Lamivudin zlepšuje kognitivní úpadek u myší SAMP8: Integrace in vivo farmakologického hodnocení a síťové farmakologie

Abstraktní

Inhibitory reverzní transkriptázy, jako je lamivudin (3TC), hrají důležitou roliproti stárnutí, ale jejich účinky naneurodegenerativní choroby způsobené stárnutímnejsou jasné, zejména pokud jde o funkcenervový systém, jako je kognice. V této studii jsme podávali 3TC myším náchylným k senescenci 8 (SAMP8) pomocí perfuze žaludku (100 mg/kg) po dobu 4 týdnů. Naše výsledky ukázaly, že 3TC výrazně zlepšilostav stárnutí myší SAMP8, zejména pokles kognitivních schopností hodnocených Morrisovým testem ve vodním bludišti. K dalšímu zkoumání molekulárních mechanismůzlepšení stavu stárnutíSAMP8 myší pomocí 3TC, metody qPCR a tkáňového barvení byly použity ke studiu mozkových tkání (tj. hipokampu a kůry) myší, zatímco síťová farmakologická analýza byla použita ke zkoumání potenciálních cílů 3TC. Výsledky ukázaly, že hladiny mRNA genů související s dlouhým rozptýleným elementem-1, odpovědí na interferon typu 1, sekrečním fenotypem spojeným se stárnutím aAlzheimerova chorobav hippocampu a kortexu myší SAMP8 byly zvýšeny v důsledkustárnutí, ale tento trend byl částečně zvrácen 3TC. Výsledky histologických studií ukázaly, že 3TC snižuje odumírání hipokampálních neuronů, zatímco výsledky síťové farmakologické analýzy ukázaly, že 3TC může uplatňovat svůj vliv prostřednictvím mnoha drah, včetně estrogenové signalizace a signálních drah PI3K/Akt a neuroaktivních interakcí ligand-receptor. což jsme ověřili pomocí experimentů in vitro. Tato zjištění poskytují důkaz pro terapeutický potenciál 3TC při léčbě neurodegenerativních onemocnění.

KLÍČOVÁ SLOVAstárnutí, kognitivní schopnosti, lamivudin, lvložený prvek-1, neurodegenerativních onemocnění

Čínské Byliny Cistanche Vliv naInhibitory reverzní transkriptázy On Anti-aging

1|ÚVOD

K dnešnímu dni stárnutí a neurodegenerativní onemocnění, jako je kupřAlzheimerova (AD) nebo Parkinsonova chorobav souvislosti se stárnutím neustále narůstají v důsledku globálních demografických změn.1,2 Pokles kognitivních funkcí představuje vážnou překážku pro dosažení dlouhého a zdravého života. Po celá desetiletí bylo věnováno značné úsilí hledání léků, které lze použít k léčbě kognitivní degenerace se stárnutím.3 V posledních letech získává stále větší pozornost prvek long interspersed-1 (L1) jako potenciální román cíl pro studium stárnutí.4 L1 patří do nejhojnější rodiny nedlouhých terminálních repetitivních retrotranspozonů s ~500,{10}} kopiemi, které tvoří ~17 procent lidského genomu. Gen L1 obsahuje operon se dvěma otevřenými čtecími rámci (ORF1 a ORF2), z nichž oba jsou vyžadovány pro retrotranspozici.5–7 ORF1 kóduje protein (ORF1p) s aktivitami reverzní transkriptázy, který může být inhibován nukleosidovými analogy, jako je např. lamivudin (2'-3'-deoxy-3'-thiocytidin, 3TC).8

Aktivní L1 může syntetizovat cDNA mimo chromatin a poté ji znovu vložit do genomu katalyzovaného ORF1p, což nakonec změní expresi jiných genů a vede k onemocněním spojeným s genomovou nestabilitou.9,10 Hostitel obecně inhibuje transponovatelnou aktivitu L1 prostřednictvím série regulace, jako je epigenetická modifikace a regulace faktoru limitujícího hostitele.11,12 Transpozice L1 se obecně vyskytuje pouze v zárodečných nebo rakovinných buňkách, zatímco nedávné studie ukázaly, že L1 je také vysoce aktivní v centrálním nervovém systému nebo stárnoucích buňkách. základní nervové mechanismy L1 jsou nejasné.13 Studie ukázaly, že faktory (např. TREX1, RB1 a FOXA1) související s mechanismem monitorování L1 jsou při stárnutí buňky dysfunkční, což vede k aktivaci L1. TREX1 je 3' exonukleáza, která degraduje cizí invazní DNA a její ztráta byla spojena s akumulací cytoplazmatické L1 cDNA.14 Bylo prokázáno, že RB1 se váže na repetitivní elementy, včetně elementů L1, a podporuje jejich heterochromatinizaci.15 A FOXA1 je up-regulovány v senescentních buňkách13 a vázány na centrální oblast L1 5' UTR. Aktivovaný L1 dále aktivuje reakci interferonu typu I (IFN-I), který indukuje zánět prostřednictvím reverzní transkripční cDNA a udržuje sekreční fenotyp spojený se stárnutím (SASP). Proto je L1 jako důležitý faktor aseptického zánětu způsobeného stárnutím považován za důležitý cíl pro léčbu nemocí souvisejících se stárnutím. U starších myší léčených 3TC se akumulace zánětlivých faktorů zlepšuje inhibicí extracelulární transkripce L1 ve svalech a jiných tkáních.16 Dosud jsou studie účinků inhibitorů reverzní transkriptázy na funkce nervového systému řídké. V poslední době byly v mozcích zemřelých pacientů s AD nalezeny tisíce variant genomové cDNA (gencDNA), které jsou výsledkem opětovného vložení charakteristických sestřihových variant RNA do genomu.17 Tento jev je považován za důležitou příčinu AD. Faktory způsobující tvorbu gencDNA zahrnují transkripci, destrukci DNA, reverzní transkriptázu a stárnutí.

Studie prokázaly, že proces tvorby gencDNA je blokován použitím nukleosidových inhibitorů reverzní transkriptázy v buněčných liniích ovarií čínského křečka (CHO) s endogenními aktivitami reverzní transkriptázy.19 Kromě toho pacienti s AIDS starší 65 let, kteří užívali inhibitory reverzní transkriptázy po dlouhou dobu se zřídka vyvinula AD.20 Proto předpokládáme, že 3TC jako inhibitor reverzní transkriptázy může být potenciálním lékem pro léčbu kognitivních poruch a neurodegenerativních onemocnění způsobených stárnutím. Ukázalo se, že myši náchylné k senescenci 8 (SAMP8) jako model pro studium lidského stárnutí a nemocí souvisejících s věkem vykazují mnoho znaků, o kterých je známo, že se vyskytují v raných stádiích neurodegenerativních onemocnění, jako je zvýšený oxidační stres, neurozánět a kognitivní V této studii byly proto myši SAMP8 vybrány jako ideální zvířecí model pro neurodegenerativní onemocnění způsobená stárnutím. Zaměřili jsme se na kognitivní účinky 3TC na předčasně stárnoucí myši a molekulární dráhy spojené se stárnutím, čímž jsme poskytli důkaz o úloze inhibitorů reverzní transkriptázy v léčbě neurodegenerativních onemocnění způsobených stárnutím. Dále jsme použili metodu síťové farmakologie k predikci cílů 3TC, konstrukci sítí a analýze biologických funkcí a drah souvisejících s 3TC.

2|EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 2.1 |

Zvířata Po 1-týdenním aklimatizačním období byli použiti 44-týdenní samci myší SAMP8 a příbuzní normální myši s akcelerovanou senescencí-R1 (SAMR1) poskytnuté Univerzitou tradiční čínské medicíny v Tianjinu. Experimentální protokol na zvířatech byl schválen Etickým výborem pro zvířata v provinční nemocnici Shandong a byl proveden na základě Příručky pro péči a používání laboratorních zvířat National Institutes of Health (NIH). Myši byly drženy v autoklávovaných klecích a dostávaly sterilní potravu a vodu. Každý den byla zaznamenávána tělesná hmotnost myší. Vývojový diagram experimentů provedených v této studii je uveden na obrázku 1A. Po dokončení experimentů byly myši usmrceny inhalací diethyletheru.

2,2|Příprava a ošetření 3TC

Léky byly čerstvě připraveny v den každého experimentu. 3TC zakoupený od MCE (Shanghai, Čína) byl rozpuštěn v DMSO na konečnou koncentraci 2 mmol/l. Zásobní roztok byl poté zředěn na pracovní koncentraci pomocí pitné vody s konečnou koncentrací DMSO nižší než 0,1 procenta. Byly vytvořeny tři skupiny myší: kontrolní skupina léčená roztokem vehikula (pitná voda), testovací skupina léčená 3TC a skupina SAMR1, která dostávala vehikulum použité jako další kontrolní skupina pro stárnutí. Testovaná skupina dostávala orálně 3TC v dávce 100 mg/kg za den. Všechny myši byly krmeny intragastrickým podáváním po dobu 4 týdnů (obrázek 1B).

OBRÁZEK ​​1 Návrh experimentu a účinky 3TC na zlepšení relativního úbytku hmotnosti v důsledku stárnutí a skóre senescence. (A) Vývojový diagram farmakologických experimentů pro studium účinku 3TC na kognitivní schopnosti myší SAMP8. (B) Schematické znázornění rozvrhu pokusů na zvířatech. (C) Koncepční pracovní postup pro predikci interakcí lék-cíl pomocí Pharmmapperu ukazující zleva doprava molekulární strukturu 3TC, 3D strukturní diagram 3TC a model farmakoforu predikovaný s vazbou 3TC na estrogenový receptor s nejvyšší normalizací fit skóre. (D) Vzorec růstu tělesné hmotnosti v každé skupině myší. (E) Změny ve skóre před a po léčbě 3TC. Vehikulum SAMR1 plus: 44-týdenní myši SAMR1 léčené vehikulem po dobu 4 týdnů. Vehikulum SAMP8 plus: 44-týdenní myši SAMP8 léčené vehikulem po dobu 4 týdnů. SAMP8 plus 3TC: 44-týdenní myši SAMP8 léčené 3TC po dobu 4 týdnů. Studentův t-test: *p < 0.05, **p < 0,01 a ***p < 0,001. ns: žádná statistická významnost. Černé hvězdičky představují srovnání se skupinou vehikul SAMR1 plus. Červené hvězdičky představují srovnání se skupinou SAMP8 plus vehikulum. Modrá čára označuje skupinu SAMP8 plus 3TC ve věku 44 a 48 týdnů.

2,3|Bodovací systém hodnocení

Stupeň stárnutí u myší byl hodnocen pomocí hodnotícího systému skóre popsaného dříve.22 Každá kategorie skóre obsahuje pět úrovní v rozmezí od 0 do 4, přičemž nejvyšší skóre stupně označuje nejvyšší stupeň stárnutí zvířete. . Skóre pro každou kategorii bylo hodnoceno samostatně čtyřmi zkušenými experimentátory, kteří byli zaslepení vůči podmínkám léčby (doplňková tabulka S1).

.2.4|Morrisův test vodního bludiště

Studie Morrisova vodního bludiště byly provedeny podle Morrisova protokolu, včetně experimentu s orientační navigací a pokusů sondy.23 Vodní bludiště byl kruhový bazén (průměr 120 cm vybavený plošinou o průměru 10 cm) a naplněný vodou při teplotě 25 °C. ± 1 stupeň. Myši byly vycvičeny tak, aby během jedné minuty našly plošinu pod hladinou vody. Pokud myš nenašla plošinu do 60 s, byla navedena na plošinu a mohla tam zůstat 20 s. Každá z myší byla trénována pětkrát denně, přičemž každá byla od sebe vzdálena 15 minut. V každém pokusu byla výchozí pozice jiná, v pseudonáhodném pořadí. Šestý den testu byla plošina odstraněna a zvíře vstoupilo do vodního bludiště z bodu opačného ke kvadrantu bludiště, kde bývala plošina během tréninku, a bylo mu umožněno prozkoumávat bludiště po dobu 60 sekund. Plavecká dráha a množství času, které myši strávily hledáním bludiště, byly zaznamenány videokamerou a analyzovány pomocí EthoVision XT (Noldus Software). Každá skupina sestávala z minimálně osmi zvířat.

2,5|Extrakce RNA a kvantitativní PCR

Celková RNA byla extrahována z hipokampálních a kortikálních tkání myší po ošetření pomocí TRIzol Reagent (Invitrogen) podle protokolu výrobce. Každý vzorek RNA (1 ug) byl reverzně transkribován, aby se vytvořila cDNA pomocí cDNA Reverse Transscription Kit (Takara) a poté PCR-amplifikován pomocí TaKaRa Taq Kit (Takara). Sady primerů jsou popsány v doplňkové tabulce S2.

2,6|Příprava tkáně

Zvířata byla anestetizována diethyletherem a jejich mozky byly odebrány po transkardiální perfuzi fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a 4% roztokem paraformaldehydu. Mozkové tkáně byly odstraněny a fixovány v paraformaldehydu po dobu 2 dnů. Fixované mozky byly zality v parafínu s hipokampální tkání nařezanou na tloušťku 5 μm.

2,7|Barvení hematoxylinem a eosinem (H & E).

Morfologie mozku byla analyzována pomocí metod barvení hematoxylinem a eosinem (H & E). Parafinové řezy hipokampálních tkání byly zbaveny vosku a dehydratovány gradientem alkoholu o sérii koncentrací. Barvení HE bylo provedeno s použitím soupravy pro barvení H&E (Solarbio) podle pokynů výrobce. Po ponoření do ethanolu a xylenu byly řezy upevněny pryskyřicí a pozorovány pod světelným mikroskopem (Olympus).

2,8|Barvení Nissl

K detekci neuronálního poškození na řezech tkání hipokampu byla použita metoda Nissl barvení (Biyuntian). Řezy byly inkubovány s barvivem Nissl po dobu 30 minut a promyty 95% ethanolem. Obarvené buňky byly spočítány a vyfotografovány pod světelným mikroskopem (Olympus). Buňky byly spočítány na třech náhodně vybraných nepřekrývajících se polích v každém sklíčku hipokampální tkáně s indexem přežití definovaným jako počet přežívajících neuronů/celkový počet neuronů.

2,9|Barvení TUNEL

Řezy hipokampálních tkání byly inkubovány s roztokem proteinázy K po dobu 15 minut, poté následovala inkubace s reakční směsí TUNEL (Beyotime). Po trojím promytí PBS byly řezy upevněny montážním roztokem obsahujícím jaderné barvivo DAPI a pozorovány za použití buď běžného fluorescenčního mikroskopu nebo konfokálního laserového fluorescenčního mikroskopu.

2.10|Konstrukce cílové databáze 3TC

Cílová databáze 3TC byla vytvořena na základě dvou databází. Nejprve byly identifikovány potenciální cíle 3TC pomocí reverzní farmakodynamické genové mapy založené na databázi Pharmmapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Všechny chemické složky byly převedeny do formátu '.mol2' pomocí Chembiodraw a nahrány do databáze Pharmmapper (obrázek 1C). Molekuly s normalizovaným fit skóre větším než 4.{7}} byly identifikovány jako potenciální cíle 3TC. Za druhé, databáze ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_report_card/CHEMBL141/) byla použita k dotazování na biologické aktivity cílů nebo sloučenin. Proteiny ověřené jako odvozené od Homo sapiens byly identifikovány jako potenciální cíle 3TC.

2.11|Analýza interakce cílových proteinů a konstrukce sítě

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 byly vybrány v navrženém nastavení po odstranění duplicit.

Aby bylo možné komplexně prozkoumat molekulární mechanismy 3TC, byly sítě PPI zkonstruovány pomocí softwaru Cytoscape verze 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Stupňová analýza uzlů byla provedena pomocí Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape), aby se prověřily geny rozbočovače v sítích s hodnotou centrality blízkosti, hodnotou centrality mezi a hodnotou stupně centrality nastavenými na {{6 }}.2, 450 a 50, v tomto pořadí.

2.12|Obohacení a screening signálních cest pro 3TC

Pro anotaci biologických funkcí byla provedena analýza obohacení genové ontologie (GO) o biologické procesy, buněčné složky a molekulární funkce potenciálních cílů na základě bioinformatické databáze DAVID (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). Metabolické dráhy KEGG byly anotovány na základě databází Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pomocí online serveru KEGG Automatic Annotation Server (http://www.genome.jp/kegg/)

2,13|Vazba 3TC na predikované cíle

Soubory struktury SDF sloučeniny 3TC byly získány z webové stránky Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Soubor SDF byl transformován do souboru PDB pomocí softwaru OpenBabel2.3.2 a receptorové proteiny ADRB2 (PDBID:3KJ6), AKT1 (PDBID:4EKL) a EGFR (PDBID:6S9C) byly získány z databáze Protein Data Bank (www.wwpdb .org). K odstranění vody a ligandů z receptorových proteinů byl použit software PYMOL2.3.4. Studie dokování byla provedena pomocí AutoDock Vina (1.1.2), což je open-source molekulární dokovací software vyvinutý společností Scripps. Software Tools byl použit k modifikaci čtyř receptorových proteinů a příkaz Grid Box pod programem Grid byl použit k otevření nástroje Grid Option pro analýzu každého receptorového proteinu. Vzdálenost mřížky byla nastavena na 1 a střed kapsy byl nastaven jako střed vazebného místa.

2,14|Buněčná kultura a léčba

Myší hipokampální neuronální buněčné linie HT22 byly zakoupeny od Shanghai Cell Biotechnology Company. Buňky HT22 byly kultivovány v DMEM doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS). Buňky byly nasazeny na 6-jamkové destičky 1 den před experimentálním ošetřením. Senescence buněk byla indukována formaldehydem (FA), zakoupeným od Sigma-Aldrich, jak bylo popsáno dříve.24 Buňky HT22 byly rozděleny do tří skupin, včetně skupiny FA ošetřené 30 umol/l FA po dobu 24 hodin, FA/3TC skupina léčená jak 30 umol/l FA, tak 50 umol/l 3TC, a kontrolní skupina kultivovaná bez buď FA nebo 3TC.

2,15|Imunofluorescence a mikroskopie

Médium bylo odstraněno a buňky byly fixovány pomocí 2% roztoku paraformaldehydu po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Imunofluorescenční experiment byl proveden, jak bylo popsáno dříve.25 Protilátky použité v této studii zahrnovaly protilátku anti LINE-1 ORF1p (1:1000; Sigma-Aldrich) se sekundární protilátkou Alexa Fluor 594 (1:1000; Invitrogen) . Buňky byly inkubovány s DAPI (ředění 1:500; Thermo Fisher Scientific) po dobu 1 minuty pro označení jader. Po přidání antifluorescenčního zhášecího činidla byly buňky pozorovány pomocí konfokálního mikroskopu (Nikon). 2,16|Western blot analýza

Exprese EGFR, p-AKT1 (aktivní Aktl: fosforylovaný na S473) a ADRB2 byly měřeny analýzou Western blot. Celkový protein byl shromážděn z buněk po různých ošetřeních. Western blot byl proveden, jak bylo popsáno dříve.26 Protilátky použité v této studii zahrnovaly protilátku anti-EGFR (1:500; Sigma-Aldrich), protilátku anti-pAKT1 (1:1000; Sigma-Aldrich) a anti-ADRB2 protilátka (1:200; Sigma-Aldrich) s anti-králičí sekundární protilátkou (1:1 000; Invitrogen). Po promytí byly bloty vyvinuty detekčním systémem ECL Western blotting (Amersham, Aylesbury, UK).

2,17|Analýza dat a statistika

Každý experiment byl opakován alespoň třikrát a byl považován za platný, přičemž pokusy vykazovaly podobné výsledky. Výsledky byly prezentovány jako průměr ± standardní odchylka (SD). Významný rozdíl byl stanoven buď Studentovým t-testem s p < 0,05.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950