Zkoumání vlivu hypertyreózy na stres endoplazmatického retikula a potenciál přechodného receptoru Kanonický 1 kanál v ledvinách

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT^1,*,Erhan ŞAHİN², Sedat KAÇAR², Rıdvan BAĞCI³, Şerife KARAKAYA²,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ², Varol ŞAHİNTÜRK²

¹Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta, Atılım University, Ankara, Turecko²Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta, Univerzita Osmangazi, Ankara, Turecko ³Andrologická laboratoř oddělení IVF jednotky, Vzdělávací a výzkumná nemocnice města Adana, Adana, Turecko

Pozadí/cíl:Hypertyreózaje spojena s výsledky ve zvýšené rychlosti glomerulární filtrace a také se zvýšenou aktivací renin-angiotensin-aldosteronu. Porucha Ca2 plus homeostázy v endoplazmatickém retikulu (ER) je spojena s mnoha onemocněními, včetně diabetické nefropatie ahypertyreóza. Kanonický kanál 1 s potenciálem přechodného receptoru (TRPC1) je prvním klonovaným proteinem rodiny TRPC. I když je vyjádřen na mnoha místech vledvina, jeho funkce je nejistá. TRPC1 se podílí na regulaci Ca2 plus homeostázy a jeho upregulace zvyšuje hladinu ER Ca2 plus, aktivuje rozvinutou proteinovou odpověď, která vede k poškození buněk vledvina. Tato studie zkoumala roli TRPC1 vledvinyhypertyreoidních potkanů, pokud jde o markery stresu ER, kterými jsou glukózou regulovaný protein 78 (GRP78), aktivující transkripční faktor 6 (ATF6), (kináza endoplazmatického retikula podobná protein kináze R (PKR)) (PERK), enzym vyžadující inositol 1 (IRE1).

Materiály a metody: Dvacet samců potkanů ​​bylo rozděleno do kontrolních a hypertyreoidních skupin (n=10).Hypertyreózabyla indukována přidáním 12 mg/l tyroxinu do pitné vody krys po dobu 4 týdnů. Byly měřeny bezsérové ​​T3 a T4 (fT3, fT4), TSH, dusík močoviny v krvi (BUN) a hladiny kreatininu. Histochemická analýzaledvinaPro protilátky GRP78, ATF6, PERK, IRE1, TRPC1 byly provedeny řezy na morfologické změny a také imunohistochemická a western blot analýza řezů ledvin.

Výsledky: Hladiny TSH, BUN a kreatininu klesly, zatímco hladiny fT3 a fT4 se zvýšily u potkanů ​​s hypertyreózou. Morfologická analýza vedla ke ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulech a také western blotu a imunohistochemické výsledky ukázaly zvýšení TRPC1, GRP78 a ATF6 u hypertyreózního potkana (p <>

Závěr: Na závěr jsme v naší studii poprvé ukázali, že vztah mezi stresem ER a TRPC1 a jejich zvýšená exprese způsobily poškození ledvin u potkanů ​​s hypertyreózou.

klíčová slova:Hypertyreóza, stres endoplazmatického retikula (ER), přechodný receptorový potenciál kanonický 1 (TRPC1),ledvina, krysa

1. Úvod

Trijodtyronin (T3) a tyroxin (T4) jsou hormony štítné žlázy nezbytné pro normální vývoj orgánů a metabolické funkce [1]. Kromě toho regulují rychlost růstu, funkci sodíkové/draselné pumpy, srdeční frekvenci, krevní tlak, dýchání, spotřebu kyslíku, trávení, metabolismus lipidů, sacharidů a bílkovin, funkci centrálního nervového systému, pohyby a metabolické funkce jiných endokrinních žláz [2]. .

Hypertyreózamá mnoho účinků na cholesterol, triglyceridy, lipidy, oxidaci, antioxidanty, malondialdehyd (MDA), katalytický enzym katalázu (CAT), jaterní enzymy, kyselinu močovou, močovinu, kreatinin a histopatologické změny v játrech a ledvinách [3]. Dysfunkce štítné žlázy ovlivňuje fyziologii a vývoj ledvin. V případě hypotyreózy, při které štítná žláza pracuje méně, se ledvinová hmota (poměr ledviny/tělesná hmota) snižuje, zatímco přihypertyreózau kterých žláza těžce pracuje, přibývá ledvinová hmota [4]. Těžká hypertyreóza však vede k degradaci proteinů a nakonec k atrofii ledvin. Hypertyreóza způsobuje zvýšení renálního průtoku krve (RBF) a glomerulární filtrace (GFR) [5]. Při hypertyreóze je zvýšená reabsorpce sodíku v proximálním tubulu, bazolaterální aktivace Na plus /K plus ATPáza [6], apikální Na plus /H plus modifikátor [7] a Na plus /Pi kotransportér [8]. Hormon štítné žlázy také aktivuje modifikátor Na plus/Ca2 plus, pravděpodobně cestou vázanou na cAMP, čímž zvyšuje absorpci vápníku vledviny[9].

Vápník je druhý posel, který reguluje většinu buněčných funkcí, včetně genové exprese a buněčné homeostázy [10], uvolňování neurotransmiterů a neuronální funkce [11], metabolismus a modulaci buněčného života [12]. Rodina kanálů přechodného receptorového potenciálu (TRP) je jednou z největších rodin kationtových kanálů. Rodina TRP se dále dělí na podskupiny TRPC (kanonický), TRPM (melastatin), TRPP (polycystin), TRPV (vaniloidní), TRPML (bukolický), TRPA (ankyrin) a TRPN (podobný NOMPC). Je známo, že TRPC proteiny tvoří Ca2 plus permeabilní, neselektivní kationtové kanály, a proto hrají důležitou roli v Ca2 plus signální transdukci. Rodina savců TRPC má sedm členů nazývaných TRPC1-TRPC7 [13]. Členové rodiny TRPC jsou vyjádřeni v různých částechledvina. TRPC1, který hraje roli zejména u diabetické nefropatie, je exprimován téměř všude, v renálních mezangiálních buňkách, glomerulech, buňkách proximálních tubulů a v tenké sestupné části Henleovy kličky, ale jeho přesná funkce není dosud známa [14].

Závažné poruchy Ca2 plus mohou vyvolat poškození buněk způsobené stresem endoplazmatického retikula (ER) v reakci na různé patologické stavy [5,15]. Poruchy Ca2 plus homeostázy u ER jsou spojeny s mnoha onemocněními [16]. ER je intracelulární organela, která je důležitá pro regulaci Ca2 plus homeostázy a syntézu a skládání proteinů. Modulace exprese/funkce Ca2 plus permeabilních kanálů také ovlivňuje intracelulární koncentrace Ca2 plus a následně Ca2 plus související procesy, jako je buněčná proliferace, ER stres, apoptóza a autofagie. Stres ER je stav, který narušuje redoxní rovnováhu a luminální Ca2 plus homeostázu, což způsobuje akumulaci rozložených/chybně složených proteinů. Aktivace rozložené proteinové odpovědi (UPR) způsobuje zvýšení glukózou regulovaného proteinu 78 (GRP78), chaperonu ER, který zvyšuje kapacitu skládání proteinů ER [17]. Aktivace stresu ER iniciuje evolučně konzervovaný UPR třemi hlavními převodníky signálu membrány ER: PERK, IRE1 a ATF6. K buněčné dysfunkci a buněčné smrti dochází za podmínek, kdy je stres ER chronicky prodloužen a zátěž proteinů na ER podstatně překračuje. Je známo, že jedna z cest způsobujících buněčnou smrt pozorovaná u chronických onemocnění, jako je hypoxie, ischemické/reperfuzní poškození, neurodegenerace, srdeční onemocnění a diabetes, je způsobena stresem z ER [12].

Ve světle všech těchto informací jsme se zaměřili na zkoumání vztahu mezi cestami transdukce signálu TRPC1 a ER-stresem vledviny, které jsou ovlivněny obecně vhypertyreóza.

Klikněte naCistanche se používá pro příznaky onemocnění ledvin

2. Materiály a metody

2.1. Zvířata

Naše studie byla schválena Eskişehir Osmangazi University Local Animal Ethics Committee (rozhodnutí č. 634 na schůzce č. 117 dne 30. 11. 2017) a řídila se Příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat vydanou National Institutes of Health. Dvacet dospělých (ve věku 7–8 týdnů) albínských samců Wistar, získaných z Medical and Surgical Experimental Research Center (TICAM), bylo udržováno při teplotě 24 ± 2 stupně a vlhkosti 55 ± 5 procent po dobu 12 hodin ve světlém/tmavém prostředí. pokus. Zvířata byla umístěna do polykarbonátových klecí na 2 týdny před experimentem a nechala se přizpůsobit okolním podmínkám a poté byla náhodně rozdělena do kontrolních a hypertyreoidních skupin. Kontrolní skupina (euthyroidní) byla během experimentu krmena standardním krmivem pro krysy a vodovodní vodou. Skupina s hypertyreózou byla založena se standardním krmivem pro potkany po dobu 4 týdnů a pitím vody z vodovodu obsahující 12 mg/l tyroxinu [18]. Na konci čtvrtého týdne byli potkani usmrceni intramuskulární injekcí ketaminu (45 mg/kg) a xylazinu (5 mg/kg). Okamžitě byly všem zvířatům odebrány intrakardiální krevní vzorky. Celýledvinybyly odstraněny nefrektomickým procesem. Pak vpravo a vlevoledvinykrys bylo podélně rozřezáno na dva kusy. Obě části pravé i levé ledviny byly použity pro analýzu western blotem a světelnou mikroskopií

2.2. Biochemické analýzy

Vzorky krve byly centrifugovány při 11, 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Séra byla umístěna do zkumavek a skladována při -80 stupni až do dne analýzy. Hladiny bezsérového T3 (fT3), volného T4 (fT4) a hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH) byly poté měřeny pomocí techniky ELISA podle protokolu výrobce. Hladiny exprese optické hustoty (OD) byly odečteny při 450 nm pomocí BioTek microplate reader 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA), poté byly vypočteny výsledky. Komerční sady pro fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) a TSH (YLA0047RA) byly zakoupeny od Shanghai YL Biotech, Čína. Také byly měřeny hladiny močovinového dusíku v krvi (BUN) a kreatininu metodou absorbanční fotometrie Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Švýcarsko).

2.3. Histologické hodnocení

ledvinykusy odebrané ke zkoumání na úrovni světelného mikroskopu byly fixovány v 10procentním formaldehydu po dobu 48 hodin. Po rutinním zpracování tkáně byly získány parafinové bloky. Poté byly odebrány 5 um sériové řezy a obarveny technikou kyselina jodistá-Schiff (PAS). Mikroskopické hodnocení bylo provedeno pro glomeruly a tubuly pod mikroskopem Olympus BX-51 (Olympus America, Inc., New York, USA). Řezy byly hodnoceny zaslepeným, semikvantitativním způsobem pomocí zavedené bodovací stupnice. Pro každou krysu ve skupinách bylo zkoumáno alespoň 10 polí s vysokým výkonem (x1000). Procento glomerulů, které vykazovaly ztluštění glomerulární bazální membrány, bylo hodnoceno následovně: 0=žádné, 1 Méně než nebo rovno 25 procentům, 2=25 procento až 50 procent, 3 =50 procento až 75 procent , 4 Větší nebo rovno 75 procentům [19]. Tloušťka glomerulární bazální membrány (um) byla měřena pomocí ZEISS ZEN 3.0 Microscope Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Německo).

2.4. Imunohistochemické hodnocení

Parafínové blokové řezy z každéholedvinatkáň byla odebrána na kladně nabitá sklíčka. Po deparafinizaci byla sklíčka přenesena přes degradované ethanolové série a poté xylol. Řezy byly inkubovány s 3% peroxidem vodíku, aby se zabránilo endogenní peroxidázové aktivitě. Po získání antigenu citrátovým pufrem byly řezy ohraničeny perem Pap-per, promyty 3 x 5 minut fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a poté blokovány Ultra V-blokem po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Řezy byly inkubovány s králičí polyklonální protilátkou ATF6 (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, USA), králičí polyklonální protilátkou IRE1 (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, Čína), myší monoklonální protilátkou PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc. ., Heidelberg, Německo) a myší monoklonální TRPC1 protilátka (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) přes noc při plus 4 stupních ve zvlhčených podmínkách. Po promytí 3 x 5 minut PBS byly řezy inkubovány s vhodnými sekundárními protilátkami (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Poté byly znovu promyty po dobu 3 x 5 minut PBS a kontrastně obarveny hematoxylinem. Sklíčka byla aplikována krycím sklíčkem pomocí média na vodní bázi. Mikroskopické vyšetření bylo provedeno pomocí mikroskopu Olympus BX51 a počítačově podporovaného zobrazovacího systému (Olympus America, Inc., New York, USA).

Všechny imunobarvené řezy byly vyhodnoceny kódovaným způsobem hlavním autorem, který byl slepý k názvu skupiny experimentů. Exprese TRPC1, ATF6, IRE1 a PERK byly detekovány hlavně v tubulech a/nebo glomerulech. Exprese byly semikvantitativně stanoveny podle procenta pozitivníchledvinasekce. Intenzita barvení byla klasifikována do čtyř stupňů: žádný ({{0}}), slabý (1), střední (2) a silný (3). Procento pozitivních histologických řezů ledvin bylo klasifikováno jako 4 stupně: 0 (0 procent), 1 (1 procento –10 procent), 2 (11 procent –49 procent) a 3 (50 procent –100 procent). Celkové skóre bylo součinem dvou skóre a konečné skóre jednoho vzorku bylo průměrem 10 mikroskopických polí. TRPC1, ATF6, IE1 a PERK byly hodnoceny podle uvedené metody [20].

Cistanche-funkce ledvin

2.5. Western blot analýzy

K určení změn v množství specifického proteinu vledvinatkáně zhypertyreózaa kontrolní skupiny byly ledviny nakrájeny na malé kousky a byla provedena homogenizace přidáním lyzačního pufru RIPA do 2ml zkumavek s kuličkami. Po homogenizaci byly zkumavky inkubovány při 4 stupních po dobu alespoň 30 min a poté byly tkáňové lyzáty centrifugovány při 4 stupních, 15,000g po dobu 20 min. Supernatant obsahující celkový protein byl přenesen do nové zkumavky. Stanovení proteinu bylo provedeno ze supernatantu pomocí zařízení Qubit 2.0 (Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA). Do každé jamky bylo naneseno 50 ug proteinu, podrobeno elektroforéze pomocí SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornie, USA) a poté přeneseno na PVDF membránu pomocí zařízení Bio-Rad Trans Turbo. Membrány byly blokovány 5% hovězím sérovým albuminem (BSA) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté inkubovány s myší monoklonální protilátkou GRP78 (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), králičí polyklonální ATF6 protilátkou (ab203119, Abcam Inc., Cam bridge, USA), králičí polyklonální protilátka IRE1 (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., Čína), myší monoklonální protilátka PERK (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), myší monoklonální protilátka TRPC1 (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) a myší monoklonální aktinovou protilátkou (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (pro kontrolu nanášení) přes noc při 4 stupních. Poté byly membrány promyty po dobu 3 x 10 minut promývacím roztokem (TBST), následovala inkubace s vhodnými sekundárními protilátkami (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Poté, co byly membrány promyty po dobu 3 x 10 minut TBST, byly hladiny exprese proteinů v imunoreaktivních pásech monitorovány zobrazovacím systémem (C-Digit, Licor, Cambridge, UK). Výsledky snímků byly analyzovány pomocí programu Image J 1.49v.

2.6. Statistická analýza

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí statistického balíčku IBM SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA). Experiment Western blot byl opakován třikrát pro každou skupinu. Hladina významnosti byla přijata jako p < 0,05.="" k="" určení="" normální="" distribuce="" dat="" byl="" použit="" shapiro–wilkův="" test.="" test="" homogenity="" rozptylu="" (levenův="" test)="" byl="" použit="" k="" posouzení,="" zda="" skupiny="" měly="" stejné="" rozptyly.="" pro="" data="" ukazující="" normální="" rozdělení="" byl="" proveden="" t-test="" nezávislých="" vzorků.="" mann–whitney="" u="" test="" byl="" proveden="" pro="" data="" vykazující="" nenormální="">

3. Výsledky

3.1. Biochemické výsledky

Hladiny fT3, fT4 a TSH v séru, hladiny BUN v séru a hladiny kreatininu u skupin potkanů ​​jsou uvedeny na obrázku 1. Výsledky naznačují, že hladiny fT3 a fT4 se významně zvýšily ve skupině s hypertyreózou ve srovnání s kontrolní skupinou (obě p < {{5="" }}.05).="" kromě="" toho="" bylo="" zjištěno="" významné="" snížení="" hladin="" tsh="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" (p="">< 0,05)="" (obrázek="" 1a).="" hladiny="" sérového="" bun="" (obrázek="" 1b)="" a="" kreatininu="" (obrázek="" 1c)="" významně="" poklesly="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" (oba="" p=""><>

3.2. Histochemické výsledky

Histologické změnyledvinyskupin potkanů ​​jsou znázorněny na obrázku 2. Histologie ledvin (glomeruly, tubuly a vaskulární struktury) byla typická pro kontrolní skupinu (obrázek 2A). Nicméně,hypertyreózazpůsobilo ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulu (obrázek 2B). Tloušťka glomerulární bazální membrány se významně zvýšila ve skupině s hypertyreózou ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3–4), (p < 0,05).="" z="" hlediska="" tubulární="" histologie="" nebyl="" mezi="" kontrolní="" skupinou="" a="" skupinou="" s="" hypertyreózou="" žádný="" zřejmý="">

Obrázek 1. Hladiny volného trijodtyroninu (fT3), volného tyroxinu (fT4) a hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH) u skupin potkanů ​​(a). * Odlišné od kontrolní skupiny (p < 0.05).="" hladiny="" sérového="" bun="" (b)="" a="" kreatininu="" (c)="" skupin="" potkanů.="" *na="" rozdíl="" od="" kontrolní="" skupiny="" (p="">< 0,001)="" byl="" proveden="" nezávislý="" t-test="">

Obrázek 2. Mikrofotografieledvinatkáně kontrolní (A) a hypertyreoidní (B) skupiny. V kontrolní skupině je vidět typická histologie ledvin (A). Ve skupině hypertyreózy,hypertyreózazpůsobilo ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulu. Bylo pozorováno ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulu (šipka) (B). U obou skupin potkanů ​​nejsou žádné zjevné rozdíly ve dřeni ledvin. (barvení kyselinou periodickou-Schiff (PAS)). Pruhy jsou 20 um a 50 um.

3.3. Imunohistochemické výsledky

Imunohistochemické reakce TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK a jejich exprese jsou semikvantitativně stanoveny podle procenta pozitivníchledvinyskupin potkanů ​​(obrázek 5–9). Také jejich průměrná odchylka je uvedena v tabulce. Ve srovnání s kontrolní skupinou se exprese proteinů TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1 a PERK významně zvýšila ve skupině s hypertyreózou v glomerulech a tubulech (obrázek 5–9) (p < 0,="" 000).="" výsledky="" ukázaly,="" že="" trpc1="" byl="" exprimován="" v="" glomerulárních="" i="" tubulárních="" strukturách="" v="" kontrolní="" skupině="" (obrázek="" 5-1ab)="" a="" jeho="" exprese="" byla="" zvýšena="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" (obrázek="" 5-2ab).="" grp78="" nebyl="" exprimován="" v="" kontrolní="" skupině="" (obrázek="" 6-1ab)="" a="" jeho="" pozitivní="" reakce="" byla="" pozorována="" jak="" v="" tubulech,="" tak="" v="" glomerulech="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" (obrázek="" 6-2ab);="" zatímco="" atf6="" nebyl="" exprimován="" v="" kontrolní="" skupině="" (obrázek="" 7-1ab),="" jeho="" exprese="" reagovaly="" pozitivně="" jak="" v="" tubulech,="" tak="" v="" glomerulech="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" (obrázek="" 7-2ab).="" ire1="" nebyl="" exprimován="" v="" kontrolní="" skupině="" (obrázek="" 8-1ab)="" a="" jeho="" pozitivní="" reakce="" byla="" pozorována="" jak="" v="" tubulech,="" tak="" v="" glomerulech="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" (obrázek="" 8-2ab).="" zatímco="" perk="" nebyl="" exprimován="" v="" kontrolní="" skupině="" (obrázek="" 9-1ab),="" exprese="" perk="" byla="" omezena="" na="" tubuly="" ve="" skupině="" s="" hypertyreózou="" (obrázek="">

Obrázek 3. Srovnání tloušťky glomerulární bazální membrány mezi kontrolní skupinou a skupinou s hypertyreózou. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0,05)="" byl="" proveden="" nezávislý="" t-test="">

Obrázek 4. Srovnání skóre tloušťky glomerulární bazální membrány mezi kontrolní skupinou a skupinou s hypertyreózou. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.05)="" byl="" proveden="" mann–whitney="" u="">

3.4. Výsledky Western blot

Výsledky Western blotu (obrázek 10) ukázaly statisticky významné zvýšení exprese TRPC1, PERK, ATF6 a GRP78 ve skupině s hypertyreózou ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,05).="" zvýšení="" ire1="" bylo="" statisticky="" významné,="" i="" když="" ne="" tak="" velké="" jako="" hladiny="" jiných="" proteinů="" (p=""><>Hypertyreózazpůsobily zvýšení exprese GRP78 (2,16krát), ATF6 (2,82krát), PERK (1,95krát), IRE1 (1,60krát) a TRPC1 (1,53krát) ve srovnání s kontrolní skupinou.

4. Diskuze

V této studii jsme poprvé navrhli, jak je postižena renální tkáňhypertyreózaz hlediska rolí stresu ER a kanálu TRPC1 v tomto procesu. V naší studii zvýšená exprese TRPC1 způsobila zvýšení koncentrace Ca2 plus v buňce, zejména zesílení kapilární bazální membrány a zvýšenou expresi GRP78 v tubulech, zejména v glomerulech. Domníváme se, že ER stres hraje aktivní roli v tomto procesu buněčného poškození, zejména prostřednictvím převodníku signálu ATF6 a PERK v dráze UPR (unfolded protein response).

Jak je vidět v mnoha studiích jako v naší studii [18], hodnoty fT3 a fT4 se v případě hypertyreózy zvyšují, zatímco hladina TSH klesá. Jakákoli dysfunkce štítné žlázy může ovlivnit produkci fT3 a fT4, což může být spojeno s různými patologickými stavy v celém těle [21]. Theledvinyhrají zásadní roli při vylučování odpadních produktů a toxinů, jako je močovina, kreatinin a kyselina močová. Posouzení funkce ledvin je důležité při léčbě pacientů s onemocněním ledvin nebo patologickými stavy ovlivňujícími funkci ledvin. Testy funkce ledvin jsou užitečné při identifikaci přítomnosti onemocnění ledvin, sledování odpovědi ledvin na léčbu a stanovení progrese onemocnění ledvin. Hladiny sérového kreatininu u hypertyreózy klesají, a to nejen v důsledku zvýšení GFR, ale také zvýšení svalové destrukce. Také pokles koncentrace BUN vhypertyreózaPředpokládá se, že je to způsobeno sníženou expresí akvaporinu 1 a 2. Hladiny BUN a kreatininu proto v mnoha studiích [22] stejně jako v naší studii poklesly. Za patologických podmínek mohou buňky ztrácet proteostázu, což má za následek akumulaci nesbalených a špatně složených proteinů v ER, což spouští UPR nebo ER stres [23].

Obrázek 5. Imunohistochemické barvení na TRPC1 u kontrolní (1A-B) a hypertyreoidní (2A-B) skupiny vledvinatkáň. Exprese TRPC se zvýšila ve skupině s hypertyreózou ve srovnání s kontrolní skupinou (šipky). Pruhy jsou 50 µm. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.000)="" byl="" proveden="" mann–whitney="" u="">

Obrázek 6. Imunohistochemické barvení na GRP78 v kontrolních (1A-B) a hypertyreoidních (2A-B) skupinách vledvinatkáň. Exprese GRP78 je zvýšena ve skupině s hypertyreózou (šipky). Pruhy jsou 50 µm. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.000)="" byl="" proveden="" mann–whitney="" u="">

Obrázek 7. Imunohistochemické barvení na ATF6 v kontrolních (1A-B) a hypertyreoidních (2A-B) skupinách vledvinatkáň. Exprese ATF6 je zvýšena ve skupině s hypertyreózou (šipky). Pruhy jsou 50 µm. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.000)="" byl="" proveden="" mann–whit="" ney="" u="">

Obrázek 8. Imunohistochemické barvení na IRE1 v kontrolních (1A-B) a hypertyreoidních (2A-B) skupinách vledvinatkáň. Exprese IRE1 je zvýšená ve skupině s hypertyreózou (šipky). Pruhy jsou 50 µm. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.000)="" byl="" proveden="" mann–whitney="" u="">

Obrázek 9. Imunohistochemické barvení na PERK u kontrolní (1A-B) a hypertyreoidní (2A-B) skupiny vledvinatkáň. Exprese PERK je zvýšená ve skupině s hypertyreózou (šipky). Pruhy jsou 50 µm. *Na rozdíl od kontrolní skupiny (p < 0.000)="" byl="" proveden="" mann–whitney="" u="">

Poruchy ER a cytosolické Ca2 plus homeostázy jsou spojeny s mnoha nemocemi, včetněledvina. Narušení ER Ca2 plus homeostázy spouští UPR, což zabraňuje další akumulaci nově syntetizovaných proteinů v ER. Ukazuje tedy obranný mechanismus pro přežití tím, že snižuje zátěž na ER [24].

Je známo, že různé faktory vyvolávají stres a spouštějí ERledvinapoškození. Stres ER v ledvinách může způsobit diferenciaci tubulárních epiteliálních buněk mezenchymálním přechodem z epitelu, ztrátu renálních tubulárních epiteliálních buněk apoptózou a nakonec renální patologii včetně ztráty nefronu, která snižuje filtrační kapacitu ledviny. Ve studii Dickhouta et al. byl prokázán ER stresem indukovaný epiteliálně-mezenchymální přechodový proces v buněčné linii renálního proximálního tubulu HK-2 pro chronické onemocnění ledvin [25]. Kromě mnoha studií [9], jak je vidět v naší studii,hypertyreózazpůsobilo ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulu. Bylo navrženo, že zvýšené ztluštění kapilární bazální membrány v glomerulech bylo vytvořeno jako výsledek procesu epiteliálně-mezenchymálního přechodu v důsledku zvýšené exprese GRP78 a převaděčů ER-stresového signálu. Význam ER stresu byl prokázán u chronickýchledvinaonemocnění v mnoha patologických stavech. V modelu diabetu vyvolaného streptozotocinem u myší C57BL/6 se vyvinul ER stres a těžká nefropatie vyskytující se ve dvacátém druhém měsíci byla spojena s regulací CHOP/GADD153, jedné ze složek apoptózy zprostředkované stresem ER [26 ]. U pacientů s nefrotickým syndromem, IgA nefropatií, primární mesangiální proliferativní glomerulonefritidou a membranózní nefropatií, včetně minimálně symptomatických pacientů, byly imunohistochemické exprese GRP78 a molekuly chaperonu indukovatelného endoplazmatického retikula (ER) zvýšeny kyslíkem regulovaným proteinem 150 (ORP150) ve srovnání s kontrolami. Exprese CHOP/GADD153 byla také zvýšena a jaderná lokalizace byla pozorována v epitelu proximálních tubulů u nefrotických pacientů. V buňkách lidských ledvin vystavených vysokým hladinám sérového albuminu byla pozorována indukce stresu ER a bylo prokázáno, že způsobuje apoptózu cestou CHOP/GADD153 [25]. Tubulointersticiální stresová odpověď ER byla nalezena u glomerulárních onemocnění s apoptózou tubulárních buněk spojenou s puromycinovou aminonukleosidovou nefrózou, přetížením proteiny a proteinurií spojenou s experimentální nebo lidskou diabetickou nefropatií [27]. Lorz a kol. uvádí, že paracetamol, analgetikum a antipyretikum, způsobuje renální tubulární poškození a apoptózu v důsledku ER stresu [28]. Paracetamol indukuje stresovou reakci ER včetně indukce CHOP a štěpení kaspázy-12. Nadměrná akumulace sekrečních proteinů vyvolává stres ER, což způsobuje poškození podocytů [29]. Útok komplementu také indukuje ER stres a aktivuje PERK dráhu vedoucí k poškození glomerulárních epiteliálních buněk. Všechna tato zjištění ukazují, že stres ER je jednou z hlavních příčin poškození ledvin a stresová reakce ER je obranným mechanismem protiledvinapoškození [30]. V naší studii se domníváme, že hypertyreóza vyvolaná tyroxinem v dávce 12 mg/l způsobuje ER stres v ledvinové tkáni a poškození způsobenéhypertyreózav ledvinové tkáni souvisí s regulací zejména ATF6 a PERK.

První klonovaný savčí kanál TRP, iontový kanál TRPC1, se nachází v buňce v ER, plazmatické membráně, intracelulárních vezikulách a primárních řasinkách. Vyskytuje se téměř všude v lidských tkáních a tkáních hlodavců. TRPC1 interaguje s různými proteinovými skupinami, včetně podjednotek iontových kanálů, receptorů a cytosolických proteinů, aby zprostředkovával svůj účinek na Ca2 plus signál. Působí jako neselektivní kationtový kanál v drahách, které řídí Ca2 plus influx v reakci na aktivaci buněčného povrchového receptoru. Prostřednictvím této funkce jsou také dostupné proliferace, přežití, diferenciace, sekrece a migrace buněk, stejně jako rysy, jako jsou neuronální růstové kužely a myoblastová fúze funkcí specifických pro chemotropní buňky [12].

Existuje mnoho studií o změně exprese TRPC1 u mnoha patologických stavů způsobujících stres ER. Sukumaran a kol. ukázaly, že existuje korelace mezi stresem ER a expresí TRPC1, která by mohla změnit přežití buněk ve slinné žláze. Vyjádřili, že exprese TRPC1 se snížila za podmínek stresu ER a také buněčná smrt v důsledku stresu ER byla závislá na expresi CHOP. Byl pozorován zvýšený ER stres a infiltrace v buňkách slinných žláz TRPC1-/- knock-out myší [16].

Obrázek 10ledvinaHladiny exprese proteinu GRP78, ATF6, TRPC1, IRE1 a PERK a graf násobku změny. Nárůst všech proteinů byl statisticky významný (*p < 0,05),="" byl="" proveden="" nezávislý="" t-test="">

KdyžledvinyU diabetických potkaních modelů bylo zjištěno, že exprese mRNA TRPC1 byla snížena [31]. U pacientů s diabetickou nefropatií nebo u diabetických potkanů ​​Zucker ve srovnání s kontrolami naznačovala snížená exprese TRPC1, že TRPC1 ovlivňuje rozvoj diabetické nefropatie [32]. TRPC1 hraje zásadní roli při udržování ER Ca2 plus homeostázy a snížená funkce vede k prodloužené aktivaci dráhy UPR a narušuje aktivaci AKT, což pak vede k neurodegeneraci. Snížení exprese TRPC1 bylo pozorováno v modelu myší Parkinsonovy choroby indukované neurotoxinem. Zvýšená exprese TRPC1 zvyšuje přežití neuronů regulací dráhy AKT/mTOR, navzdory stresu ER a UPR způsobenému neurotoxinem [33]. Li a kol. uvedli, že exprese TRPC1 byla také zvýšena u hypertrofie kardiomyocytů indukované namptinem v závislosti na čase. Když byl gen TRPC1 umlčen, vedlo to k inhibici srdeční hypertrofie vyvolané nikotinamid fosforibosyl transferázou. Nicméně se předpokládalo, že nadměrnou expresí TRPC1 indukuje nikotinamid fosforibosyltransferáza hypertrofii kardiomyocytů cestou indukovanou stresem ER. Z tohoto pohledu může umlčení genu TRPC1 hrát protektivní roli v prevenci srdeční hypertrofie [34]. V naší studii se také významně zvýšil stres ER a TRPC1. To naznačuje, že ztluštění kapilární bazální membrány způsobené zvýšeným stresem ER v renální tkáni v důsledkuhypertyreózaje způsobena zvýšenou expresí TRPC1.

Tato studie má určitá omezení. Místo krysího modelu hypertyreózy vyvolané tyroxinem mohly být použity geneticky modifikované myši. S močí odebranou pomocí metabolických klecí, některéledvinafunkční testy mohly být měřeny také v moči. Změna úrovně stresu ER by mohla být zkoumána pomocí inhibitoru TRPC1.

Na základě našeho přehledu literatury byl v této studii poprvé prokázán účinek hypertyreózy na vztah mezi stresem ER a kanálem TRPC1 v renální tkáni. Bylo rozhodnuto, žehypertyreózazpůsobil nárůst exprese TRPC1, který indukuje ER stres. Navrhujeme, že snížení exprese TRPC1 může být potenciální terapeutickou strategií pro hypertyreózu indukovanouledvinaa možná poškození dalších orgánů.

Reference

1. Kim D, Kim W, Joo SK, Bae JM, Kim JH a kol. Subklinická hypotyreóza a nízká normální funkce štítné žlázy jsou spojeny s nealkoholickou steatohepatitidou a fibrózou. Klinická gastroenterologie a hepatologie 2018; 16 (1): 123-131. DOI: 10.1016/j.cgh.2017.08.014

2. Bolkiny Y, Toulson E, El-Atrsh A, Akela M, Farg E. Extrakt z kořene Costus zmírňuje krevní biochemické poruchy experimentálně vyvolaných hypo- ahypertyreózau myší. Annual Research & Review in Biology 2019; 31 (5): 1-10. DOI: 10.9734/arb/2019/v31i530063

3. Sakr S, Abdel-Ghafar FR, Abo-El-Yazid SM. Selen zlepšuje karbimazolem indukovanou hepatotoxicitu a oxidační stres u albínských potkanů. Journal Coastal Life Medicine 2015; 3 (2): 930-936. DOI: 10.1016/j.jtemb.2010.07.002

4. Vargas F, Moreno JM, Rodríguez-Gómez I, Wangensteen R, Osuna A, et al. Cévní a renální funkce u experimentálních poruch štítné žlázy. European Journal of Endocrinology 2006; 154 (2): 197-212. DOI: 10.1530/tee.1.02093

5. Rhee CM. Interakce mezi štítnou žlázou aledvinanemoc: přehled důkazů. Aktuální názor v endokrinologii 2016; 23 (5): 407-415. DOI: 10.1097/Med.0000000000000275

6. Wijkhuisen A, Djouadi F, Vilar J, Merlet-Benichou C, Bastin J. Hormony štítné žlázy regulují vývoj enzymů energetického metabolismu v proximálním stočeném tubulu krys. American Journal of Physiology-Fysiology ledvin 1995; 268 (4): 634-642. DOI: 10.1152/ajprenal.1995.268.4.F634

7. Baum M, Dwarakanath V, Alpern RJ, Moe OW. Účinky hormonu štítné žlázy na neonatální renální kortikální Na plus/H plus antiporter. Kidney International 1998; 53 (5): 1254-1258. DOI: 10.1046/j.{7}}.1998.00879.x

8. Alcalde AI, Sarasa M, Raldúa D, Aramayona J, Morales R et al. Role hormonu štítné žlázy v regulaci renálního transportu fosfátů u mladých a starých potkanů. Endokrinologie 1999; 140 (4): 1544-1551. DOI: 10.1210/endo.140.4.6658

9. Iglesias P, Bajo MA, Selgas R, Díez JJ. Dysfunkce štítné žlázy a onemocnění ledvin: aktualizace. Recenze endokrinních a metabolických poruch 2017; 18 (1): 131-144. DOI:

10 1007/s11154-016-9395-710. Selvaraj S, Watt JA, Singh BB. TRPC1 inhibuje apoptotickou buněčnou degeneraci indukovanou dopaminergním neurotoxinem MPTP/MPP plus. Cell Calcium 2009; 46 (3): 209-218. DOI: 10.1016/j.ceca.2009.07.008

11. Goda Y, Südhof TC. Regulace uvolňování neurotransmiterů vápníkem: spolehlivě nespolehlivá? Current Opinion in Cell Biology 1997; 9 (4): 513-518. DOI: 10.1016/s0955-0674(97)80027-0

12. Sukumaran P, Schaar A, Sun Y, Singh BB. Funkční role TRP kanálů v modulaci ER stresu a autofagie. Cell Calcium 2016; 60 (2): 123-132. DOI: 10.1016/j.ceca.2016.02.012

13. Goel M, Sinkins WG, Zuo CD, Estacion M, Schilling WP. Identifikace a lokalizace TRPC kanálů u potkanůledvina. American Journal of Physiology-Fysiology Renal 2006; 290 (5): 1241-1252. DOI: 10.1152/ajprenal.00376.2005

14. Chubanov V, Kubánek S, Fiedler S, Mittermeier L, Gudermann T et al. Renální funkce TRP kanálů ve zdraví a nemoci. In: Emir TLR (redaktor). Neurobiologie TRP kanálů. 1. vyd. Boca Raton, Florida, USA: CRC Press/Taylor & Francis; 2017. str. 187-212.

15. Jeschke MG, Gauglitz GG, Song J, Kulp GA, Finnerty CC et al. Vápník a stres ER zprostředkovávají apoptózu jater po popáleninovém poranění. Journal of Cellular and Molecular Medicine 2009; 13 (8b): 1857-1865. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2009.00644.x

16. Sukumaran P, Sun Y, Zangbede FQ, Nascimento da Conceicao V, Mishra B et al. Exprese a funkce TRPC1 inhibují stres ER a buněčnou smrt v buňkách slinných žláz. FASEB BioAdvanc es 2019; 1 (1): 40-50. DOI: 10.1096/fab.1021

17. Zhao Y, Yan Y, Zhao Z, Li S, Yin J. Dynamické změny markerů stresové dráhy endoplazmatického retikula GRP78 a CHOP v hipokampu diabetických myší. Bulletin výzkumu mozku 2015; 111: 27-35. DOI: 10.1016/j.brainresbull.2014.12.00618. Araujo A, Schenkel P, Enzveiler A, Fernandes T, Partita W a kol. Role redox signalizace v srdeční hypertrofii indukované experimentálněhypertyreóza. Journal of Molecular Endocrinology 2008; 41 (6): 423-430. DOI: 10.1677/JME-08-002419. Wang Z, do Carmo JM, Aberdein N, Zhou X, Williams JM a kol. Synergická interakce hypertenze a diabetu při podpoře poškození ledvin a role stresu endoplazmatického retikula. Hypertenze 2017; 69 (5): 879-891. DOI: 10.1161/hyper tensionaha.116.08560

20. Zhang LY, Zhang YQ, Zeng YZ, Zhu JL, Chen H et al. TRPC1 inhibuje proliferaci a migraci rakoviny prsu s pozitivním estrogenovým receptorem a poskytuje lepší prognózu inhibicí dráhy PI3K/AKT. Výzkum a léčba rakoviny prsu 2020; 182 (1): 21-33. DOI: 10.1007/s10549-020-05673-8

21. Aldubayan MA. Proanthokyanidin z hroznových semen zmírňuje oxidační stres a apoptózu v játrech hypertyreózních myší. Annual Research & Review in Biology 2019: 1-11. DOI: 10.9734/arb/2019/v33i630138

22. Sonmez E, Bulur O, Ertugrul DT, Sahin K, Beyan E et al.Hypertyreózaovlivňuje funkci ledvin. Endokrinní 2019; 65 (1): 144-148. DOI: 10.1007/s12020-019-01903-2

23. Yan M, Shu S, Guo C, Tang C, Dong Z. Stres endoplazmatického retikula u ischemické a nefrotoxické akutníledvinazranění. Annals of Medicine 2018; 50 (5): 381-390. DOI: 10.1080/07853890.2018.1489142

24. Bezprozvanny I, Mattson MP. Nesprávné zacházení s vápníkem v neuronu a patogeneze Alzheimerovy choroby. Trends in Neurosciences 2008; 31 (9): 454-463. DOI: 10.1016/j.tins.2008.06.005

25. Dickhout JG, Carlisle RE, Austin RC. Vzájemný vztah mezi srdeční hypertrofií, srdečním selháním a chronickým onemocněním ledvin: stres endoplazmatického retikula jako mediátor patogeneze. Výzkum oběhu 2011; 108 (5): 629-642. DOI: 10.1161/circresaha.110.226803

26. Wu J, Zhang R, Torreggiani M, Ting A, Xiong H et al. Indukce diabetu u starých myší C57B6 má za následek těžkou nefropatii: souvislost s oxidačním stresem, stresem endoplazmatického retikula a zánětem. The American Journal of Pathology 2010; 176 (5): 2163-2176. DOI: 10.2353/ajpath.2010.090386

27. Cybulský AV. Stres endoplazmatického retikula u proteinurického onemocnění ledvin.ledvinyMezinárodní 2010; 77 (3): 187-193. DOI: 10.1038/ki.2009.389

28. Lorz C, Justo P, Sanz A, Subirá D, Egido J et al. Paracetamolem indukované renální tubulární poškození: role pro ER stres. Journal of the American Society of Nephrology 2004; 15 (2): 380-389. DOI: 10.1097/01.asn.0000111289.91206.b0

29. Inagi R, Nangaku M, Onogi H, Ueyama H, Kitao Y et al. Zapojení stresu endoplazmatického retikula (ER) do poškození podocytů vyvolaného nadměrnou akumulací proteinu.ledvinyMezinárodní 2005; 68 (6): 2639-2650. DOI: 10.1111/j.{6}}.2005.00736.x

30. Yoshida H. Stres a nemoci ER. The FEBS Journal 2007; 274 (3): 630-658. DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05639.x

31. Nesin V, Tsiokas L. TRPC1. In: Nilius B, Flockerzi V (editoři). Kationtové kanály savčího přechodného receptorového potenciálu (TRP). 24. vyd. Berlín, Heidelberg, Německo: Springer; 2014. str. 15-51.

32. He F, Peng F, Xia X, Zhao C, Luo Q a kol. MiR-135a podporuje renální fibrózu u diabetické nefropatie regulací TRPC1. Diabetologie 2014; 57 (8): 1726-1736. DOI: 10.1007/s00125-014-3282-0

33. Selvaraj S, Sun Y, Watt JA, Wang S, Lei S et al. Neurotoxinem indukovaný ER stres v myších dopaminergních neuronech zahrnuje downregulaci TRPC1 a inhibici signalizace AKT/mTOR. The Journal of Clinical Investigation 2012; 122 (4): 1354-1367. DOI: 10.1172/JCI61332

34. Li J, Wu W, Zhao M, Liu X. Zapojení TRPC1 do hypertrofie kardiomyocytů indukované Nampt prostřednictvím aktivace stresu ER. Buněčná a molekulární biologie 2017; 63 (4): 33-37. DOI: 10.14715/CMB/2017.63.4.6