Interakce mezi polyfenolickými antioxidanty kvercetinem a naringeninem diktují charakteristické chemické a biologické chování jejich směsí související s redoxem, část 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Q v koncentraci dosahující 1 μM měl také tendenci snižovat expresi ALOX12 a MT3 (0.05<><0.09) as="" well="" as="" sod2="" and=""><><0.09).the latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" that="" belongs="" to="" the="" family="" of="" thioredoxins="" and="" acts="" as="" an="" endogenous="" antioxidant="" facilitating="" the="" reduction="" of="" other="" proteins8.in="" contrast,="" to="" n-,o="" at="" 1="" um="" up-regulated="" gtf2i=""><0.05).the other="" genes="" whose="" expression="" was="" significantly="" elevated="" by="" q="" at="" l="" μm="" were="" gsr,="" hspa1a,="" ptgsi,="" and="" txnrd1;="" all="" play="" key="" roles="" in="" building="" cellular="" defenses="" against="" oxidants.="" up-regulation="" of="" gsr="" is="" crucial="" for="" maintaining="" redox="">homeostázev buňkách, protože kódovaný protein udržuje vysoké hladiny redukovaného glutathionu v cytosolu39. Chaperon HSPalA je zase potřebný k nápravě jakéhokoli chybného skládání, a to i těch, které jsou výsledkem expoziceantioxidanty. Ten může posunout redoxní rovnováhu směrem k redukovanému stavu, což vede k pravděpodobnější redukci disulfidových můstků nasulfhydryl

skupiny a tím mění strukturu proteinu a tím i funkci0.Gen PTGS1 kóduje protein, který je vet dalším členem rodiny antioxidačních enzymů, konkrétně prostaglandinsyntázou-241, čtvrtý zmíněný gen-TXNRD{{4 }} kóduje thioredoxin reduktázu, která udržuje thioredoxin (TXN) v redukovaném stavu2.

Kliknutím sem se dozvíte více

Podobně jako 1 μM, Q při vyšší koncentraci（10 μM） také snížil expresi TXN（p<0.05） and="" sod2=""><><0.09). furthermore,="" a="" drop="" in="" expression="" was="" observed="" for="" sod1=""><><0.09). the="" investigated="" flavonol="" at="" 10μm="" influenced="" the="" expression="" of="" also="" 4="" genes="" up-regulated="" by="" its="" lower="" concentration∶="" gsr,="" hspa1a,="" ptgs1,="" and="" txnrd2=""><0.05). the="" additional="" up-regulated="" genes="" by="" the="" higher="" q="" concentration="" included="" gstz1="" and="" stk25=""><0.05) as="" well="" as="" gpx4="" and="" sirt2=""><><0.09). the="" protein="" encoded="" by="" gstz1="" is="" a="" member="" of="" the="" glutathione="" s-transferase="" family="" that="" are="" key="" enzymes="" implicated="" in="" the="" detoxification="" of="" electrophilic="" molecules="" by="" conjugation="" with="" gsh4,="" while="" stk25="" codes="" for="" serine/threonine="" kinase="" 25,="" a="" protein="" activated="" by="" oxidative="" stress="" that="" induces="" apoptotic="" cell="" death.="" in="" turn,="" gpx4="" codes="" for="" glutathione="" peroxidase="" 4,="" which="" supports="" the="" antioxidant="" barrier="" of="" the="" cell="" by="" catalyzing="" the="" reduction="" of="" peroxides="" by="" glutathione="" the="" up-regulation="" of="" sirt2,="" encoding="" nad-dependent="" protein="">deacetyláza, který deacetyluje vnitřní lysiny přítomné např. v histonech nebo transkripčních faktorech, hraje roli v modulaci klíčových biologických procesů, jako je kontrola buněčného cyklu, buněčná diferenciace nebo genomová integrita,46.

Cistanche může zlepšit imunitu

Směs aglykonů v 1 μM snížila expresi APOE, CCL5, MT3 a MSRA do té míry, že dosáhla statistické významnosti (p<0.05). the="" apolipoprotein="" encoded="" by="" apoe="" is="" a="" core="" component="" of="" plasma="" lipoproteins="" and="" is="" involved="" in="" their="" production,="" conversion,="" and="" clearance47.="" the="" protein="" encoded="" by="" msra="" carries="" out="" the="">enzymatickéredukci methioninsulfoxidu na methionin, takže tento protein funguje při opravě oxidativně poškozených proteinů a obnovuje biologickou aktivitu8. Směs QN při 10 μM, podobně jako nižší dávka, snížila expresi APOE, MT3 a MSRA(p<0.05). however="" at="" a="" higher="" concentration.="" the="" set="" of="" down-regulated="" genes="" was="" extended="" to="" incorporate="" cygb="" and=""><0.05). the="" latter="" gene="" sepp1="" encodes="" selenoprotein="" p="" the="" extracellular="">glykoproteinkterý má antioxidační roli a zdá se, že je spojen s endoteliálními buňkami49. Směs QN-jen mírně potencovala expresi genu PRDX5, který kóduje člen peroxiredoxinové rodiny antioxidačních enzymů, jejichž úlohou je redukovat peroxid vodíku a alkylhydroperoxidy50.

Diskuse

Vědecký základ epidemiologických pozorování, který naznačuje, že celé ovoce a zelenina jsou účinnější v prevenci chronických neinfekčních onemocnění než bioaktivní sloučeniny z nich izolované, je špatně pochopený. Jako možné vysvětlení byl navržen koncept potravinové synergie, který předpokládá aditivní nebo dokonce synergický vliv různých složek potravin na lidské zdraví. Takové uvažování však bylo do určité míry podkopáno naším předchozím výzkumem, ve kterém jsme porovnávali biologickou aktivitu různě pigmentované zeleniny (brassicas) a bobulového ovoce, bílého vs. obsahujícího antokyany, a nenašli jsme žádný vzorec aktivity, který by bylo možné připsat barevným odrůdám. s výjimkou vyšší antioxidační aktivity v chemických testech51. Ani biologické účinky nebyly shodné s účinky izolovaného kyanidin-3--O-glukosidu v koncentraci vyskytující se ve studovaném rostlinném materiálu12. Další mechanistická zkoumání rekonstituce kakaa také neprokázala žádné aditivní/synergické biologické účinky směsí složek, jak předpovídal koncept potravinové synergie, ale spíše zcela pozměněnou biologickou aktivitu3. Následné směsi kakaových polyfenolů se jakoby chovaly jako nové látky. Předpokládali jsme, že interakce mezi jednotlivými složkami směsi by mohly vytvořit novou entitu vykazující modifikované fyzikálně-chemické vlastnosti vedoucí k novým biologickým aktivitám. Ukázalo se, že rozmanitost možných interakcí mezi polyfenoly (vodíkové, n, hydrofobní, chelatační, kovalentní a elektrostatické), objevené během výzkumů jejich použití jako stabilizátorů samosestavených nanočástic, vytváří řadu struktur lišících se funkčností. Bylo také pozorováno, že tyto fytochemikálie obvykle vyvíjejí více než jeden typ stabilizačních přitažlivých sil. V současném výzkumu jsme zkoumali, jak souhra častého soupeření o interakce ve směsi pouhých dvou polyfenolických antioxidantů ovlivnila její redoxní aktivity ve srovnání s jednotlivými složkami.

První série experimentů se soustředila na chemické a elektrochemické stanovení parametrů charakterizujících oxidaci jednotlivých a 1:1 směsných flavonoidů (zástupci skupiny flavonolu a flavanonu), samostatně v aglykonové (Q N-) a glykosidové (R, N plus ) formě . Korelace mezi výsledky těchto měření jsou uvedeny na obr.8. Počáteční hodnocení provedená nejoblíbenějším dávkovým testem DPPH ukázala, že ačkoli se oba flavanony (N-, N plus ) jevily jako velmi slabé antioxidanty, zvyšovaly antioxidační aktivitu směsí, jak QN, tak RN plus, synergickým způsobem (obr. 2A). DPVanalysis poskytla hlubší vysvětlení tohoto efektu a poukázala na rozhodující vliv kinetiky reakce. Ukázalo se, že studované flavanony snadno uvolňují elektrony podle vysoké hodnoty termodynamického parametru E,(obr.2C). Kinetika tohoto procesu však byla příliš pomalá na to, aby byla pozorovatelná DPPH a PT testy. Flavanoly, silné antioxidanty v testu DPPH a PT, vykazovaly v DPV opačné vlastnosti – nepříznivou termodynamiku uvolňování elektronů, ale vysokou rychlost oxidačního procesu. Srovnání struktur intermediárních radikálů naznačuje, že flavonol semichinonový radikál je stabilnější než flavanonový fenoxylový radikál díky několika stabilizačním mechanismům (obr. 1). Z toho vyplývá, že stabilizace radikálového meziproduktu má zásadní význam pro kinetiku oxidační reakce a následně pro redukční aktivitu zkoumaných sloučenin.

Konečná antioxidační aktivita studovaných směsí je umocněna termodynamickými faktory, příznivě ovlivňujícími oxidační proces, který následně zlepšil reakční kinetiku (obr. 2B-F). Podrobnější mechanismus tohoto zesílení zůstává v současnosti nevysvětlen, s největší pravděpodobností se jedná o specifické interakce flavonol/flavanon. Toto zvýšení bylo pozorováno nejen ve zkumavce, ale také za buněčných podmínek, jak bylo prokázáno testem CAA, ve kterém antioxidační aktivita obou směsí, ON a RN plus, vytlačila antioxidační aktivitu vyšší než u jednotlivých složek (obr. 4). Chemická část našich výzkumů odhalila rozpor v antioxidační aktivitě mezi jednotlivými sloučeninami a jejich směsmi. Jeden může

poukazují na význam kinetiky oxidační reakce pro celkovou antioxidační aktivitu a naznačují, že interakce mezi jednotlivými složkami ovlivňují redoxní vlastnosti směsi. Správné musí být alespoň v tomto případě, kdy přítomnost flavonolů (Q, R) ve směsi zvýšila schopnost flavanonů (N-, N plus ) darovat elektrony.

Následná část výzkumu se soustředila na porovnání redoxních biologických vlastností jednotlivých flavonoidů (O, R, N-, N plus ) a jejich směsí (ON- a RN plus ). Buňky lidského karcinomu tlustého střeva HT29 sloužily jako doporučené pro model nutričních studií lidského trávicího traktu3, avšak v této studii se některé interpretace dat také týkají neoplastické povahy této buněčné linie. V dnešní době je všeobecně přijímáno, že redoxní rovnováha je životně důležitá pro přežití a funkci buněk; expozice exogenním antioxidantům stejně jako ROS může modulovat mnoho buněčných procesů. Při redukčním stresu může nedostatečné množství ROS změnit buněčnou signalizaci prostřednictvím redox-dependentních drah6. Nadbytek ROS na druhé straně vede k oxidačnímu stresu a zvýšenému riziku oxidačního poškození buněčných složek. Biologickým výchozím bodem této studie bylo posouzení vlivu antioxidantů, jednotlivých i ve směsi, na buněčný růst; aktivita, která je závislá na buněčné redoxní homeostáze, protože správná koncentrace ROS je klíčová pro aktivaci signalizace, která spouští buněčnou proliferaci. Výsledky testu životaschopnosti buněk MTT odhalily podstatné rozdíly mezi ošetřeními. Čisté sloučeniny významně neovlivnily buněčnou proliferaci ve srovnání s kontrolními neošetřenými buňkami; růst buněk dosáhl konstantní úrovně v širokém rozmezí koncentrací. Naproti tomu obě směsi (QN-, RN plus ) významně stimulovaly buněčnou proliferaci. Tento druhý účinek nemusí nutně souviset pouze s antioxidačními vlastnostmi směsí, protože výsledky testu CAA pro O byly podobné těm pro směs ON. Nicméně směsi, nikoli jednotlivé složky, zjevně lépe podporovaly buňky HT29, aby se vypořádaly se zbytkovým oxidačním stresem, např. obnovením optimálního redoxního stavu; účinek pozorovaný dříve u tak silných antioxidantů, jako jsou katechiny55. Ačkoli synergické zvýšení antioxidační aktivity pozorované u směsí může být vnímáno jako prospěšný účinek, skutečnost, že takové kombinace antioxidantů stimulují růst rakovinných buněk, není žádoucí. Klady a zápory antioxidantů a ROS u rakoviny jsou již nějakou dobu předmětem debat a vedly k závěru, že antioxidanty mohou podporovat rakovinu prostřednictvím složitých mechanismů56, což je také vidět zde.

Dalším zajímavým zjištěním bylo, že nežádoucí účinky léčby, jako je prooxidační aktivita N-odhalená testem CAA, stejně jako genotoxicita Q pozorovaná v testu komety, byly u směsí odstraněny. Poslední test odhalil, že poškození DNA způsobené nejvyšší studovanou koncentrací (100 uM) čistého O bylo sníženo na kontrolní úroveň pro ekvimolární koncentraci směsi QN-(obr. 5), což může souviset se zlepšenou antioxidační aktivitou ON. -pozorováno při elektrochemických testech. V případě hodnocení buněčné antioxidační aktivity vykazovaly aglykony jednoznačnější antioxidační (O) nebo prooxidační (N-) vlastnosti než odpovídající glykosidy (obr. 4). N- ve fyziologických koncentracích nepřevážil redoxní pufrovací kapacitu normoxických buněk HT29, zatímco při vyšších koncentracích, než jaké byly nalezeny v lidské plazmě, vykazoval prooxidační účinek závislý na koncentraci, který se s časem expozice snižoval. Obecně aglykony snižovaly svůj počáteční vliv na buněčný redoxní stav v průběhu času (obr. 4). Obě směsi vykazovaly zvýšenou antioxidační aktivitu, zjevně neovlivněnou prooxidačním účinkem pozorovaným u jednotlivých sloučenin.

Diferencovaný vliv směsí ve srovnání s jednotlivými složkami byl také vidět v epigenetické verzi kometového testu použitého ke sledování změn v metylaci DNA. Jednotlivé flavonoidy vykazovaly tendenci snižovat globální metylaci DNA v závislosti na koncentraci, s výjimkou R, který tuto epigenetickou modifikaci neovlivnil (obr. 6). Obě směsi také snížily globální hladinu methylace DNA, ale nebyla zaznamenána žádná korelace s koncentrací. Stojí za zmínku, že nejen redoxní stav může hrát roli při kombinování polyfenolů, protože v případě metylace DNA, ale také se nezdálo, že by vliv studovaných flavonoidů byl spojen s jejich redukčními vlastnostmi. Je známo, že aktivní demethylace zahrnuje iterativní oxidaci methylové skupiny v 5-methylcytosinu na karboxy formu5758, takže se očekává, že antioxidanty budou tento proces blokovat. V našich experimentech jsme pozorovali opačný dopad. Zde se tedy nejspíše podílel jiný mechanismus, kterým je inhibice DNA metyltransferázy (DNMT1) – enzymu, který katalyzuje přenos methylových skupin na dinukleotidové CpG struktury v DNA. Blokáda udržování methylačního vzoru vede k pasivní demetylaci během po sobě jdoucích kol replikace DNA. Naše výsledky jsou v souladu s jinými studiemi, které prokázaly inhibici DNMT1 quercetinem9. Bylo také prokázáno, že některé flavanony, včetně N-inhibují aktivitu DNMT1 v jaderných extraktech buněk KYSE-510 lidského spinocelulárního karcinomu jícnu. Naše studie také ukázala, že smíchání Q s N-způsobilo pozoruhodný pokles hladiny metylace DNA ve všech testovaných koncentracích této směsi. Podobný výsledek byl pozorován pro RN plus; k hypometylaci DNA však došlo v menší míře. Všechna tato pozorování mohou být zajímavá z terapeutického hlediska Vzorec metylace DNA u rakoviny je charakterizován na jedné straně globální ztrátou metylace v tělech genů a intergenových oblastech vedoucí k oslabení stability genomu!, na straně druhé tím, že hypermethylace oblastí bohatých na CpG v promotorech a transkripční umlčení exprese tumor supresorových genů (TSG)! Hypomethylace DNA indukovaná polyfenoly tedy může obnovit expresi umlčených genů TSG a také postupně zvyšovat nestabilitu rakovinného genomu až do bodu vedoucí k buněčné smrti.

Popsané buněčné účinky studovaných polyfenolů ukázaly, že nejen obsah nebo složení nebo biologická dostupnost, ale také interakce mezi složkami modulují elektrochemické i biologické vlastnosti směsí. Tento závěr názorně podpořila i poslední aktivita analyzovaná v této studii, tj. modulace exprese širokého spektra genů spojených s antioxidační obranou a odpovědí na oxidační stres. Vennův diagram (obr. 7C) shrnuje vliv zkoumaných flavonoidních aglykonů na modulaci genové exprese. V případě čistých sloučenin (O, N-) v 1 uM bylo zjištěno, že pouze jeden gen (GTFZI) je ovlivněn oběma flavonoidy. N-způsobil však down-regulaci tohoto genu, zatímco Q zvýšil jeho expresi. Tento dopad nebyl zachován při vyšších koncentracích čistých sloučenin ani nebyl pozorován u jejich směsi v žádné dávce. N a směs QN-down-reguloval také dva další geny, CCL5 a MT3, v 1 μM a tři geny zahrnující CYGB, MT3 a MSRA v 10 uM. Nejpřekvapivější je, že nebyly nalezeny žádné podobnosti v regulaci exprese genů mezi Q a QN-ani mezi Q, N- a QN-v žádné ze zkoumaných koncentrací. Navíc směs QN významně změnila expresi tří dalších genů (APOE a SEPPI down-regulace, PRDX5 up-regulace), jejichž transkripční aktivita nebyla ovlivněna žádnou z jednotlivých složek. Závěrem, naše studie ukazuje, že biologické vlastnosti polyfenolových směsí nejsou jen kombinací zesílených nebo oslabených aktivit jednotlivých složek. Tato pozorování naznačují, že bioaktivita fytochemikálií ve směsích musí být výsledkem interakcí mezi složkami vedoucími ke vzniku nové látky s novými chemickými a biologickými vlastnostmi, které je obtížné předvídat. , ale ve skutečnosti rozšířit myšlenku konceptu potravinové synergie s důrazem na skutečnost, že i drobné úpravy ve složení směsi potravinářských fytochemikálií (pravděpodobně i složek potravin jiného původu) vytvářejí novou entitu, jejíž dopad na lidské zdraví nemusí nutně připomínat jednotlivých komponent. Tato představa podkopává současný způsob, jakým jsou navrhovány doplňky stravy, které staví na zdravotních tvrzeních zjištěných na základě výzkumu izolovaných sloučenin. Z hlediska dietní chemoprevence předložená studie vysvětluje, proč současný přístup zdůrazňující použití izolovaných bioaktivních složek potravin nebyl schopen odpovídat epidemiologickým pozorováním provedeným pro celé potraviny, které lidé přijímají. Mají-li doplňky stravy jednotlivcům nabídnout skutečné dlouhodobé přínosy pro zdraví, je nezbytné, aby byly kombinace domnělých látek studovány společně a v biologickém kontextu.

Materiály a metody

Chemikálie, činidla. Pro studii byly použity následující bioaktivní sloučeniny: kvercetin(Q), rutin (R), naringin (N plus) a naringenin (N-) od Sigma-Aldrich (USA). Byly použity methanol a methanol analytické čistoty od POCH (Polsko) a také DMSO od Sigma-Aldrich (USA). K čištění vody byl použit systém QPLUS185 od Millipore (USA). Pro hodnocení antioxidační aktivity spektrofotometrickým testem byl použit 1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) od Sigma-Aldrich (USA).{7}}.1 M pufr fosforečnanu sodného připravený rozpuštěním Na, HPO12H , O a NaH, PO2H, O (Sigma-Aldrich, USA) v deionizované vodě byl použit v elektrochemických studiích. Pracovní elektroda a elektrochemický článek byly vyčištěny roztokem 10 mM manganistanu draselného (Sigma-Aldrich, USA) v 95% H, SO, (y/y) (POCH, Polsko). Referenční elektroda byla uložena v 3 M KCl (Sigma-Aldrich, USA) rozpuštěném v deionizované vodě. Všechna činidla použitá v buněčné kultuře (PBS, McCoy's 5A medium, trypsin, fetální bovinní sérum, antibiotika) byla zakoupena od Sigma-Aldrich (USA). Roztok PBS byl připraven rozpuštěním jedné tablety ve 200 ml čištěné vody, thiazolylové modři tetrazoliumbromidu (MTT) od Sigma-Aldrich (USA) byl aplikován v testu MTT. Buněčný antioxidační test OxiSelect

Kit byl zakoupen od Cell Biolabs, Inc. (USA). Pro kometový test byla použita následující činidla: kyselina chlorovodíková (HCl), agaróza s nízkou teplotou tání (LMP agaróza), chlorid sodný (NaCl, hydroxid sodný (NaOH), kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 2-amino{{1 }}(hydroxymethyl)-1,3-propandiol (Trizma-Base), barvivo na gel nukleové kyseliny Sybr Green I a Triton X-100 od Sigma-Aldrich (USA), stejně jako normální tání bodová agaróza (NMP agaróza) od Bioline (UK).V kometovém testu citlivém na metylaci byla navíc použita proteináza K (Merck, USA), restrikční enzymy (HpalI/MspI) a Tango pufr (Promega, UK). OIAshredder , RNeasy Mini Kit, RNase-Free DNase set, RT² First Strand Kit, RT²SybrGreen qPCR Mastermix, RT2Profiler PCR pole pro oxidativní stres (PAHS 0065) od Qiagen (Německo) byly použity v genomických studiích.

Tento článek je extrahován zwww.nature.com/scientificreports