Hepcidin/ferroportinová osa ledvin řídí reabsorpci železa a určuje velikost ledvin a systémového přetížení železem

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Goran Mohammad1, Athena Matakidou2, Peter A. Robbins1 a Samira Lakhal-Littleton1

KLÍČOVÁ SLOVA:ferroportin; hemochromatóza; hepcidin; žehlička; přetížení železem;ledvinovétubuly

Ferroportin (FPN) je jediný známý savčí protein exportující železo. Zprostředkovává uvolňování železa do oběhu z duodenálních enterocytů a slezinných retikuloendoteliálních makrofágů, příslušných míst vstřebávání a recyklace železa.1,2 Uvolňování železa zprostředkované FPN je antagonizováno hormonem hepcidinem, také známým jako hepcidinový antimikrobiální peptid (HAMP). Hepcidin, produkovaný primárně v játrech, se váže na FPN a indukuje internalizaci FPN, čímž omezuje uvolňování železa do oběhu a jeho dostupnost do periferních tkání.3,4 Osa HAMP/FPN tedy působí v místech absorpce a recyklace pro kontrolu homeostáze železa.

Ledviny jsou místem reabsorpce železa. Jak železo nevázané na transferin, tak železo vázané na transferin může procházet do glomerulárního fifiltrátu.5 Převážná většina tohoto železa je vychytávána zpět do tubulárního epitelu. Na tomto zpětném vychytávání se podílí několik transportérů, včetně multiligandového komplexu megalin-cubilinový receptor, transferinového receptoru 1, transportéru dvojmocného kovu 1, transportéru zinku ZIP8 a transportéru zinku ZIP14,5–10.

Jednou vledvinovéepitelželezo se zpětně vstřebává do oběhu. FPN je hojný vledvinaa byl zapojen do reabsorpce železa.11–14 Zůstává však neznámé, zda renální FPN podléhá za normálních fyziologických podmínek také regulaci endogenním HAMP, a pokud ano, zda je taková regulace důležitá pro systémovou a/nebo renální homeostázu železa.

K vyřešení těchto otázek jsme vytvořili nový model myši s indukovatelnouledvinovétrubička– specifický knock-in fpnC326Y, který kóduje HAMP-rezistentní protein FPNC326Y. Kromě toho, abychom potvrdili dříve uváděnou roli FPN při reabsorpci železa, vytvořili jsme také myší model s indukovatelnýmledvinovétrubička– specifická delece genu fpn. Naše výsledky ukazují, že endogenní HAMP přímo reguluje absorpci železa zprostředkovanou FPN a že tato regulace je důležitá pro obaledvinovéa systémovou homeostázu železa, zejména při nastavení nadměrné dostupnosti železa.

Tato studie je první, která využívá myši s renální specifickou ztrátou citlivosti na HAMP k formálnímu stanovenídůležitostzledvinovéOsa HAMP/FPN. Poskytuje nové poznatky o úloze reabsorpce železa při určování stupně renálního a extrarenálního přetížení železem při hemochromatóze.

METODY

Myši

Všechny postupy na zvířatech byly v souladu se zákonem UK Home Offifice Animals (Scientific Procedures) z roku 1986 a schváleny etickým kontrolním výborem divize lékařských věd University of Oxford.

Podmíněné alely fpnflfl a fpnC326Yflfl byly vytvořeny tak, jak bylo popsáno dříve.15,16

Myši nesoucí transgen Pax8.CreERT2þ byly darem od Dr. Atheny Matakidou, Cancer Research UK Cambridge Institute, University of Cambridge. Tyto myši byly vytvořeny tak, jak bylo popsáno dříve.17 Všechny myši byly na pozadí C57BL/6.

Diety

Pokud není uvedeno jinak, byla zvířatům podávána standardní potrava pro hlodavce obsahující 200 dílů na milion (ppm) železa. V experimentech s manipulací se železem byla myším po odstavení po dobu 3 let podávána dieta plná železa (5000-ppm železa; Teklad TD.140464) nebo odpovídající kontrolní dieta (200-ppm železa; Teklad TD.08713). měsíce.

Kvantifikace železa a indexy železa 

Hladiny železa a feritinu v séru byly stanoveny pomocí systému ABXPentra (Horiba Medical). Hodnoty hemoglobinu byly stanoveny pomocí mikrokyvet HemoCue Hb 201 Hemoglobin. Hladiny erytroferronu v séru byly měřeny enzymatickým imunosorbentním testem (Intrinsic Lifesciences). Stanovení celkového elementárního železa ve tkáních bylo provedeno pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem, jak bylo popsáno dříve.15,16,18 Kalibrace byla provedena pomocí procesu standardních přídavků, kde špičky 0 ng/g, 0,5 ng/ g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g a 100 ng/g železa bylo přidáno do replikátů vybraného vzorku. Externí standard železa (roztok standardů vysoké čistoty ICP-MS-68-A) byl zředěn a změřen, aby se potvrdila platnost kalibrace. Ke každému slepému pokusu, standardu a vzorku bylo také přidáno rhodium jako vnitřní standard v koncentraci 1 ng/g. Pro kvantifikaci železa v moči byla moč odebírána myším po dobu 24 hodin a podrobena hmotnostní spektrometrii s indukčně vázanou plazmou. Hladiny kreatininu ve stejných vzorcích byly měřeny pomocí kolorimetrické soupravy pro stanovení kreatininu (Abcam; ab65340) a hodnoty železa byly normalizovány na koncentraci kreatininu.

Imunohistochemie 

Fluorescenční imunologické barvení bylo provedeno ve formalínem fixovaných, parafifinem zalitých tkáňových řezech s použitím protilátky FPN (Novus Biologicals; NBP1-21502) v 1:100 a protilátky Pro-Hepcidin(AA 39-59) v 1:50 (Protibodies Online; ABIN350367). Specifity protilátek FPN a hepcidinu byly potvrzeny pomocí zvířat Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a zvířat Hamp–/– jako negativní kontroly (doplňkový obrázek S1). Markery renálních segmentů byly identifikovány pomocí protilátky aquaporin-1 v 1:200 (Biotechne; NB600- 749), protilátky aquaporin-2 v čase 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), nebo kalbindinová protilátka v 1:100 (Abcam; ab82812). Sekundárními protilátkami byly anti-králičí IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), anti-oslí IgG Cy3 (Abcam; ab6949) a anti-myší IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Sklíčka byla zobrazena pomocí mikroskopu FV1000 Olympus.

cistanche může chránitledvinafunkce

Western blotting

Tkáně byly bleskově zmraženy v tekutém dusíku, rozdrceny a poté lyžovány pomocí RIPA Lysis Buffer System (Santa Cruz; sc{0}}) podle pokynů výrobce. Tkáňové lyzáty byly vyčištěny centrifugací při 15 000g po dobu 10 minut při 4 °C. Koncentrace proteinu v lyzátech byla měřena pomocí BCA Protein Assay (Pierce; 23225) a normalizována na stejnou koncentraci pro každou šarži. Lyzáty byly poté zředěny neredukujícím vzorkovým pufrem Laemmli dodecylsulfát sodný a zahřívány na 95 °C po dobu 5 minut. Protein (30–50 mg) byl nanesen na gely Mini-PROTEAN TGX (Biorad; 4561096). Po elektroforéze byl protein přenesen na polyvinylidendiflfluoridovou membránu pomocí systému BioRad Translotter a membrány byly blokovány po dobu jedné hodiny v blokovacím pufru obsahujícím 5 procent hovězího sérového albuminu. Membrány byly poté obarveny přes noc při 4 °C králičí polyklonální anti-myší FPN protilátkou (NBP1-21502; Novus Biologicals) v poměru 1:1000 nebo anti-b-aktinovou protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Proteintech; HRP{{18} }) v 1:5000. Bloty byly vyvinuty pomocí ECL prime detection kit (RPN2232; VWR International). Intenzity signálů byly kvantifikovány pomocí ImageJ a byl vypočten poměr mezi FPN a b-aktinovými signály, aby se vytvořily normalizované intenzity.

Perlsovo barvivo vylepšené diaminobenzidinem (DAB).

Tkáňové řezy fixované ve formalínu a zalité v parafifinu byly deparafinizovány pomocí xylenu a poté rehydratovány v ethanolu. Sklíčka byla poté barvena po dobu 1 hodiny 1% ferrikyanidem draselným v 0,1 mol/l HCl pufru. Endogenní peroxidázová aktivita byla zhášena a pak byla sklíčka obarvena DAB chromogenovým substrátem a kontrastně barvena hematoxylinem. Byly vizualizovány pomocí standardního mikroskopu s jasným fifieldem.

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce

Genová exprese byla měřena pomocí testovacích sond Applied Biosystems TaqMangene pro expresní test pro Hamp a housekeeping gen bactin (Life Technologies). Hodnota prahového cyklu (CT) pro gen zájmu byla nejprve normalizována odečtením hodnoty CT pro b-aktin, aby se získala hodnota DCT. Hodnoty DCT testovaných vzorků byly dále normalizovány na průměr hodnot DCT pro kontrolní vzorky, aby se získaly hodnoty DDCT. Relativní hladiny genové exprese byly poté vypočteny jako 2–DDCT.

Statistika

Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. Párová srovnání byla provedena pomocí Studentova t testu. Vícenásobná srovnání byla provedena pomocí analýzy rozptylu. Post hoc testy používaly Bonferroniho korekci.

Obrázek 1|Osa hepcidin/ferroportin (FPN) v renálních tubulech řídí reabsorpci železa a je důležitá pro renální homeostázu železau myších samic. (A)Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení na FPN, aquaporin 1 (AQP1), aquaporin 2 (AQP2) a Calbindin (CalD) v ledvinách myší divokého typu. Pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Koncový panel, pruh ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (b) Western blot pro FPN vledvinysamic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreER T2+ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 týden po léčbě tamoxifenem. Kvantifikace intenzity signálu je zobrazena ve spodním panelu. (c) Western blot pro FPN v ledvinách samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden po léčbě tamoxifenem. Kvantifikace intenzity signálu je zobrazena ve spodním panelu. (d) Hladiny železa v ledvinách u žen a mužů FpnC326Y^flfl/^flfl,Pax8.CreERT2þ myši a FpnC326Yflfl/flfl kontroly 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (e) Reprezentativní obrazy Perlsova železného barviva zesíleného diaminobenzidinem (DAB) v renální kortikální oblasti odpovídajících zvířat 3 měsíce po indukci tamoxifenem. Pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. (f) Hladiny železa v ledvinách u samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po indukci tamoxifenem. (g) Reprezentativní snímky DAB-enhanced Perls železného barviva v renální kortikální oblasti odpovídajících zvířat 3 měsíce po indukci tamoxifenem. (pokračování)

Obrázek 1 |(Pokračování) Pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. (h) Hladiny železa v séru u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (i) Hladiny železa v séru u samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po indukci tamoxifenem. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" a="" ****p="">< 0,0001.="" b-act,="" b-actin;="" cont,="" control;="" dapi,="" 40,6-diamidino-2-fenylindol;="" ppm,="" části="" na="" milion.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="" adrese="">

VÝSLEDEK

Hepcidin/FPN osa v renálních tubulech řídí reabsorpci železa a je důležitá pro renální homeostázu železa u samic myší

Nejprve jsme se snažili stanovit přesné místo exprese FPN vledvina. Za tímto účelem jsme obarvili myší ledviny na FPN a segmentově specifické markery aquaporin 1 (marker proximálních stočených tubulů a tenké sestupné Henleyho členění), aquaporin 2 (marker sběrných kanálků a spojovacích tubulů) a kalbindin (marker distálních stočených tubulů a kortikálních spojovacích a sběrných kanálků). Zjistili jsme, že FPN je silně exprimován v kortexu, kolokalizuje se s aquaporinem 1 do proximálních stočených tubulů. Ve vnitřní dřeni bylo nějaké FPN, kolokalizované s aquaporinem 2 do medulárních sběrných kanálků. Nedošlo k žádné kolokalizaci FPN s kalbindinem (obrázek 1a; větší panel zobrazený na doplňkovém obrázku S2). Tyto výsledky potvrzují, že FPN je nejhojnější v kortikální oblasti v proximálních stočených tubulech.

K určení, zda je renální FPN regulována HAMP, jsme použili myši nesoucí Pax8.CreERT2þ knock-in transgen, který řídí tamoxifenem indukovatelnou expresi Cre rekombinázy pod kontrolou promotoru párového box genu 8 pax8 v proximálních a distálních tubulech a v sběrných kanálků.17 Zkřížili jsme myši Pax8.CreERT2þ s těmi, které obsahovaly podmíněnou knock-in flfloxovanou alelu FpnC326Y, která kóduje FPN rezistentní na hepcidin. Kromě toho, a abychom potvrdili dříve uváděnou roli renální FPN při reabsorpci železa, jsme křížili myši Pax8.CreERT2þ s myšmi s alelou Fpnflfl/flfl. Jeden týden po léčbě tamoxifenem k indukci transgenu Pax8.CreERT2 byly hladiny renální FPN zvýšeny u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ ve srovnání s kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (obrázek 1b), což dokazuje, že renální FPN podléhá regulaci endogenní HAMP za normálních fyziologických podmínek a navíc potvrzující účinnost transgenu Pax8.CreERT2þ. Naopak renální hladiny FPN byly sníženy u samic a samců myší Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ ve srovnání s kontrolami Fpnflfl/flfl, což dále potvrzuje účinnost transgenu Pax8.CreERT2þ (obrázek 1c). Specifičnost tohoto transgenu Pax8.CreERT2þ byla také potvrzena přítomností deleční alely (DFpn) vledvinaale ne v játrech nebo slezině myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ (doplňkový obrázek S2A).

Dále jsme se rozhodli zjistit, zda renální osa HAMP/FPN řídí reabsorpci železa. Za tímto účelem jsme měřili renální a sérové ​​hladiny železa 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. Zjistili jsme, že ledvinové železo

obsah byl nižší u samic FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ než u kontrolních samic FpnC326Yflfl/flfl ve všech časových bodech (obrázek 1d). Renální obsah železa u samců se nelišil podle genotypu (obrázek 1d). Perlovo železné barvivo vylepšené DAB také potvrdilo snížení hladin železa v proximálních tubulech žen FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (obrázek 1e; větší panel zobrazený na doplňkovém obrázku S2). Naopak jsme zjistili, že obsah železa v ledvinách byl od 1 měsíce vyšší u samic Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ než u kontrolních samic Fpnflfl/flfl (obrázek 1f). Renální obsah železa u samců se nelišil podle genotypu (obr. 1f). DAB-enhanced Perls železné barvivo také potvrdilo akumulaci železa v proximálních tubulech samic Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ (obrázek 1g; větší panel zobrazený na doplňkovém obrázku S2).

Hladiny železa v séru byly přechodně zvýšeny u samců i samic myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ ve srovnání s kontrolami FpnC326Yflfl/flfl v časovém bodě 1-měsíce (obrázek 1h). Naopak hladiny železa v séru byly sníženy u samic Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ ve srovnání s kontrolními samicemi Fpnflfl/flfl v časovém bodě 1-měsíce, zatímco u samců různých genotypů zůstaly srovnatelné ve všech časových bodech (obrázek 1i ). Obnovení hladin železa v séru na hladiny pozorované u kontrolních zvířat ve věku 3 měsíců nemohlo být přičítáno obnovení normálních renálních hladin FPN. Pax8.CreERT2þ-indukované změny v renálních hladinách FPN byly skutečně udržovány 3 měsíce po léčbě tamoxifenem (doplňkový obrázek S2B a C). Snížený obsah železa v ledvinách a zvýšené hladiny železa v séru u žen FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ ukazují, že reabsorpce železa v proximálních tubulech závislá na FPN podléhá za normálních fyziologických podmínek regulaci HAMP. Zvýšený obsah železa v ledvinách a snížené hladiny železa v séru u žen Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ potvrzují předchozí zjištění, že renální FPN přispívá k reabsorpci železa. Kromě toho se za normálních fyziologických podmínek zdá, že kontrola reabsorpce železa renální osou HAMP/FPN je důležitější u žen než u mužů, alespoň u kmene C57BL/6.

Cistanche může zlepšit funkci ledvin

Renální osa HAMP/FPN přispívá k normální systémové homeostáze železa za podmínek normální dostupnosti železa, ale není pro ni nezbytná.

Dále jsme se rozhodli určit příspěvek renální osy HAMP/FPN k systémové homeostáze železa. Zjistili jsme, že u žen FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ došlo k přechodnému zvýšení sérového feritinu (obrázek 2a), obsahu železa v játrech (obrázek 2b) a obsahu železa ve slezině (obrázek 2c) v 1-měsíčním časovém bodě, kdy ve srovnání s kontrolními samicemi FpnC326Yflfl/flfl. Jejich hladiny hemoglobinu zůstaly srovnatelné s hladinami u kontrol ve všech časových bodech (obrázek 2d). Žádný z těchto parametrů se nelišil mezi muži FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a jejich kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (obrázek 2a–d). Hladiny erytroferronu se nelišily podle genotypu (doplňkový obrázek 3A). Naopak jsme zjistili, že ženy Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ mají nižší hladiny sérového feritinu v 1- a 3-měsíčních časových bodech (obrázek 2e), nižší obsah železa v játrech v 3- a 6-měsíční časové body (obrázek 2f) a nižší obsah železa ve slezině v 1- a 3-měsíčních časových bodech (obrázek 2g), ve srovnání s kontrolními ženami Fpnflfl/flfl. Také u nich došlo k přechodnému a mírnému snížení hladin hemoglobinu v 3-měsíčním časovém bodě (obrázek 2h). Žádný z těchto parametrů se nelišil mezi samci Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a jejich kontrolami Fpnflfl/flfl (obrázek 2e–h). Hladiny erythroferronu se také nezměnily podle genotypu (doplňkový obrázek 3B). Tyto údaje společně ukazují, že za normálních fyziologických podmínek přispívá renální osa HAMP/FPN k systémovým hladinám železa, ale sama o sobě není nezbytná pro udržení normální systémové homeostázy železa.

Obrázek 2|Renální osa hepcidinový antimikrobiální peptid/ferroportin (FPN) přispívá, ale není pro normální systémhomeostázy železa za podmínek normální dostupnosti železa. (inzerát)Systémové indexy železa u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem, včetně (a) sérového feritinu, (b) obsahu železa v játrech (c) obsah železa ve slezině a (d) hemoglobin. (e–h) Systémové indexy železa u samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po indukci tamoxifenem, včetně (e) sérového feritinu, ( f) obsah železa v játrech, (g) obsah železa ve slezině a (h) hemoglobin. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" a="" ***p="">< 0,001.="" ppm,="" části="" na="">

Obrázek 3|Renální hepcidinový antimikrobiální peptid (HAMP)/ferroportin (FPN) osa určuje velikost renálního a systémového přetížení železem za podmínek nadměrné dostupnosti železa. (a–f)Extrarenální indexy železa u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl poskytovaly buď kontrolní stravu (200 dílů na milion [ppm]) nebo dietu s vysokým obsahem železa (5000 ppm) po dobu 3 měsíců. (pokračování)

Obrázek 3 |(Pokračování) Indexy zahrnují (a) sérové ​​železo, (b) sérový feritin, (c) obsah železa ve slezině, (d) obsah železa v srdci, (e) obsah železa v plicích a (f) obsah železa v játrech. (g) Renální obsah železa u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl poskytovaly buď kontrolní stravu (200 ppm) nebonabitý železemdieta (5000 ppm) po dobu 3 měsíců. (h,i) Reprezentativní snímky perlsového železa v játrech a ledvinové kritické oblasti odpovídajících zvířat zvýrazněné diaminobenzidinem (DAB). Pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. (j) Relativní exprese genu hamp v játrech odpovídajících zvířat. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001,="" *****p="">< 0,00001="" a="" ****p="">< 0,000001.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Renální osa HAMP/FPN určuje velikost renálního a systémového přetížení železem za podmínek nadměrné dostupnosti železa 

Dále jsme se rozhodli zjistit roli renální osy HAMP/FPN v situaci přetížení železem. Za tímto účelem byly zvířatům FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ a kontrolám FpnC326Yflfl/flfl indukována tamoxifenem a poté byla podávána buď kontrolní strava obsahující 200 ppm železa, nebo dieta plná železa, obsahující 5000 ppm železa po dobu 3 měsíců. . Zjistili jsme, že podávání železem nabité stravy zvýšilo obsah železa v séru, sérového feritinu a tkáňového železa u mužů a žen obou genotypů. Nicméně zvířata FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ měla větší zvýšení sérového železa (obrázek 3a), sérového feritinu (obrázek 3b) a obsahu železa ve slezině (obrázek 3c), srdci (obrázek 3d), plicích (obrázek 3e) a játra (obrázek 3f) než kontroly FpnC326Yflfl/flfl. Naproti tomu u nich došlo k nižšímu zvýšení obsahu železa v ledvinách (obrázek 3g). Rozdíly mezi genotypy ve stupni zatížení železem v proximálních tubulech a v játrech byly také patrné v barvení Perls železem zesíleným DAB (obrázek 3h a i; větší panely zobrazené na doplňkovém obrázku S4). V souladu s větším systémovým přetížením železem měla zvířata FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ také větší zvýšení exprese genu jaterního hampu ve srovnání s kontrolami FpnC326Yflfl/flfl (obrázek 3j). Hladiny hemoglobinu nebyly ovlivněny dietou ani genotypem a v souladu s tím zůstaly hladiny erythroferronu v séru také nezměněny (doplňkový obrázek 4A a B). Tato zjištění ukazují, že za podmínek nadměrné dostupnosti železa snižuje kontrola reabsorpce železa renální osou HAMP/FPN systémové přetížení železem a zároveň zvyšuje přetížení ledvin železem.

Renální osa HAMP/FPN určuje vzorec přetížení tkáně železem při hemochromatóze 

Dále jsme se rozhodli prozkoumat roli renální osy HAMP/FPN v kontextu dědičné hemochromatózy, genetického stavu přetížení železem způsobeného defekty v produkci hepcidinu nebo citlivosti na hepcidin.19 Za tímto účelem jsme použili myši generované in- dům ukrývající heterozygotní všudypřítomný knock-in alely fpnC326Y (Fpnwt/C326Y). Již dříve jsme prokázali, že u těchto myší se vyvine fenotyp přetížení železem charakteristický pro dědičnou hemochromatózu.15,18 Porovnali jsme strukturu tkánípřetížení železemu těchto myší s tím, který byl pozorován u myší divokého typu krmených stravou plnou železa od odstavení po dobu 3 měsíců. Jak myši Fpnwt/C326Y, tak myši divokého typu krmené stravou plnou železa měly

zvýšený obsah železa v játrech, srdci a plicích ve srovnání s jejich příslušnými kontrolami (obrázky 4a a b). Renální obsah železa u myší Fpnwt/C326Y byl normální ve věku 3 měsíců (obrázek 4a) a zvýšil se pouze o 32 procent ve srovnání s kontrolami ve věku 6 měsíců (doplňkový obrázek 5A). Naproti tomu zvířata divokého typu, jimž byla podávána strava s vysokým obsahem železa, měla 260procentní nárůst obsahu železa v ledvinách ve srovnání s těmi, kteří dostávali normální stravu (obrázek 4b). Relativní rozdíly v přetížení ledvin a jater železem mezi těmito 2 modely byly také patrné v DABenhanced Perls železném barvivu (obrázek 4c a d; větší panely jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S5). Velikost extrarenálního přetížení železem byla srovnatelná mezi 2 modely, zatímco velikost přetížení ledvin byla podstatně vyšší u zvířat divokého typu, kterým byla podávána strava plná železa, než u myší Fpnwt/C326Y (obrázek 4e). FPN byla zvýšena v kortexu u myší Fpnwt/C326Y i u myší divokého typu, které poskytovaly stravu nabitou železem (obrázek 4f a g; větší panely jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S5). Bližší zkoumání místa exprese FPN v proximálních tubulech odhalilo, že se zdá, že se lokalizuje intracelulárně i na bazolaterální membráně u myší Fpnwt/C326Y. Na rozdíl od toho se zdálo, že FPN se primárně lokalizuje do cytoplazmy, apikální membrány a jádro u myší překvapivě poskytovalo železem nabitou stravu (obrázek 4f a g, spodní panely). Vzor lokalizace FPN vyplývající z poskytování stravy nabité železem byl dále potvrzen pomocí zvířat Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ jako negativní kontroly (doplňkový obrázek S5B). Tato pozorování, spolu s předchozím zjištěním, že zvířata FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ mají nižší renální zatížení železem než kontroly po poskytnutínabitý železemdiety, prokázat, že ztráta účinku HAMP na renální FPN chráníledvinaod zatížení železem na pozadí hereditární hemochromatózy.

DISKUSE

Nejdůležitějším zjištěním této studie je, že endogenní HAMP řídí reabsorpci železa zprostředkovanou FPN. Předchozí studie uváděly regulaci FPN exogenním HAMP v kultivovaných ledvinových buňkách a inverzní vztah mezi hladinami HAMP a FPN vledvinapo unilaterální okluzi močovodu.12,13 Toto je však první důkaz, že taková regulace funguje in vivo za normálních fyziologických podmínek a způsobem, který ovlivňuje renální a systémovou homeostázu železa. Zvláštní silnou stránkou této studie je použití nových myší, vytvořených interně, k překrytí renálně specifické ztráty citlivosti na HAMP. Tento přístup umožňuje studium renální osy HAMP/FPN bez matoucích účinků změněné systémové homeostázy železa, které je jinak pozorováno na všudypřítomných zvířecích modelech.

Obrázek 4|Renální hepcidinový antimikrobiální peptid/ferroportin (FPN) určuje vzorec přetížení tkáně železem při hemochromatóze. (A)Hladiny železa v ledvinách, játrech, srdci a plicích zvířat Fpnwt/C326Y a kontrol Fpnwt/wt ve věku 3 měsíců. (b) Hladiny železa vledvina, játra, srdce a plíce u zvířat divokého typu poskytovaly buď kontrolní stravu (200 části na milion [ppm]) nebo dietu bohatou na železo (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) od odstavení po dobu 3 měsíců. (c) Reprezentativní obrazy Perlsova železného barviva zesíleného diaminobenzidinem (DAB) v ledvinové kůře a játrech zvířat Fpnwt/C326Y a kontrol Fpnwt/wt ve věku 3 měsíců. Tyč ¼ 200 mm, původní zvětšení10. (d) Reprezentativní snímky DAB-enhanced Perls železné skvrny v ledvinové kůře a játrech zvířat divokého typu poskytly buď kontrolní stravu (200 ppm) nebo dietu s vysokým obsahem železa (5000 ppm) od odstavení po dobu 3 měsíců. Sloupec ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. (e) Porovnání stupně zatížení tkáňovým železem mezi zvířaty Fpnwt/C326Y a zvířaty divokého typu krmenými stravou s vysokým obsahem železa. Hodnoty uvedené pro každé zvíře jsou normalizovány na průměr příslušné kontrolní skupiny. (f) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení FPN v renální kůře zvířat Fpnwt/C326Y a kontrol Fpnwt/wt ve věku 3 měsíců. Horní panel, pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Spodní panel, pruh ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (g) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení FPN v ledvinové kůře zvířat divokého typu poskytly buď kontrolní stravu (200 ppm) nebo dieta s vysokým obsahem železa (5000 ppm) od odstavení po dobu 3 měsíců. Horní panel, pruhy ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Spodní panel, pruh ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" a="" ****p="">< 0,0001.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Druhým důležitým zjištěním této studie je, že renální HAMP/FPN určuje velikost renálního i systémového přetížení železem (obrázek 5). Ztráta schopnosti reagovat na HAMP v renálních tubulech skutečně zvýšila rozsah přetížení jater, sleziny, srdce a plic železem a zároveň snížila rozsah přetížení ledvin železem po poskytování diety plné železa. V souladu s tím bylo pozorováno větší přetížení ledvin železem po podání železem nabité stravy zvířatům divokého typu (u nichž je renální osa HAMP/FPN neporušená) než u myší s hemochromatózou (u nichž je také renální osa HAMP/FPN narušený) (grafický abstrakt). Toto zjištění může vysvětlit klinické pozorování, želedvinanení běžně postižen u pacientů s hereditární hemochromatózou.19

Obrázek 5|Role osy renální hepcidin antimikrobiální peptid (HAMP)/ferroportin (FPN) v nastavení přetížení železem.Poskytování stravy bohaté na železo zvyšuje dostupnost železa v séru a hladiny železa v glomerulárním fifiltrátu a zvyšuje produkci a uvolňování hepcidinu (HAMP) játry. Zvýšená hladina HAMP v séru inhibuje reabsorpci železa blokováním FPN v renálních tubulech. Inhibice reabsorpce železa způsobuje renální retenci železa a zároveň snižuje systémovou dostupnost železa a následně snižuje přetížení jater železem. U myší FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ způsobuje ztráta citlivosti HAMP v renálních tubulech neregulovanou reabsorpci železa. To zase brání retenci železa v ledvinách a zároveň zvyšuje systémovou dostupnost železa a následně zvyšuje přetížení jater železem.

Ačkoli hemochromatóza i přetížení dietou železem zvýšily FPN v renálních tubulech, zdálo se, že mají za následek různé vzory lokalizace v apikálních, intracelulárních nebo bazolaterálních kompartmentech. Podobná pozorování byla provedena v duodenu krys, kde bylo zjištěno, že sondou obsahující železo se mění relativní distribuce FPN mezi těmito kompartmenty v duodenálních enterocytech. regulační proteiny železa) by působily na udržení vysoké celkové produkce FPN v renálních tubulárních buňkách, zatímco zvýšená hladina HAMP v séru by snížila podíl FPN, který se může lokalizovat na bazolaterální membráně. Z této interpretace vyplývá, že rozdíly mezi předchozími zprávami, pokud jde o lokalizaci FPN v proximálních tubulech, by mohly odrážet rozdíly v obsahu železa v renálních tubulárních tubulech a v hladinách hepcidinu v séru mezi zvířecími modely použitými v různých studiích.5,11–14,21 tato divergence by mohla odrážet míru nespecifické reaktivity uváděnou dříve v souvislosti s komerčními protilátkami proti FPN, včetně protilátky použité v této studii.14 Funkční význam apikální lokalizace FPN v renálních tubulech zůstává nejasný a nemohli jsme detekovat žádné změny ve vylučování železa močí u myší naložených železem (doplňkový obrázek 5C). Dalším zajímavým pozorováním je, že některé FPN se objevily lokalizované v jádře v renálních tubulech železem naplněných myší. Podobná pozorování byla provedena jinými v makrofázích naplněných železem a v krysích játrech. Poslední studie zjistila, že jaderná FPN se podílí na zadržování jaderného železa jako součást reakce akutní fáze.22,23 Podrobné studie subcelulární lokalizace FPN v různých stavech železa a v různých patologiích jsou potřebné k dalšímu pokroku v našem chápání role FPN v ledvinách.

Regulace a funkce renálního HAMP také nejsou zcela pochopeny. Zjistili jsme, že exprese genu hamp v ledvinách byla zvýšena u zvířat divokého typu po poskytnutí stravy nabité železem (doplňkový obrázek 5E), ale zůstala nezměněna u myší s hemochromatózou (doplňkový obrázek 5D) a u těch, které mají ledvinové tubuly – specifická ztráta FPN nebo renální tubuly – specifická ztráta schopnosti reagovat na HAMP (doplňkový obrázek S5F a G). Tyto výsledky nepodporují představu, že exprese genu renálního kýlu je regulována lokálně hladinami železa v ledvinách. Pokud jde o funkci renálního HAMP, předchozí studie na modelu unilaterální okluze močovodu naznačovala, že se podílí na kontrole renální FPN. Zjistili jsme, že renální HAMP (detekovaný pomocí protilátky proti pro-HAMP peptidu) se kolokalizoval s kalbindinem (marker distálních stočených tubulů a kortikálních sběrných kanálků a spojovacích kanálků) (doplňkový obrázek S5H). Na druhé straně se exprese FPN nelokalizuje s kalbindinem, a to ani u myší s renálně specifickou ztrátou reakce na HAMP (obrázek 1a a doplňkový obrázek S5I). Tyto výsledky nejsou v souladu s autokrinní úlohou renálního HAMP v regulaci renální FPN. Nicméně renální HAMP se může podílet na parakrinní regulaci renální FPN. V budoucnu by bylo zajímavé studovat parakrinní funkce renálního HAMP a kvantifikovat relativní příspěvky renálních a jaterních HAMP ke kontrole reabsorpce železa.

Dalším zajímavým pozorováním z této studie je, že za podmínek normální dostupnosti železa není renální osa HAMP/FPN nezbytná pro udržení normální systémové homeostázy železa a je naopak důležitější pro regulaci hladin železa v ledvinách, alespoň u samic myší kmen C57BL/6. Ačkoli pozorované změny hladin železa v ledvinách vyplývající ze ztráty FPN nebo reakce na HAMP v renálních tubulech byly trvalé, změny v systémových indexech železa byly přechodné povahy. Přechodná povaha systémových účinků naznačuje kompenzační mechanismus(y) zapojení. Jedním z možných kompenzačních mechanismů je modulace absorpce železa z potravy jaterním HAMP. Zjistili jsme, že u myší s renální specifickou ztrátou schopnosti reagovat na HAMP byla exprese genu jaterního hamp zvýšena po zvýšení hladin železa v séru v 1-měsíčním časovém bodě a zůstala zvýšená v pozdějších časových bodech. Naopak, exprese genu jaterního hamp byla potlačena u myší s renálně specifickou ztrátou FPN po poklesu hladin železa v séru v 1-měsíčním časovém bodě a zůstala potlačena v pozdějších časových bodech (doplňkový obrázek S6A a B). Kromě toho byla zvýšená exprese genu jaterního hamp v prvním nastavení doprovázena sníženými hladinami FPN ve střevě, zatímco snížená exprese genu jaterního hamp ve druhém nastavení byla doprovázena vyšší FPN ve střevě (doplňkový obrázek S6C a D). Tyto výsledky naznačují, že působení HAMP v játrech na absorpci železa z potravy je aktivním kompenzačním mechanismem zapojeným do udržování normální systémové homeostázy železa tváří v tvář narušené renální reabsorpci železa.

Cistanche může opravit funkci ledvin

Je třeba poznamenat, že za podmínek normální dostupnosti železa se zdá, že renální osa HAMP/FPN je důležitější u samic myší než u myších samců, alespoň u kmene C57BL/6. Toto pozorování nelze připsat rozdílům mezi muži a ženami v aktivitě transgenu Pax8.CreERT2þ. Sexuální dimorfismus v úrovních a vzorcích přenašečů podél nefronu byl u tohoto myšího kmene již dříve hlášen.24 V souladu s tím jsme zjistili vyšší bazální expresi FPN vledvinysamic než v ledvinách samců ze stejného vrhu (doplňkový obrázek S2D). Předchozí studie používající jiný transgen rekombinázy Cre, řízený konstitutivně aktivním promotorem Nestin k odstranění fpn v celém nefronu, také zaznamenala zvýšení hladin železa v ledvinách a snížení zásob železa v séru a v játrech. Tato studie však byla provedena u jiného kmene myší (129/SvEvTac) a neanalyzovala fenotyp podle pohlaví nebo časového průběhu.14

hemochromatóza a další poruchy železa.

ZVEŘEJNĚNÍ

Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

SL-L byl příjemcem stipendia British Heart Foundation Intermediate Basic Science Postdoctoral Fellowship (FS/12/63/29895). GM byl financován aProjekt Kidney Research UKgrant (RP_020_20160303) udělený SL-L.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

SL-L koncipovaná studie. SL-L a GM provedly experimenty. SL-L analyzoval a interpretoval výsledky. SL-L napsal rukopis. AM přispěl materiály. PAR komentoval rukopis.

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF)

Obrázek S1. Potvrzení specifičnosti protilátek FPN a HAMP. (A) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení FPN v renální kůře zvířat Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl ve věku 3 měsíců. Horní panely, sloupec ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Spodní panely, sloupec ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (B) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení HAMP v renální kůře zvířat Hamp–/– a kontrol divokého typu na 3 měsíce věku. Horní panely, lišta ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Spodní panely, lišta ¼ 25 mm, původní zvětšení 60.

Obrázek S2. Potvrzení aktivity a specifičnosti Pax8.CreERT2þ. (A) Genotypizace myší Fpnflfl/flfl a Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ pomocí genomové DNA extrahované z jater, sleziny aledvina1 týden po indukci tamoxifenem. (B) Western blot pro FPN inledvinysamic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Y 3 měsíce po léčbě tamoxifenem. Kvantifikace intenzity signálu zobrazená na spodním panelu. (C) Western blot pro FPN v ledvinách samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 3 měsíce po léčbě tamoxifenem. Kvantifikace intenzity signálu zobrazená na spodním panelu. (D) Western blot pro FPN v ledvinách samic divokého typu a samců sourozenců ve věku 3 měsíců. Kvantifikace intenzity signálu zobrazená na spodním panelu. (E–G) Větší verze panelů na obrázku 1a, g, resp. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0.05,="" ***p=""><>

Obrázek S3. Hladiny erytroferronu v séru se u myší FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ a Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2 nemění. (A) Hladiny erythroferronu v séru u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (B) Hladiny erythroferronu v séru u samic a samců myší Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po indukci tamoxifenem. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM.

Obrázek S4. Hladiny hemoglobinu a erytroferronu v séru nejsou změněny u FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ krmených dietou plnou železa. (A) Hladiny hemoglobinu u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl krmených buď kontrolní dietou (obsahující 200 ppm železa) nebo dietou plnou železa (obsahující 5000 ppm železa) po 3 měsících od odstavení . (B) Hladiny erythroferronu v séru u samic a samců myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl krmených buď kontrolní dietou (obsahující 200 ppm železa) nebodieta plná železa(obsahující 5000 ppm železa) od odstavení po dobu 3 měsíců. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. (C,D) Větší verze panelů na obrázku 3h ai.

Obrázek S5. Manipulace se železem v ledvinách a exprese ledvinových hrbolků v různých myších modelech. (A) Hladiny železa v ledvinách u Fpnwt/C326Y zvířat a Fpnwt/wt kontrol ve věku 6 měsíců. (B) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení FPN a AQP1 v renální kůře zvířat Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl krmených železem nabitou stravou obsahující 5000 ppm od odstavení po dobu 3 měsíců. Pruh ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (C) Hladiny železa v moči (normalizované na kreatinin v moči) u zvířat divokého typu krmených stravou plnou železa obsahující 5000 ppm železa nebo kontrolní dietou obsahující 200 ppm železa od odstavení po dobu 3 měsíců. (D) Genová exprese ledvinových hampů u zvířat Fpnwt/C326Y a kontrol Fpnwt/wt ve věku 3 měsíců. (E) Genová exprese ledvinového hamp u zvířat divokého typu krmených železem nabitou stravou obsahující 5000 ppm železa nebo kontrolní stravou obsahující 200 ppm železa od odstavení po dobu 3 měsíců. (F) Renální exprese genu hamp u samic a samců myší FpnC326Yflflflfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflflflfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (G) Genová exprese ledvinového hamp u samic a samců myší Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po indukci tamoxifenem. (H) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení HAMP a CalD v ledvinové kůře zvířat divokého typu ve věku 3 měsíců. Sloupec ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (I) Reprezentativní snímky imunofluorescenčního barvení FPN a CalD v renální kůře zvířat FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ ve věku 1 měsíce. Pruh ¼ 25 mm, původní zvětšení 60. (J–M) Větší verze panelů na obrázku 4c, d, f, resp. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P <>

Obrázek S6. Exprese genu jaterního hampu a hladiny FPN ve střevě jsou změněny u myší s knokautem fpn specifickým pro renální tubuly au myší s knock-inem fpnC326Y specifickým pro renální tubuly. (A) Relativní exprese hamp mRNA v játrech samic myší FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (B) Relativní exprese hamp mRNA v játrech samic myší Fpnflflflfl,Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 týden, 1 měsíc, 3 měsíce a 6 měsíců po léčbě tamoxifenem. (C) Reprezentativní snímky imunobarvení FPN ve střevě samic myší FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ a kontrol FpnC326Yflfl/flfl 1 měsíc po léčbě tamoxifenem. Pruh ¼ 200 mm, původní zvětšení10. (D) Reprezentativní snímky imunobarvení FPN ve střevě samic myší Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ a kontrol Fpnflfl/flfl 1 měsíc po léčbě tamoxifenem. Pruh ¼ 200 mm, původní zvětšení 10. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" a=""><>

Cistanche může zmírnit infekci ledvin

REFERENCE

1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL, et al. Exportér železa ferroportin/slc40a1 je nezbytný pro homeostázu železa. Cell Metab. 2005;1:191–200.

2. Ganz T. Buněčné železo: ferroportin je jediná cesta ven. Cell Metab. 2005;1:155–157.

3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J, et al. Hepcidin reguluje efflux buněčného železa vazbou na ferroportin a indukcí jeho internalizace. Věda. 2004;306:2090–2093.

4. Qiao B, Sugianto P, Fung E a kol. Hepcidinem indukovaná endocytóza ferroportinu je závislá na ubikvitinaci ferroportinu. Cell Metab. 2012;15:918–924.

5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R, et al. In vivo charakterizace renálního transportu železa u anestetizovaných potkanů. J Physiol. 2000;524:581–586.

6. Christensen I, Birn H, Storm T, a kol. Endocytární receptory v renálním proximálním tubulu. Fyziologie. 2012;27:223–236.

7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Renální metabolismus železa: dodávka železa transferinu a role regulačních proteinů železa. J Am Soc Nephrol. 2007;18:401–406.

8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Buněčná a subcelulární lokalizace přenašeče železa Nramp2 ve střevním kartáčovém lemu a regulace železem z potravy. Krev. 1999;93: 4406–4417.

9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S, et al. ZIP8 je transportér železa a zinku, jehož exprese na buněčném povrchu je up-regulována buněčným železem. J Biol Chem. 2012;287:34032–34043.

10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Metabolismus železa v patogenezi železem indukovaného poškození ledvin. Nat Rev Nephrol. 2013;9:385–398.

11. Wolff N, Liu W, Fenton R, a kol. Ferroportin 1 je exprimován bazolaterálně v buňkách proximálního tubulu krysích ledvin a nadbytek železa zvyšuje jeho membránový přenos. J Cell Mol Med. 2011;15:209–219.

12. Pan S, Qian ZM, Cui S, a kol. Lokální hepcidin zvýšil intracelulární přetížení železem prostřednictvím degradace ferroportinu v ledvinách. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:322–327.

13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C, et al. Hepcidin reguluje intrarenální manipulaci se železem na distálním nefronu. Kidney Int. 2013;84:756–766.

14. Wang X, Zheng X, Zhang J a kol. Fyziologické funkce feroportinu v regulaci renální recyklace železa a ischemickém akutním poškození ledvin. Am J Physiol Renální Physiol. 2018;315:F1042–F1057.

15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ, et al. Zásadní buněčná autonomní role hepcidinu v srdeční homeostáze železa. Elife. 2016;5: e19804.

16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Srdeční ferroportin reguluje buněčnou homeostázu železa a je důležitý pro srdeční funkci. Proč Natl Acad Sci USA A. 2015;112:3164–3169.

17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K a kol. Generování a charakterizace transgenní linie Pax8-CreERT2 a knock-in linie Slc22a6-CreERT2 pro indukovatelnou a specifickou genetickou manipulaci renálních tubulárních epiteliálních buněk. PLoS One. 2016;11:e0148055.

18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frize M, et al. Intracelulární nedostatek železa v buňkách hladkého svalstva plicních tepen indukuje u myší plicní arteriální hypertenzi. Proč Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122– 13130.

19. Camaschella C. Pochopení homeostázy železa prostřednictvím genetické analýzy hemochromatózy a souvisejících poruch. Krev. 2005;106: 3710–3717.

20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A, et al. Přísun železa určuje apikální/bazolaterální membránovou distribuci střevních transportérů železa DMT1 a ferroportinu 1. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C477–C485.

21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Role ledvin v homeostáze železa: renální exprese prohepcdinu, ferroportinu a DMT1 u anemických myší. Am J Physiol Renální Physiol. 2008;295:F1213–F1221.

22. Naz N, Malik I, Sheikh N, et al. Ferroportin-1 je "nukleární" negativní protein akutní fáze v játrech potkana: srovnání s jinými proteiny transportujícími železo. Lab Invest. 2012;92:842–856.

23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Zátěž železem zvyšuje hladiny heterogenní jaderné RNA a mRNA ferroportinu v myších makrofázích J774. J Nutr. 2009;139:434–438.

24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J, et al. Sexuální dimorfní vzor renálních transportérů a homeostázy elektrolytů. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 3504–3517.