Krüppelův faktor 6 – zprostředkovaná ztráta katabolismu BCAA přispívá k poškození ledvin u myší a lidí
Feb 25, 2022
Změněný buněčný metabolismus vledvinaBuňky proximálního tubulu (PT) hrají kritickou roli v akutnímporanění ledvin (AKI). Transkripční faktor Krüppel-like factor 6 (KLF6) je rychle a silně indukován časně v PT po AKI. Zjistili jsme, že knockdown Klf6 specifický pro PT (Klf6PTKD) je ochranný proti AKI aledvinafibróza u myší. Kombinovaná sekvenační analýza imunoprecipitace RNA a chromatinu prokázala, že exprese genů kódujících katabolické enzymy rozvětvených aminokyselin (BCAA) byla zachována u myší Klf6PTKD, přičemž KLF6 obsazuje promotorovou oblast těchto genů. Naopak indukovatelná nadexprese KLF6 potlačila expresi genů BCAA a exacerbovala seporanění ledvina fibróza u myší. In vitro měly poškozené buňky nadměrně exprimující KLF6 podobné snížení exprese katabolického genu BCAA a byly méně schopné využívat BCAA. Kromě toho knockdown BCKDHB, který kóduje jednu podjednotku enzymu omezujícího rychlost v katabolismu BCAA, měl za následek sníženou produkci ATP, zatímco léčba zesilovačem katabolismu BCAA BT2 zvýšila metabolismus. Analýzafunkce ledvin, KLF6 a exprese genů BCAA u lidí chronicnemoc ledvinpacienti vykazovali významné inverzní korelace mezi KLF6 a oběmafunkce ledvin a exprese BCAA. Cílení na KLF6-zprostředkovanou supresi katabolismu BCAA tedy může sloužit jako klíčový terapeutický cíl u AKI aledvinafibróza.
CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL
Chronickýnemoc ledvin(CKD) způsobuje významnou morbiditu a mortalitu a má prevalenci v dospělé populaci USA ~ 15 procent. CKD může být důsledkem opakovaných záchvatů akutního onemocněníporanění ledvin(AKI) lze připsat environmentálním nebo toxickým urážkám nebo být sekundární k jiným nemocem nebo jejich léčbě. Ve většině případů je proximální tubulus (PT) primárním místem poškození u AKI, protože vysoká metabolická aktivita PT buněk je činí náchylnými k ischemickému poškození a jejich role při vylučování léků a toxinů vyžaduje tok potenciálně škodlivých látek. agens prostřednictvím PT buněk (1). Jednou takovou třídou činidel jsou chemoterapeutika poškozující DNA, která se hromadí v PT buňkách a způsobují ztrátu AKI a nefronu. Po poranění PT buňky dediferencují a vylučují rozpustné faktory, jako jsou členové rodiny Wnt a Hedgehog a cytokiny (1–4). Přežívající dediferencované PT buňky mohou znovu vstoupit do buněčného cyklu a proliferovat, aby opravily poraněné PT, po čemž následuje rediferenciace na plně funkční PT buňky (2). Nicméně buňky, které místo toho podstoupí zástavu buněčného cyklu v kontrolním bodě G2/M, se nemusí zotavit, což vede k atrofii a up-regulaci profibrotické signalizace (5), což spouští fibrózu stimulací diferenciace rezidentních fibroblastů na myofibroblasty, které vylučují proteiny extracelulární matrix, a nábor imunitních buněk, jako jsou makrofágy a T buňky (1).
klíčová slova:ledviny; akutní poškození ledvin; proximální tubul; transkripční faktor; aminokyseliny s rozvětveným řetězcem
Kromě indukce patogenních signálních drah vykazují poškozené PT buňky také drasticky změněný buněčný metabolismus. Nezraněné PT buňky se při produkci ATP silně spoléhají na mitochondriální oxidaci mastných kyselin, cyklus trikarboxylových kyselin (TCA) a oxidativní fosforylaci. V situaci poranění je však oxidace mastných kyselin potlačena, pouze s mírnou kompenzační up-regulací glykolýzy, takže celkové hladiny ATP jsou u poraněného PT sníženy (6). Kromě toho inhibice oxidace mastných kyselin in vitro způsobila dediferenciaci a apoptózu tubulárních epiteliálních buněk a in vivo zhoršilaporanění ledvinpo léčbě kyselinou listovou (6). Je zajímavé, že up-regulace buď mitochondriální oxidace mastných kyselin nebo peroxizomální oxidace mastných kyselin (FAO) může chránit předporanění ledvin(6, 7), což naznačuje, že zachování buněčného metabolismu může být terapeutickým cílem u AKI. Transkriptomické studie v biopsiích ledvin s lidským CKD a také po ischemickém reperfuzním poškození (IRI) u myší prokazují dysregulovaný metabolismus mastných kyselin a také metabolismus aminokyselin (6, 8). Ačkoli úloha oxidace mastných kyselin PT byla dříve popsána v AKI, zbývá prozkoumat úlohu metabolismu aminokyselin PT v AKI. Kromě toho byly dosud popsané mechanismy poškození PT z velké části prozkoumány pomocí myších modelů s knock-outem a nadměrnou expresí jednotlivých signálních molekul, ale mechanismy, kterými globální dráhy, jak fibrotické/zánětlivé, tak metabolické, a přepínání mezi normálním zotavením a atrofií jsou regulovány v AKI nejsou dobře charakterizovány.
Transkripční faktory působí jako hlavní regulátory základních biologických procesů díky své schopnosti regulovat expresi více downstream cílů a vytvářet zpětnovazební smyčky. V AKI jsou dobře prostudované transkripční faktory, jako jsou členové rodiny FOS a JUN, vysoce regulovány. Nedávné studie molekulárních odpovědí na IRI v lidských vzorcích a PT translační profilování po unilaterální ureterické obstrukci (UUO) u myší také identifikovaly transkripční faktor se zinkovým prstem Krüppel-like faktor 6 (KLF6) jako podobný gen časné reakce na poranění (9, 10 ). KLF zahrnují rodinu transkripčních faktorů se zinkovým prstem s vysoce konzervovanými C-koncovými doménami vázajícími DNA a variabilními N konci, které jsou široce exprimovány, včetněledvina(11). KLF6 hraje roli v mnoha procesech, jako je buněčná proliferace a diferenciace, apoptóza, reakce na poškození DNA a mitochondriální funkce (12) a bylo zjištěno, že hraje roli v jaterních, srdečních aledvinafibróza s účinky závislými na kontextu (13, 14). V rámciledvinaKLF6 je exprimován v glomerulárních podocytech a je základním regulátorem mitochondriální funkce v podmínkách fokální segmentální glomerulosklerózy (FSGS) (15). Kromě exprese v glomerulárních podocytech je KLF6 také variabilně exprimován v PT, ale jeho role v PT buňkách, ať už v normální funkci nebo po poranění, není známa. Nadměrná exprese KLF6 v buňkách HK-2 vedla k dediferencovanému fenotypu se sníženým E-cadherinem a zvýšenou expresí vimentinu a také vedla ke zvýšené expresi makrofágového zánětlivého proteinu-3 (16). Kromě toho se exprese KLF6 zvýšila v reakci na vysokou hladinu glukózy a tento účinek byl blokován knockdownem TGFB1 nebo ošetřením neutralizační protilátkou TGF- 1. Přímé ošetření TGF- 1 také vyvolalo expresi KLF6, což ukazuje na možnou smyčku pozitivní zpětné vazby v buňkách HK-2 (16). Bylo také prokázáno, že KLF6 je indukován v rakovinných buňkách in vitro subapoptickými dávkami chemoterapeutika cisplatiny poškozujícího DNA (17). Abychom určili roli PT KLF6 v reakci na poškození DNA, použili jsme přirozeně se vyskytující toxin kyseliny aristolochové I (AAI). Nefropatie spojená s AAI je klinicky relevantní (18) a toxicita AAI je vysoce specifická pro PT, což umožňuje studium role PT KLF6 specificky v reakci na poškození PT. Kromě toho AAI spolehlivě způsobuje jak AKI, tak přechod do fibrózy u myší, na rozdíl od většiny režimů s cisplatinou (19). AAI vstupuje do PT buněk prostřednictvím bazolaterálních transportérů organických aniontů (OAT) 1 až 3 a má jak genotoxické účinky prostřednictvím tvorby aristolaktamových (AL)-DNA aduktů, tak cytotoxické účinky, které způsobují mitochondriální poškození, které vytváří reaktivní formy kyslíku a specificky inhibuje normální Funkce PT, jako je receptorem zprostředkovaná endocytóza (18–20). Zde dokazujeme prostřednictvím modulace exprese KLF6 specificky v PT prostřednictvím studií zisku a ztráty funkce u myší, že KLF6-zprostředkované potlačení katabolismu aminokyselin s rozvětveným řetězcem (BCAA) přispívá k AKI a následnáledvinafibróza.
Výsledek
Léčba AAI zvyšuje renální PT expresi Klf6. Protože několik členů rodiny KLF je exprimováno v epiteliálních buňkách vledvina(21), původně jsme provedli qRT-PCR pro tyto epiteliální Klfs vledvinakortex sklizený 24 hodin po jedné dávce PT-specifického toxinu, AAI, versus vehikulum (dimethylsulfoxid [DMSO]) u myší C57BL/6. Klf4, Klf5 a Klf6 byly významně up-regulovány, zatímco Klf15 byly významně down-regulovány (obr. 1A), a tyto změny v genové expresi nastaly před významným vzestupem sérového kreatininu (obr. 1B). Abychom určili, zda je up-regulace Klf6 přechodná nebo prodloužená, aplikovali jsme AAI ve více injekcích 3 po sobě buď dvě injekce nebo 3 týdny (aktivní fáze) nebo 3 týdny, po nichž následovaly 3 týdny bez AAI (fáze remodelace) (obr. 1C) . PT zůstal neporušený 24 hodin po jedné injekci, ale po dvou injekcích PT buňky podstoupily buněčnou smrt a myši léčené více dávkami AAI prokázaly ztrátu PT, zánětlivé infiltráty, protein
sádry a fibróza na konci fáze remodelace (obr. 1D). Exprese Klf6 zůstala významně zvýšená v aktivní a remodelační fázi poranění (obr. 1E), což naznačuje roli KLF6 v průběhu akutní a fibrotické fáze poranění. KLF6 je exprimován v glomerulárních, tubulárních a zánětlivých buňkách a pro stanovení příspěvku PT-specifické exprese Klf6 k pozorovanému zvýšení renální kortikální exprese Klf6 jsme provedli sekvenování RNA (RNA-seq) v mikrodisekovaných segmentech S2/S3 PT 24 h po jedné injekci AAI, před ztrátou PT buněk. Klf6 byl vysoce up-regulován na úrovni srovnatelné s dobře známými transkripčními faktory časné odezvy Fos a Jun, což naznačuje, že časná indukce exprese Klf6 messenger RNA (mRNA) vledvinaje řízena jeho expresí v PT buňkách (obr. 1F). Tato zjištění jsou v souladu s nedávno publikovanými daty jednobuněčné/jaderné RNA-seq ukazující up-regulaci Klf6 v PT buňkách u zraněných myší a lidíledviny(22, 23). Konečně, dolování dat z expresních polí z dříve hlášených studií časového průběhu IRI (8) potvrdilo časnou indukci exprese KLF6 do 2 hodin od AKI, podobně jako u Fos a Jun (obr. 1G). Tato data naznačují, že Klf6 je časný indukovatelný gen odezvy na poranění po léčbě PT-specifickým toxinem AAI a po IRI a zůstává zvýšený navzdory zastavení AAI.
PT-specifická ztráta KLF6 zmírňuje poškození ledvin v aktivní fázi a fázi remodelace po léčbě AAI.Abychom určili příspěvek PT-specifického KLF6 k AAI-indukovanému poranění, vytvořili jsme myši s PT-specifickým knockdownem Klf6 (Klf6PTKD) křížením myší Klf6fl/fl (24) s myší Pepck-Cre (25). Klf6PTKD myši byly životaschopné a plodné, s významným knockdownem PT-specifické exprese proteinu KLF6, ale bez změny exprese Klf6 mRNA v játrech, ve srovnání s myší Klf6fl/fl (příloha SI, obr. S1 A–C). Nebyly v tom žádné zjevné rozdílyledvinahistologie nebo funkce mezi myšmi Klf6fl/fl a Klf6PTKD ve věku 24 týdnů (příloha SI, obr. S1 D a E) a úrovně exprese OAT 1 až 3 (Slc22a6, Slc22a7 a Slc22a8), cesta vstupu AAI PT, se významně nelišily (příloha SI, obr. S1F).
Kontrolní myši (Klf6fl/fl) a Klf6PTKD byly léčeny vehikulem (DMSO) nebo 3 mg/kg AAI intraperitoneálně každé 3 dny po dobu 3 týdnů a usmrceny 3 dny po poslední injekci AAI, aby se vyhodnotila aktivní fáze poranění nebo 3 týdny po poslední injekce AAI k posouzení fáze remodelace poranění (obr. 1C). Myši Klf6fl/fl a Klf6PTKD měly podobné množství aduktů AL-DNA jak po jedné injekci, tak na konci aktivní a remodelační fáze (příloha SI, obr. S1 G a H), což naznačuje podobné vychytávání AAI PT a opravu AL -DNA adukty u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD. Během injekcí myši, které dostávaly AAI, ztratily váhu ve srovnání s těmi, které dostávaly DMSO, s podobným snížením o ~18 procent od výchozí hodnoty u myší Klf6fl/fl i Klf6PTKD při poslední injekci AAI, po čemž následovalo opětovné získání podobného množství tělesné hmotnosti ( Příloha SI, obr. S2A).ledvinyhmotnosti vzhledem k počáteční (den 0) tělesné hmotnosti byly podobné u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD léčených DMSO a AAI na konci aktivní fáze (příloha SI, obr. S2B). Ve fázi přestavby,ledvinyz myší Klf6fl/fl léčených AAI vážily významně méně než myši z myší léčených DMSO, ale u myší Klf6PTKD léčených AAIledvinahmotnosti byly zachovány (příloha SI, obr. S2B).Funkce ledvinbyla hodnocena měřením koncentrací sérového kreatininu (obr. 2A) a močovinového dusíku (obr. 2B). Koncentrace sérového kreatininu i močovinového dusíku byly významně zvýšené u myší dostávajících AAI oproti DMSO; zvýšení však bylo významně menší u myší Klf6PTKD ve srovnání s myšmi Klf6fl/fl (obr. 2 A a B). Histologická analýza pomocí hematoxylinu a eosinu a Schiffova barvení kyselinou jodistou ukázala, že myši Klf6fl/fl i Klf6PTKD léčené AAI měly odlupující se tubuly se zbytkovými bazálními membránami, zánětlivé infiltráty, které byly převážně lokalizovány v
vnější kůra a mnohočetné proteinové odlitky v kůře i dřeni (obr. 2 C a D). Tyto rysy však byly méně závažné u myší Klf6PTKD ve srovnání s myšmi Klf6fl/fl, se zachováním tubulů a menšími zánětlivými infiltráty. Analýza oblasti PT byla provedena pomocí fluorescenčního barvení Lotus lektinem k identifikaci neporušených PT kartáčových lemů v plně diferencovaných PT buňkách a imunofluorescence pro cytokeratin-20 (KRT-20) k identifikaci zraněných PT (8). Ve srovnání s myšmi léčenými DMSO měly myši Klf6fl/fl i Klf6PTKD léčené AAI významnou ztrátu zralého PT, jak ukazuje ztráta barvení Lotus lektinem a indukce exprese KRT-20, což naznačuje poškození PT v obou aktivní a remodelační fáze (obr. 2E a příloha SI, obr. S2C). Myši Klf6PTKD léčené AAI měly významné zachování zralého PT ve srovnání s myšmi Klf6fl/fl, doprovázené podobnými hladinami indukce KRT- 20 v aktivní i remodelační fázi. Trichromové barvení fáze remodelaceledvinyukázaly rozsáhlé ukládání fibrotického materiálu u myší Klf6fl/fl, s významně menší fibrózou u myší Klf6PTKD (obr. 2F, modré barvení; příloha SI, tabulka S1). Depozice kolagenu I, složky fibrotické matrice, detekovaná pomocí imunofluorescence (obr. 2G a příloha SI, obr. S2D), ukázala, že kolagen I byl významně zvýšen u myší Klf6fl/fl s AAI, ale nikoli u myší Klf6PTKD s AAI ve srovnání s DMSO v roce aktivní fázi. Ve fázi remodelace byl kolagen I významně zvýšen u myší Klf6fl/fl a Klf6PTKD s AAI, s významně nižším procentem plochy u myší Klf6PTKD s AAI ve srovnání s myšmi Klf6fl/fl s AAI. Intersticiální zánětlivé buňky sestávající z CD68 plus makrofágů a GR-1 plus myeloidních monocytů byly přítomny v Klf6fl/fl
a Klf6PTKD myši léčené AAI, ale byly významně méně hojné u Klf6PTKD myší v aktivní i remodelační fázi (obr. 2H). Ztráta PT-specifického KLF6 tedy chrání před AAI-indukovaným poškozením PT, fibrózou a zánětem, navzdory přítomnosti podobných množství AL-DNA aduktů ve srovnání s kontrolními myšmi ošetřenými AAI. PT-specifická ztráta KLF6 snižuje zánětlivou signalizaci a zachovává buněčný metabolismus po léčbě AAI. Snažili jsme se pochopit mechanismy, kterými ztráta PT KLF6 chrání před zraněním, a proto jsme provedli RNA-seq.ledvinacortex in Klf6fl/fl and Klf6PTKD mice treated with DMSO or AAI in the active phase or remodeling phase. Significantly differentially expressed genes were defined as having a >1.5- nebo<0.67-fold change="" and="" false="" discovery="" rate="" of=""><0.05 in="" any="" given="" pairwise="" genotype="" or="" treatment="" comparison.="" a="" combined="" total="" of="" 7,673="" genes="" were="" found="" to="" be="" differentially="" expressed="" as="" a="" result="" of="" all="" the="" pairwise="" comparisons,="" and="" hierarchical="" clustering="" showed="" these="" to="" group="" into="" two="" main="" clusters:="" genes="" that="" were="" induced="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" and="" genes="" that="" were="" suppressed="" in="" response="" to="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3a="" and="" dataset="" s1).="" unbiased="" analysis="" of="" transcriptional="" effects="" of="" aai="" treatment="" in="" klf6fl/fl="" mice="" by="" undertaking="" pathway="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" the="" most="" significantly="" upregulated="" pathways="" were="" predominantly="" inflammatory="" and="" ecm/="" cell="" adhesion="" pathways="" (e.g.,="" cytokine/chemokine="" signaling)="" and="" integrin/focal="" adhesion="" pathways,="" respectively="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b="" and="" c).="" markers="" of="" cellular="" senescence,="" including="" components="" of="" the="" senescence-associated="" secretory="" phenotype,="" were="" also="" upregulated="" after="" aai="" treatment="" (si="" appendix,="" fig.="" s3d),="" but="" the="" overall="" pathway="" was="" not="" differentially="" expressed="" between="" klf6fl/fl="" and="" klf6ptkd="" mice.="" in="" general,="" these="" pathways="" were="" less="" significantly="" up-regulated="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase.="" the="" most="" significantly="" down-regulated="" pathways="" after="" aai="" were="" metabolic="" pathways,="" including="" fatty="" acid–="" and="" amino="" acid–related="" pathways;="" these="" pathways="" were="" similarly="" or="" slightly="" less="" significantly="" decreased="" in="" the="" remodeling="" phase="" compared="" to="" the="" active="" phase="" (si="" appendix,="" fig.="" s3="" b,="" e,="" and="" f).="" similar="" to="" other="" studies,="" genes="" encoding="" enzymes="" involved="" in="" anerobic="" glycolysis="" were="" up-regulated="" after="" aai="" (26,="" 27)="" (si="" appendix,="" fig.="">
Abychom určili dráhy potenciálně přímo a nepřímo regulované KLF6, dále jsme analyzovali odlišně exprimované geny jejich klasifikací na základě přítomnosti a umístění vazebných míst KLF6 pomocí dat KLF6 imunoprecipitačního sekvenování chromatinu (ChIP-Seq) z projektu Encyclopedia of DNA Elements . Geny třídy 2 byly definovány jako mající alespoň 1 vazebné místo KLF6 v rozmezí ±1 kb od místa počátku transkripce (TSS), geny třídy 1 jako mající alespoň 1 vazebné místo KLF6 mezi ±1 a 10 kb od TSS a geny třídy 0 jako bez vazebného místa KLF6 v rozmezí ±10 kb od TSS. Existovalo 538 genů, které byly jak up-regulovány u Klf6fl/fl myší, tak významně down-regulované u Klf6PTKD oproti Klf6fl/fl myším v aktivní fázi. Analýza obohacení dráhy těchto 538 genů ukázala, že dráhy související s vrozenou imunitou (např. TYROBP, fagozom a makrofágy) a související s buněčnou adhezí (např. integrin, fokální adheze) byly významně obohaceny (obr. 3A). Klasifikace genů podle vazebných míst KLF6 ukázala, že většina DEG (428/538) neměla vazebná místa KLF6 (třída 0), a analýza obohacení genů třídy 2 (72) a genů třídy 0 odděleně ukázaly, že význam těchto drah byl silně řízen geny třídy 0, což naznačuje, že nižší exprese těchto genů u myší Klf6PTKD byla pravděpodobně nepřímým účinkem menšího poškození PT v důsledku PT specifického knockdownu Klf6 (obr. 3A).
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL
Existovalo 388 genů, které byly jak down-regulované u Klf6fl/fl myší, tak významně zachované (up-regulované) u Klf6PTKD oproti Klf6fl/fl myším. Analýza obohacení dráhy ukázala, že tyto geny reprezentovaly metabolické dráhy, přičemž metabolismus aminokyselin a metabolismus mastných kyselin je prominentní (obr. 3B a příloha SI, obr. S4). Analýza obohacení genů třídy 2 (1{{1{19}}}}3) a genů třídy 0 (246) ukázala, že přestože pouze ~25 procent genů má vazebná místa KLF6 v rozmezí ±1 kb od TSS ( třída 2), tato podskupina genů byla hnací silou pro vysoce významné hodnoty P těchto drah. Je pozoruhodné, že metabolické dráhy specifických aminokyselin (Val, Leu a Ile [BCAA] a Gly, Ser a Thr) byly stejně významné, když byly analyzovány pouze geny třídy 2, což naznačuje potenciální přímou regulaci těchto drah pomocí KLF6 (obr. 3B) . Naproti tomu vysoký význam metabolických drah mastných kyselin a signální dráhy PPAR byly z velké části řízeny geny třídy 0, což naznačuje nepřímé zachování těchto drah v důsledku PT-specifického knockdownu Klf6. Analýza obohacení genové sady pro specifické metabolické dráhy Kjótské encyklopedie genů a genomů (KEGG) (degradace mastných kyselin, metabolismus aminokyselin, cyklus TCA a glykolýza) pomocí všech odlišně regulovaných genů potvrdila, že jsou významně upregulovány (zachovány) v Klf6PTKD versus Klf6fl/fl myši (obr. 3C).
Indukce KLF6 exacerbujePoranění ledvina potlačuje katabolické geny BCAA po léčbě AAI. Abychom určili, zda by nadměrná exprese KLF6 měla opačné účinky, použili jsme systém "tet-on" k vytvoření myšího modelu s doxycyklinem (DOX) indukovatelnou expresí lidského KLF6 (hKLF6OE; dvojitě transgenní CAG-rtTA,TRE-hKLF6 myši) (příloha SI, obr. S5A). Myši hKLF6OE měly silnou indukci exprese hKLF6 po suplementaci stravy s DOX po dobu 7 dnů bez významných rozdílů v expresi myšího Klf6 (příloha SI, obr. S5B) aledvinynevykazovaly zjevné histologické poškození nebo ztrátufunkce ledvinpo kontinuální léčbě DOX po dobu 15 týdnů (příloha SI, obr. S5 C a D) ve srovnání s kontrolními myšmi (TRE-hKLF6 s léčbou DOX). Aby se však zjistilo, zda indukce hKLF6 v PT exacerbovala AKI aledvinafibróza, hKLF6OE a kontrolní myši byly léčeny nižší dávkou 1 mg/kg AAI nebo DMSO každé 3 dny po dobu 2 týdnů s následnou eutanazií po 3 dalších dnech (aktivní fáze) nebo 2 dalších týdnech (remodelační fáze) (příloha SI, obr. S6A). Kontrolní a hKLF6OE myši, které dostávaly AAI, ztratily podobné množství tělesné hmotnosti (příloha SI, obr. S6B) aledvinahmotnosti byly u všech skupin podobné (příloha SI, obr. S6C). Myši hKLF6OE měly významně zvýšený sérový kreatinin a dusík močoviny ve srovnání s kontrolními myšmi po léčbě AAI v aktivní fázi (obr. 4 A a B). To bylo doprovázeno ztrátou zralého PT s vyšším podílem KRT-20–pozitivního PT, který byl u hKLF6OE myší v obou časových bodech exacerbován (obr. 4 C–E a dodatek SI, obr. S6D) a zvýšený fibróza v obou fázích (obr. 4F a SI příloha, obr. S6E). qRT-PCR analýza genů kódujících enzymy v metabolické dráze BCAA ukázala supresi genů BCAA po léčbě AAI u kontrolních myší a myší hKLF6OE s další supresí u myší hKLF6OE ve srovnání s kontrolními myšmi (obr. 4G). Kromě toho exprese několika genů BCAA byla také buď významně snížena (Hibch) nebo vykazovala trend k nižší expresi u hKLF6OE oproti kontrolním myším i bez léčby AAI (ošetřené DMSO) (obr. 4G). Tato data naznačují, že indukce hKLF6 u dospělých myší způsobujeledvinanáchylnější k AKI a eventuální fibróze s významnou dysregulací genů kódujících katabolismus BCAA.
Indukce KLF6 potlačuje katabolismus BCAA, což je důležitý substrát pro produkci ATP in vitro.Mitochondriální BCAA katabolismus může přispívat k oxidativní fosforylaci produkcí acetyl-CoA a sukcinyl-CoA (příloha SI, obr. S4B). Abychom zjistili, zda KLF6 reguluje BCAA a buněčný metabolismus in vitro, nejprve jsme hodnotili expresi metabolických genů BCAA v buňkách HK-2 s nadměrnou expresí KLF6 (KLF{6}}OE), s nebo bez léčby AAI. Stejně jako u myší hKLF6OE vedla nadměrná exprese KLF6 pouze v buňkách HK-2 k trendu suprese několika genů kódujících enzymy BCAA, zejména BCKDHB. Ošetření kontrolních buněk KLF6-Con 25 μM AAI po dobu 6 hodin významně potlačilo expresi několika enzymů a ty byly dále potlačeny v buňkách KLF6-OE ošetřených AAI (obr. 5A). Na
Obr. 3. Ztráta KLF6 potlačuje profibrotické dráhy a zachovává metabolické dráhy po léčbě AAI. (A) Klasifikace a analýza obohacení dráhy genů upregulovaných u myší Klf6fl/fl po AAI, ale významně méně upregulovaných u myší Klf6PTKD po AAI podle třídy vazebného místa: třída 2 s větším nebo rovným 1 vazebnému místu KLF6 v rámci ±1 kb TSS; třída 1 s větším nebo rovným 1 vazebnému místu KLF6 ve vzdálenosti ±1 až 10 kb od TSS; a třída 0 bez vazebného místa KLF6 v rozmezí ± 10 kb od TSS. (B) Klasifikace a analýza obohacení dráhy genů down-regulovaných u myší Klf6fl/fl po AAI, ale významně méně downregulovaných (tj. konzervovaných) u myší Klf6PTKD po AAI podle třídy vazebného místa: třída 2 s větší nebo rovnou 1 vazebné místo KLF6 v ±1 kb od TSS; třída 1 s větším nebo rovným 1 vazebnému místu KLF6 ve vzdálenosti ±1 až 10 kb od TSS; a třída 0 bez vazebného místa KLF6 v rozmezí ±10 kb od TSS. (C) Grafy analýzy obohacení genové sady s použitím všech odlišně exprimovaných genů pro degradaci KEGG mastných kyselin (FA DEGRAD), metabolismus aminokyselin (AA METAB) a cyklus TCA (KEGG_TCA).
určit, zda toto potlačení exprese genu BCAA v přítomnosti AAI vedlo ke změnám v katabolismu BCAA, jsme měřili intracelulární koncentrace BCAA. Po ošetření AAI vykazovaly buňky KLF{0}} Con pokles BCAA, konzistentní se zvýšeným katabolismem BCAA, potenciálně jako kompenzace ztráty oxidace FA (obr. 5B). Tento účinek se však ztratil v buňkách KLF6-OE, u kterých nedošlo po léčbě AAI ke snížení intracelulárních BCAA, což je v souladu se sníženou schopností katabolizovat BCAA (obr. 5B), a to korelovalo se sníženou produkcí mitochondriálního ATP ve srovnání s buňkami KLF6-Con ošetřenými AAI (obr. 5C).
Standardní média používaná k měření produkce ATP obsahují vysoké koncentrace glukózy (10 mM glukóza, 1 mM glutamin a 2 mM pyruvát) a abychom určili, zda by samotná exprese KLF6 mohla změnit použití různých zdrojů energie, provedli jsme testy rychlost spotřeby kyslíku (OCR) v energeticky omezených médiích (bezsérová média s 1 mM glukózou, bez glutaminu a bez pyruvátu). Buňky KLF6-OE měly snížený mitochondriální OCR (definovaný jako počáteční OCR mínus nemitochondriální OCR stanovený po podání rotenonu/antimycinu A), ale měly podobnou kompenzaci po blokování glykolýzy pomocí 2-deoxyglukózy (2-) DG) a podobné FAO (snížení OCR po blokaci FAO etomoxirem) (obr. 5 D a E). Vzhledem k tomu, že mitochondriální odpověď na ztrátu glykolýzy a OCR vyplývající z oxidace FA se u buněk KLF6-OE nezměnily, naznačuje to, že celková mitochondriální funkce nebyla ovlivněna, ale spíše neschopnost používat BCAA jako zdroj zodpovídají za základní snížení mitochondriálního OCR v těchto stavech s omezenou energií. Abychom určili, zda ztráta katabolismu BCAA povede ke snížení produkce mitochondriálního ATP, vytvořili jsme buňky HK-2 s knockdownem BCKDHB (příloha SI, obr. S7). BCKDHA a BCKDHB kódují dvě z podjednotek velkého proteinového komplexu rozvětvené ketokyselinové dehydrogenázy (BCKDH), která katalyzuje první ireverzibilní a rychlost omezující krok v katabolismu BCAA a je inhibována fosforylací BCKDH kinázou (BCKDK) (28). Aby se kontrolní BCKDHB-SCR a knockdown BCKDHB-sh buňky posunuly směrem k mitochondriální produkci ATP, byly před provedením testu rychlosti produkce ATP preinkubovány v 2-DG, aby se zablokovala glykolýza po dobu 1 hodiny. Knockdown BCKDHB vedlo k významnému snížení produkce ATP, což ukazuje, že BCAA se používají k tvorbě ATP u lidí.ledvinabuňky (obr. 5F). Naopak do
Obr. 4. U myší hKLF6OE došlo k exacerbaciporanění ledvins potlačením genů BCAA. (A a B) Koncentrace sérového kreatininu (A) a močovinového dusíku (B) u kontrolních a hKLF6OE myší léčených DMSO nebo AAI v aktivní fázi. n=4 až 9 na skupinu; $P < 0.05,="" $$p="">< 0.01,="" $$$p="">< 0.0{="" {26}}1="" versus="" stejný="" genotyp="" s="" dmso;="" **p="">< 0.01="" versus="" kontrola="" s="" aai;="" jednosměrná="" anova="" s="" korekcí="" sidak="" pro="" vícenásobné="" testování.="" (c="" a="" d)="" reprezentativní="" histologické="" obrazy="" barvené="" pomocí="" hematoxylinu="" a="" eosinu="" (c)="" a="" barviva="" s="" kyselinou="" jodovou="" schiff="" (d).="" žluté="" šipky:="" odlévající="" se="" tubuly;="" černé="" šipky:="" zbytky="" bazálních="" membrán;="" žluté="" hroty="" šípů:="" proteinové="" odlitky;="" a="" černé="" hroty="" šípů:="" zánětlivé="" infiltráty.="" (stupnice,="" 100="" μm.)="" (e)="" imunofluorescenční="" barvení="" na="" cytokeratin-20="" (krt-20)="" jako="" marker="" poraněného="" pt="" (červená)="" s="" kobarvením="" s="" lektinem="" lotus="" (ll="" )="" jako="" značka="" nezraněného="" pt="" (zelená).="" (měřítko,="" 250="" μm.)="" (f)="" imunofluorescenční="" barvení="" pro="" -sma="" (zelená)="" s="" kobarvením="" pro="" edu="" (purpurová).="" (sloupky,="" 100="" μm.)="" (g)="" mrna="" exprese="" genů="" bcaa="" u="" kontrolních="" a="" hklf6oe="" myší="" ošetřených="" dmso="" nebo="" aai="" v="" aktivní="" fázi.="" n="5" až="" 9="" na="" skupinu;="" $p="">< 0,01,="" $="" $="" p="">< 0,001="" versus="" kontrola="" s="" dmso;="" všechny="" hklf6oe="" s="" aai="" jsou="" p="">< 0,001="" oproti="" hklf6oe="" s="" dmso;="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" oproti="" kontrole="" se="" stejnou="" léčbou;="" vícenásobné="" t="" testy="" s="" korekcí="" míry="" falešného="" objevu="" pomocí="" dvoufázového="" step-up="" modelu="" benjaminiho,="" kreigera="" a="" yekutieliho.="" data="" jsou="" průměr="" ±="" sem,="" kde="" n="" označuje="" počet="" biologických="">
zvýšili katabolismus BCAA, ošetřili jsme buňky HK-2 BT2, který inhibuje BCKDK, čímž blokuje inhibiční fosforylaci BCKDH. Za podmínek s omezenou energií léčba BT2 zvýšila OCR v buňkách ošetřených DMSO, což bylo trvalé po inhibici glykolýzy a ne kvůli změně FAO nebo nemitochondriální OCR (obr. 5 G a H). Tato zjištění naznačují, že KLF6-zprostředkovaná suprese katabolismu BCAA snižuje mitochondriální produkci ATP, což by pravděpodobně zhoršilo poškození PT v prostředí buněčného stresu, ve kterém existují podobně energeticky omezené podmínky kvůli ohrožení FAO.
Exprese genu BCAA je u různých myší a lidí sníženaPoranění ledvin. Abychom určili, zda ke ztrátě exprese genu BCAA dochází před ztrátou PT a zvýšenými hladinami kreatininu u poranění vyvolaného AAI, provedli jsme qRT-PCR u myší C57BL/6 léčených jednou dávkou AAI a usmrcených po 24 hodinách. Bckdhb, Hibch a Mccc2 již byly v tomto časovém bodě významně down-regulovány, přičemž jiné geny (např. Acadm) vykazovaly silný trend směrem k down-regulaci (obr. 6A). Studovat expresi genu BCAA u jiných myšíporanění ledvinU myší léčených cisplatinou (obr. 6B) nebo vystavených UUO (obr. 6C) jsme provedli qRT-PCR. V obou modelech byla exprese Klf6 vysoce upregulovaná oproti vehikulu/kontrolám. U myší léčených cisplatinou bylo několik testovaných genů BCAA významně down-regulováno s trendem směrem k downregulaci ostatních genů (obr. 6B). U myší vystavených UUO byly všechny testované geny významně down-regulovány jak 3, tak 7 d po UUO (obr. 6C), což naznačuje, že down-regulace genů BCAA nastává brzy po poranění.
Obr. 5. Nadměrná exprese KLF6 potlačuje expresi genu BCAA, produkci ATP a využití BCAA in vitro. (A) Exprese metabolických genů KLF6 a BCAA v HK-2 buňkách stabilně exprimujících kontrolní (Con) nebo KLF6 overexpression (OE) plasmidy, ošetřené DMSO nebo AAI. n=4 na skupinu; *P < 0.05,="" **p="">< {{10}}.01,="" ***p="">< 0.{101}="" {21}}01="" versus="" con="" aai;="" $p="">< 0.{{3{{40}}}}5,="" $$p="">< 0,01,="" $$$p="">< 0,001="" oproti="" stejné="" buňce="" s="" dmso;="" dvoucestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekcí="" pro="" vícenásobné="" testování.="" (b)="" kvantifikace="" celkových="" bcaa="" v="" con="" a="" oe="" buňkách="" ošetřených="" dmso="" nebo="" aai.="" n="6" na="" skupinu;="" $p="">< 0,05="" versus="" con="" dmso;="" jednosměrná="" anova="" se="" sidakovou="" korekcí="" pro="" vícenásobné="" testování.="" (c)="" procentuální="" změna="" v="" rychlosti="" mitochondriální="" produkce="" atp="" v="" con="" a="" oe="" buňkách="" ošetřených="" aai="" oproti="" dmso.="" n="27" až="" 30="" na="" skupinu;="" *p="">< 0,05,="" ***p="">< 0,001="" versus="" dmso,="" $p="">< 0,05="" versus="" con="" aai;="" jednosměrná="" anova="" se="" sidakovou="" korekcí="" pro="" vícenásobné="" testování.="" (d)="" měření="" ocr="" pro="" buňky="" con="" a="" oe="" v="" omezeném="" médiu.="" tam,="" kde="" je="" to="" indikováno,="" byly="" přidány="" 2-dg,="" etomoxir="" (eto)="" a="" kombinace="" rotenonu/antimycinu="" a="" (rot).="" n="16" na="" skupinu.="" (e)="" kvantifikace="" bazálního="" mitochondriálního="" ocr="" (počáteční="" ocr="" mínus="" post-rot="" ocr),="" nemitochondriálního="" ocr="" (post-rot="" ocr)="" a="" změn="" v="" ocr="" po="" přidání="" 2-dg="" (mitochondriální="" kompenzace="" po="" 2-dg)="" a="" etomoxir="" (fao).="" n="16" na="" skupinu;="" **p="">< 0,01="" versus="" con;="" dvoucestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekcí="" pro="" vícenásobné="" testování.="" (f)="" mitochondriální="" rychlost="" produkce="" atp="" v="" buňkách="" bckdhb-scr="" a="" bckdhb-sh.="" n="14" na="" skupinu;="" **p="">< 0,05,="" nepárový="" t="" test.="" (g)="" ocr="" měření="" v="" hk-2="" buňkách="" v="" omezeném="" médiu="" v="" nepřítomnosti="" nebo="" přítomnosti="" bt2.="" kde="" bylo="" uvedeno,="" byly="" přidány="" 2-dg,="" eto="" a="" rot.="" (h)="" kvantifikace="" bazálního="" mitochondriálního="" ocr,="" nemitochondriálního="" ocr="" a="" změn="" v="" ocr="" po="" přidání="" 2-dg="" a="" etomoxiru="" v="" buňkách="" hk-2="" v="" nepřítomnosti="" nebo="" přítomnosti="" bt2.="" n="8" na="" skupinu;="" *p="">< 0,05="" versus="" žádný="" bt2;="" dvoucestná="" anova="" s="" tukeyho="" korekcí="" pro="" vícenásobné="" testování.="" data="" jsou="" průměr="" ±="" sem,="" kde="" n="" označuje="" počet="" biologických="">
Podobně dolování dat z dříve publikovaného expresního pole z tubulointersticiálního kompartmentu 36 lidských pacientů s CKD (hypertenzní a diabetickéonemocnění ledvin) ve srovnání s kontrolními pacienty (6) prokázali, že několik genů BCAA je downregulováno podobným způsobem jako u myší léčených AAI (obr. 6D). Pro další objasnění vztahu mezifunkce ledvin, exprese KLF6 a exprese genů BCAA v lidském CKD, jsme použili publikované expresní pole z tubu lointersticiálního kompartmentu série 164 pacientů s různýmionemocnění ledvin (29). Ranking of patients by eGFR showed a significant inverse correlation between eGFR and KLF6 expression and a significant positive correlation between eGFR and each BCAA gene expression, with significant inverse correlations also between KLF6 and each BCAA gene expression (Fig. 6E). Indeed, even individuals with only moderate decreases in eGFR (∼45 to 60 mL/min/1.73m2) had significantly increased expression of KLF6 and decreased BCAA gene expression compared to individuals with normal eGFR (>90 ml/min/1,73 m2) (P < 0,001="" pro="" všechny="" geny),="" což="" ukazuje,="" že="" tyto="" změny="" v="" genové="" expresi="" mohou="" nastat="" brzy="" ve="" vztahu="" k="" funkčním="" změnám.="" souhrnně="" tato="" data="" naznačují,="" že="" klf6-zprostředkovaná="" suprese="" genů="" kritických="" pro="" katabolismus="" bcaa="" může="" hrát="" zásadní="" roli="" při="">poranění ledvinv myších modelechledvinafibrózy, stejně jako u lidského CKD.
Diskuse
V této studii demonstrujeme in vivo roli PT-specifického KLF6 v podmínkáchporanění ledvin.KLF6 je silně a důsledně regulován na počátku PT v reakci naporanění ledvinJedná se však o maladaptivní odpověď, jak dokazuje ochranný účinek ztráty PT Klf6 po léčbě klinicky relevantním a vysoce PT-specifickým toxinem AAI. Kromě toho jsme prokázali potenciální význam dysregulovaného metabolismu BCAA u zraněného PT jako možného přispěvatele k AKI a následné fibróze. Ztráta Klf6 vedla k zachování exprese katabolického enzymu BCAA, přičemž několik genů kódujících tyto enzymy mělo vazebná místa KLF6 v těsné blízkosti jejich TSS, což naznačuje, že KLF6 může být supresorem transkripce katabolismu BCAA. Ačkoli bylo již dříve prokázáno, že jiný člen rodiny KLF, KLF15, reguluje expresi větvené aminotransferázy 2 (Bcat2) v kosterním svalu (30), regulace jiných enzymů BCAA nebyla publikována. Předpokládáme, že KLF6 působí tak, že potlačuje expresi více genů kódujících enzymy BCAA.
U neporaněných PT je exprese Klf6 nízká a variabilně exprimovaná v některých PT buňkách a ne v jiných. Rychlá a robustní up-regulace, ke které dochází po více typech poranění, naznačuje fyziologicky důležitou roli KLF6. U fibroblastů se nedávno ukázalo, že KLF6 je up-regulován v reakci na onkogenní i oxidační stres, což vede k buněčnému stárnutí, zatímco umlčení KLF6 vedlo k akumulaci markerů poškození DNA a genomové nestability (31). Fyziologická role KLF6 při poranění tedy může být indukce buněčného stárnutí, což umožňuje opravu poškození DNA, které může být důsledkem toxických nebo oxidativních/ischemických poškození. U poškozených PT buněk se však zdá, že druhým důsledkem up-regulace Klf6 je potlačení katabolismu BCAA, což je zvláště u PT buněk pravděpodobně škodlivé. Je zajímavé, že navzdory částečnému snížení PT-specifického Klf6 na začátku u myší Klf6PTKD to bylo stále schopno poskytnout jasný ochranný účinek po zranění. To má důležité terapeutické důsledky, protože to naznačuje, že pouze malá manipulace s hladinami nebo aktivitou KLF6 (např. použitím inhibitoru s malou molekulou) by mohla prokázat terapeutickou účinnost. Transkripční faktory jsou skutečně pravděpodobnější než jiné genové rodiny
v lidském genomu mít citlivost na dávkování (32). Podobně jedním omezením našeho myšího modelu indukovatelné nadměrné exprese KLF6 je to, že se nejedná o omezené PT buňky, a jako takové se budoucí studie budou muset zaměřit na použití buněčně specifického indukovatelného modelu k objasnění role KLF6 závislé na buněčném kontextu.
Již dříve jsme prokázali, že ztráta Klf6 v glomerulárních podocytech byla škodlivá při nastavení FSGS kvůli její roli v transkripční aktivaci syntézy cytochrom c oxidázy 2 (Sco2). Ztráta Klf6 u FSGS vedla k horší fibróze se zvýšenou aktivací vnitřní apoptotické dráhy (15). Dotazování dostupných jednobuněčných datových souborů RNA-seq ukazuje, že u zdravých myšíledviny,Klf6 je exprimován v mnohem větším podílu podocytů než PT buněk a na mnohem vyšší úrovni (odkaz 33; https://susztaklab.com/). KLF6 proto pravděpodobně hraje důležitější fyziologickou roli v normálních podocytech než PT buňkách, zatímco jiné známé mitochondriální hlavní regulátory (např. Ppara) jsou exprimovány mnohem více v PT buňkách než podocyty. Ztráta Klf6 v podocytech má tedy pravděpodobně škodlivější účinek než v PT buňkách. Kontrastní role KLF6 v různých typech buněk v rámciledvinaparalelně s předchozími zjištěními buněčně specifických účinků na srdce a játra. Knockdown Klf6 v srdečních myocytech u myší tedy zeslabil srdeční fibrózu po přetížení angiotensinem II, což naznačuje roli KLF6 v šíření fibrózy, ale knockdown Klf6 v srdečních myofibroblastech neměl žádný vliv na fibrózu (14). Naopak v játrech neměl knockdown Klf6 v myších hepatocytech žádný vliv na jaterní fibrózu po chronickém podávání CCl4, ale nadměrná exprese KLF6 v jaterních hvězdicových buňkách vedla ke snížení fibrózy, což naznačuje, že KLF6 je protektivní (13).
CISTANCHE ZLEPŠÍ BOLESTI LEDVIN/RENÁL
Ztráta FAO běhemporanění ledvinje nyní známo, že je důležitou událostí v patologiiporanění ledvina skutečně může přímo přispívat k fibróze. V nepřítomnosti FAO, která je hlavním zdrojem energie pro nezraněnou PT, mohou mít jiné potenciální zdroje energie větší význam. BCAA přispívají k cyklu TCA produkcí acetyl-CoA a sukcinyl-CoA. Nedávná studie ukázala, že nejen BCAA značené 13C přispívají k meziproduktům cyklu TCA vledvinaaleledvinaměli čtvrtou nejvyšší inkorporaci 13C do meziproduktů cyklu TCA z testovaných orgánů, po slinivce, svalech a bílé tukové tkáni (34), což naznačuje, že BCAA jsou potenciálně důležitým přispěvatelem do cyklu TCA. Nicméně význam katabolismu BCAA v přispívání k cyklu TCA, ať už u normálních nebo zraněnýchledviny, nebyl dříve prozkoumán. Například není známo, zda by ztráta samotného katabolismu PT BCAA způsobila změny v homeostáze a/nebo opravě PT, a tyto studie budou vyžadovat vytvoření nových myších modelů, jako jsou PT-specifické Bckdhb knockdown myši. V nastaveníledvinazranění, kdy je FAO silně potlačena, další potlačení
geny kódující metabolické enzymy BCAA mohou připravit tubulární buňky o důležitý alternativní potenciální zdroj energie. Je důležité poznamenat, že exprese genu BCAA byla snížena již 24 hodin po jediné injekci, před jakýmikoli změnami v sérovém kreatininu nebo ztrátě PT, což naznačuje, že tyto downregulace byly specifickým důsledkem poškození PT a nesouvisely se sníženou potřebou energie PT. ze snížené GFR a následného sníženého požadavku na absorpci rozpuštěné látky. Tyto dráhy byly zachovány u myší Klf6PTKD, které byly chráněny před zraněním a dále potlačeny u myší hKLF6OE, které měly horší zranění. Kromě toho buňky KLF6-OE snížily produkci mitochondriálního ATP po léčbě AAI ve srovnání s buňkami KLF6-Con a zatímco intracelulární BCAA byly u buněk KLF6-Con sníženy, což je v souladu s jejich katabolismem , tento pokles nebyl detekován u buněk KLF6-OE. Kromě toho knockdown BCKDHB v HK-2 buňkách vedl ke snížení mitochondriální produkce ATP. Zachovaná exprese genů BCAA u myší Klf6PTKD tedy může poskytnout ochranu před zraněním dodáním životně důležitých meziproduktů cyklu TCA v nastavení výrazně snížené oxidace FA. Budoucí studie využívající myši s genetickými manipulacemi katabolismu BCAA a/nebo léčbou BT2 by nám umožnily prozkoumat dynamiku mezi katabolismem BCAA a FAO vporanění ledvin.
Ukázali jsme, že ztráta exprese genů BCAA vede ke snížení mitochondriální respirace a produkce ATP, což představuje jeden mechanismus, kterým ztráta katabolismu BCAA může přispět kporanění ledvin. Alternativním mechanismem by mohla být akumulace BCAA, která může mít toxický účinek. Ve skutečnosti to bylo prokázáno v nastavení srdeční IRI. Bylo prokázáno, že akumulace BCAA v důsledku ztráty katabolismu inhibuje využití mitochondriálního pyruvátu posttranslačně inaktivací pyruvátdehydrogenázy, čímž odstraňuje další zdroj buněčné energie a zhoršuje poškození (35). To bylo zvráceno buď zvýšením katabolismu BCAA ošetřením myší BT2 nebo zvýšením metabolismu glukózy nadměrnou expresí GLUT1. Nedávná studie také ukázala exacerbaci srdeční IRI ztrátou katabolismu BCAA u diabetických myší. To bylo doprovázeno zvýšeným oxidačním stresem a opět bylo zvráceno reaktivací katabolismu BCAA (36). Je známo, že BCAA a zejména leucin aktivují signalizaci savčího cíle rapamycinového (mTOR) komplexu 1 (mTORC1). V myším modelu polycystikanemoc ledvin,ve kterých buňky obklopující cysty aktivují mTOR
signalizace, suplementace BCAA dále aktivovala signalizaci mTORC1, vedoucí ke zvýšené proliferaci (37). Transkripční profilování hepatocelulárních karcinomů odhalilo sníženou expresi genu BCAA, což vede k akumulaci BCAA v nádorové tkáni. To bylo spojeno se zvýšenou signalizací a proliferací mTORC1, která byla snížena omezením BCAA nebo léčbou BT2, a byla exacerbována u myší krmených dietou s vysokým obsahem BCAA (38). Pro funkci PT je nutná signalizace mTORC1 a studie využívající inhibitory mTOR vporanění ledvinukázaly protichůdné výsledky, pravděpodobně kvůli různým dávkovacím režimům, načasování léčby a modelům zranění [39–42]. Signalizace mTORC1 vede k řadě buněčných odpovědí, včetně buněčného růstu a proliferace, syntézy lipidů, mitochondriální syntézy a suprese autofagie (43). Je pravděpodobné, že buď nedostatečná nebo nadměrná aktivace signalizace mTORC1 by mohla být škodlivá a že pro správnou buněčnou funkci je nutná rovnováha. Například nadměrná aktivace signalizace mTORC1 při poranění PT může vést ke škodlivému potlačení autofagie, která je nutná pro odstranění poškozených mitochondrií, a ukázalo se, že je důležitá pro zotavení po PTzranění (39, 42, 44, 45). Akumulace leucinu tedy může mít škodlivou roliporanění ledvinnadměrnou aktivací signalizace mTORC1 a potlačením autofagie. Na závěr jsme ukázali, že robustní up-regulace Klf6, ke které dochází vporanění ledvinje škodlivý, při kterém ztráta PT-specifického Klf6 zachovala expresi genu BCAA a zeslabila AKI a případnou fibrózu. Naopak indukce KLF6 u myší potlačila expresi genu BCAA a způsobilaledvinanáchylné kporanění ledvin.Kromě toho mají geny kódující více enzymů BCAA vazebná místa KLF6, což naznačuje, že KLF6 může být transkripčním regulátorem katabolismu BCAA. Down regulace katabolismu BCAA in vitro nadměrnou expresí KLF6 a léčbou AAI, nebo knockdownem BCKDHB, vedlke snížení produkce mitochondriálního ATP. Dohromady tytoúdaje naznačují, že terapeutické cílení na zachováníKatabolismus BCAA může poskytnout alternativní mitochondriálnízdroj energie v nastaveníporanění ledvinve kterém FAOje snížena.
