlinamiC. deserticolaa hostitelem dřevinyH. ammodendron. Mnohem více (7 496/2,370 = 3.16-násobně) mobilních RNA bylo parazitůC. deserticolapůvodu než hostiteleH. ammodendronpůvod, ukazující zkreslení přenosu mRNA ve směru parazit → hostitel.
Obrázek 2. Analýza ztráty genu a další potvrzení mobilních RNA prostřednictvím vícenásobného zarovnání
(A) Fylogeneze genomů kvetoucích rostlin. OrthoFinder byl použit k analýze evoluce všech proteinových sekvencí 37 druhů a k nalezení ortogonální skupiny včetně přímých homologních genů a kolaterálních homologních genů mezi druhy.
(B) Procento ztracených ortoskupin. Počet delecí ortoskupiny v semiparazitických rostlinách a celkových parazitických rostlinách.
(C) Procento ztracených unigenů. Byl ukázán podíl genů souvisejících s fotosyntézou a metabolismem.
(D) Vennovy diagramy ukazující společné a odlišné sady transkriptů mezi vzorky CD a HC při vícenásobném zarovnání. CD_transCD→HC mobilní RNA. HC_transmobilní RNA HC→CD.
(E) Koláčové grafy ukazují proporce mobilních čtení mapovaných na přepisy CD (vnější kruh) a HC (vnitřní kruh).
