Karnovského fixativ zabraňuje artefaktům objevujícím se jako vakuolizace pocházející ze zpracování tkání v ledvinách ošetřených antisense oligonukleotidem Ⅱ

Makroskopicky nebyly pozorovány žádné abnormální změny. Navíc v chemii krve nevykazovaly renální parametry (tj. BUN a CRE) žádné významné změny v žádné skupině (tabulka 1).

Doplněk Cistanche Doplněk na podporu funkce ledvin PhGs75% Ech 30% Act 12%

Souhrn histopatologických nálezů v ledvinách fixovaných 10% NBF je uveden v tabulce 2. Mikroskopicky byla v obou ASO-1W pozorována bazofilní granula a vakuoly v proximálních tubulech, zejména v segmentech S1 a S2 a ASO-2W skupiny pro ledviny fixované 10% NBF (obr. 1A). Tyto změny byly závažnější ve skupině ASO-2W než ve skupině ASO-1W. Akumulace bazofilních granulí byla pozorována převážně na kartáčovém lemu proximálních tubulů jako agregáty a/nebo tečkovité struktury. Protože se uvádí, že bazofilní granule jsou přítomny jak v endozomech nebo lysozomech, tak volně v cytoplazmě proximálního tubulárního epitelu14, mohou tyto různé formy odrážet jejich akumulovanou plochu; to znamená, že agregáty a přerušované struktury se mohou akumulovat v lysozomech, respektive v cytoplazmě. Vakuoly v proximálních tubulech byly kulatého a drsného tvaru a většina z nich byla srostlá se sousedními vakuolami. Navíc některé vakuoly obsahovaly slabé bazofilní granule (obr. 1E), což naznačuje, že vakuoly byly relevantní pro akumulaci ASO. Imunohistochemicky byla LAMP-2 pozitivní na membránovém povrchu vakuol (obr. 1G a 1H). Výsledky ukázaly, že vakuolizací byla dilatace lysozomů. Rozdíl v závažnosti vakuolizace mezi skupinami ASO-1W a ASO-2W může naznačovat rozdíl v počtu ASO nahromaděných v lysozomech. Předpokládáme, že množství ASO nahromaděných v lysozomech se zvyšuje s rostoucí dobou expozice ASO. V důsledku toho se lysozomální expanze jevila jako vakuolizace v důsledku zpracování tkáně.

Tabulka 1. Údaje o chemii krve

Tabulka 2. Histopatologické nálezy v ledvinách fixovaných 10% N

Ačkoli byla pozorována střední vakuolizace, proximální tubulární degenerace nebyla evidentní a většina vakuolizovaných epitelů byla negativní na KIM-1 v imunohistochemickém barvení (obr. 1D). Naproti tomu u vzorků fixovaných v Karnovského fixativu vakuoly v proximálních tubulech chyběly u všech jedinců, zatímco bazofilní granule byly často pozorovány (obr. 1B). Bazofilní granule byly výraznější než ty ve vzorcích podrobených 10% fixaci NBF, protože buněčná struktura byla dobře zachována (obr. 1F). Ve vzorcích podrobených fixaci 4% PFA byly pozorovány vakuoly a bazofilní granule; závažnost vakuolizace však byla mírně nižší než u vzorků podrobených 10% fixaci NBF (obr. 1C).

Oligonukleotidy jsou molekuly vysoce rozpustné ve vodě a jsou extrahovány z tkání během zpracování kvůli selhání úplného zesíťování buněčných složek.

Na základě těchto výsledků jsme dospěli k závěru, že vakuoly v proximálních tubulech byly ovlivněny fixační metodou a že morfologické změny pozorované u tkání vystavených fixaci 10% NBF a 4% PFA mohou být artefakty v oblasti akumulace ASO během zpracování tkáně. Jinými slovy, vakuolizace může být toxikologicky nevýznamná, protože nebyla pozorována žádná tubulární degenerace, zvýšená exprese KIM-1 nebo abnormální změny renálních parametrů. Proto navrhujeme použít Karnovského fixativa jako volitelnou fixační metodu pro přesné patologické vyšetření ledviny u zvířat léčených ASO.

Závěrem lze říci, že naše současné poznatky odhalily možné nadhodnocení vakuolizace při použití konvenční fixační metody NBF. Karnovského fixativum může být užitečným nástrojem pro odlišení umělých vakuol od skutečné nefrotoxicity.

Obr. 1. Reprezentativní mikrofotografie ledvin ošetřených antisense oligonukleotidem (ASO). Histopatologické změny v 2-týdenní uzamčené nukleové kyselině obsahující antisense oligonukleotid (LNA-ASO) ošetřené skupině (ASO-2W) pro ledviny fixované (A) 10% neutrálním pufrovaným formaldehydovým roztokem (NBF), ( B) Karnovského fixativ nebo (C) 4% paraformaldehyd fosfátový pufr (PFA). (D) Imunohistochemické barvení molekuly poškození ledvin-1 (KIM-1) ​​ASO-2W pro ledviny fixované 10% NBF.Histopatologické změny ve skupině léčené 1-týden LNA-ASO (ASO-1W) pro ledviny fixované (E) 10% NBF a (F) Karnovského fixativem. Imunohistochemické barvení na lysozomálně asociovaný membránový protein 2 (LAMP-2) z (G) ASO-1W a (H) ASO-2W pro ledviny fixované 10% NBF. (A) Basofilní granule (černé šipky) a vakuoly (černé šipky) jsou pozorovány v proximálních tubulech. Barvení hematoxylinem a eosinem (H&E). Pruh=20 μm. (B) Vakuoly nejsou pozorovány, ale bazofilní granule (černé šipky) jsou pozorovány. H&E barvení. Pruh=20 μm. (C) Jsou pozorovány bazofilní granule (černé šipky) a vakuoly (černé šipky). Závažnost vakuolizace však byla nižší než u vzorků podrobených 10% fixaci NBF. H&E barvení. Pruh=20 μm. (D) Většina vakuolizovaných proximálních tubulů je na KIM negativní-1. Pruh=20 μm. (E, F) Některé vakuoly pozorované v proximálních tubulech obsahovaly slabě bazofilní granule (zelené šipky). Bazofilní granule jsou jasně pozorovány a buněčná struktura je zachována (zelené šipky). H&E barvení. Pruhy=20 μm. (G, H) Povrch membrány vakuol je pozitivní pro LAMP-2 (modré šipky). Tyče=20 mm.

Zveřejnění potenciálních střetů zájmů: Autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.

Poděkování: Autoři jsou vděční Keisuke Yoshikawovi a Tetsuya Ohta za jejich laskavé rady.

Reference

1. Rinaldi C a Wood MJA. Antisense oligonukleotidy: další hranice pro léčbu neurologických poruch. Nat Rev Neurol. 14: 9–21. 2018. [Medline] [CrossRef]

2. Uemura Y a Kobayashi K. Cílení na myší alveolární makrofágy intratracheálním podáním uzamčené nukleové kyseliny obsahující antisense oligonukleotidy. Drug Deliv. 26: 803–811. 2019. [Medline] [CrossRef]

3. Bennett CF. Terapeutické antisense oligonukleotidy dospívají. Annu Rev Med. 70: 307-321. 2019. [Medline] [CrossRef]

4. Frazier KS. Antisense oligonukleotidové terapie: příslib a výzvy z pohledu toxikologického patologa. Toxicol Pathol. 43: 78–89. 2015. [Medline] [CrossRef]

5. Engelhardt JA. Srovnávací renální toxikopatologie antisense oligonukleotidů. Nucleic Acid Ther. 26: 199–209. 2016. [Medline] [CrossRef]

6. Frazier KS, Sobry C, Derr V, Adams MJ, Besten CD, De Kimpe S, Francis I, Gales TL, Haworth R, Maguire SR, Mirabile RC, Mullins D, Palate B, Doorten YPS, Ridings JE, Scicchitano MS , Silvano J a Woodfine J. Druhově specifické zánětlivé reakce jako primární složka pro rozvoj glomerulárních lézí u myší a opic po chronickém podávání antisense oligonukleotidu druhé generace. Toxicol Pathol. 42: 923–935. 2014. [Medline] [CrossRef]

7. Sewing S, Gubler M, Gérard R, Avignon B, Mueller Y, Braendli-Baiocco A, Odin M a Moisan A. GalNAc konjugace zeslabuje cytotoxicitu antisense oligonukleotidových léčiv v renálních tubulárních buňkách. Mol Ther nukleové kyseliny. 14: 67–79. 2019. [Medline] [CrossRef]

8. Kakiuchi-Kiyota S, Koza-Taylor PH, Mantena SR, Nelms LF, Enayetallah AE, Hollingshead BD, Burdick AD, Reed LA, Warneke JA, Whiteley LO, Ryan AM a Mathialagan N. Porovnání profilů jaterní transkripce uzamčených antisense oligonukleotidy ribonukleové kyseliny: důkaz odlišných drah přispívajících k necílově zprostředkované toxicitě u myší. Toxicol Sci. 138: 234–248. 2014. [Medline] [CrossRef]

9. Hagedorn PH, Yakimov V, Ottosen S, Kammler S, Nielsen NF, Høg AM, Hedtjärn M, Meldgaard M, Møller MR, Ørum H, Koch T a Lindow M. Hepatotoxický potenciál terapeutických oligonukleotidů lze předpovědět z jejich sekvence a modifikační vzor. Nucleic Acid Ther. 23: 302–310. 2013. [Medline] [CrossRef]