Inhibiční účinek frakcí Elaeagnus Umbellata na melanogenezi v buňkách melanomu B16-F10 stimulovaných MSH

Abstraktní:

Když je kůže vystavena UV záření, melanocyty produkují melanin. Nadměrná produkce melaninu vede k pigmentaci kůže, která způsobuje různé kosmetické a zdravotní problémy. Proto je nezbytný vývoj bezpečných, přírodních léčiv, která inhibují produkci melaninu. Elaeagnus umbellata (EU) je již dlouho široce používán jako lidová léčivá rostlina kvůli farmakologickým vlastnostem, které zahrnují protivředové, antioxidační a protizánětlivé vlastnosti.

V této studii jsme zkoumali antioxidační aktivitu a inhibiční účinky na melanogenezi frakcí EU v buňkách melanomu B16-F10. EU frakce vykazovaly na dávce závislé zvýšení antioxidační aktivity v aktivitě vychytávání radikálů. Kromě toho jsme hodnotili účinek EU frakcí na aktivitu tyrosinázy a melanogenezi v buňkách melanomu B16-F10 indukovaném melanocyty. EU byla necytotoxická při 12,5–50 µg/ml. EU frakce účinně inhibovaly aktivitu tyrosinázy a melanogenezi, potlačovaly fosforylaci CREB a ERK zapojených do dráhy melanogeneze a snižovaly expresi proteinů souvisejících s melanogenezí. Je zajímavé, že antimelanogenetický účinek byl nejúčinnější při koncentraci 50 ug/ml EU a účinky frakcí byly lepší než účinky extraktu. Naše studie proto naznačuje, že EU má potenciál jako bezpečná léčba nadměrné pigmentace nebo jako přírodní složka v kosmetice.

Zpomaluje se rychlost růstu lidské kůže a nových buněk v našem těle, zpomaluje se metabolismus kůže, stárnoucí buňky se nedají včas a plynule metabolizovat a melanin jen těžko zmizí. Ve spojení s postupnou ztrátou přirozených hydratačních faktorů na povrchu pokožky dochází k zahušťování a hromadění stratum corneum, přibývá melaninu a na pokožce se postupně objevují matné tmavé skvrny. Bez ohledu na to, kolik bělících produktů péče o pleť je aplikováno, je obtížné se do pokožky vstřebat. Proto jsme během našeho výzkumu zjistili, že celkové glykosidy Cistanche deserticola, funkční složka v Cistanche tubulosa, mohou účinně odstraňovat různé aktivní kyslíkové radikály (O2·-, OH·, H2O2, 1O2) a chránit před poškozením DNA způsobeným OH·volné radikály a polysacharidy Cistanche deserticola mohou oddálit fyziologickou degeneraci orgánů a morfologickou transformaci buněk. Všechny výše uvedené složky mohou mít antioxidační a anti-aging efekt. Současně může Cistanche deserticola také inhibovat aktivitu tyrosinázy, aby se dosáhlo bělícího účinku.

Click cistanche tubulosa extraktový práškový produkt

klíčová slova:

Elaeagnus umbellata; bělení kůže; antioxidant; melanogeneze; -MSH.

1. Úvod

Barva kůže u lidí závisí na množství melanosomů geneticky přítomných a míře, do jaké jsou tyto melanosomy rozptýleny v kůži, a je také ovlivněna stupněm vystavení slunečnímu záření a znečištěním životního prostředí [1]. Melanin je sloučenina s vysokou molekulovou hmotností vyskytující se u zvířat a rostlin a je důležitým pigmentem, který určuje barvu očí, kůže a vlasů lidí. Melanogeneze se týká procesu produkce melaninu, hlavní příčiny pigmentace v lidské kůži. Melanin může chránit pokožku před škodlivým UV zářením, ale nadměrná produkce melaninu může vést k estetickým problémům, včetně melasmatu a pih, a také zdravotním problémům, včetně pozánětlivé hyperpigmentace [2].

Melanin hraje klíčovou roli při ochraně kůže před různými podněty, jako je UV záření, reaktivní formy kyslíku (ROS) a hormon stimulující melanocyty (-MSH) [3]. Když je kůže vystavena UV záření, produkuje se ROS a kožní buňky vytvářejí nadbytek melaninu. Takto generovaný ROS ničí jednovláknovou a dvouvláknovou DNA a napadá molekuly proteinů a lipidů [4]. Melanin a antioxidační enzymy, jako je peroxidáza, glutathion a kataláza, neutralizují vytvořené ROS, aby udržely určitou hladinu [5,6]. Nekontrolovatelná nadměrná produkce ROS však vede k různým problémům, jako je rakovina [7]. Melanocyty se nacházejí v bazální vrstvě epidermis a jsou modulovány tyrosinázou. Tyto buňky produkují melanin prostřednictvím melanogeneze a na tomto procesu se podílejí faktory, jako je transkripční faktor spojený s mikroftalmií (MITF) a protein související s tyrosinázou (TRP-1) [8]. Tyrosináza se podílí na cestě, při které se z L-tyrosinu stává 3,4-dihydroxyfenylalanin (DOPA), který se následně přeměňuje na dopachinon, ze kterého se syntetizuje melanin. Proto je tyrosináza důležitým faktorem, který reguluje melanogenezi v kožních buňkách.

K vyřešení estetických problémů způsobených pigmentací a pigmentovými poruchami způsobenými nadměrnou melanogenezí se v poslední době mnoho lékařských a kosmetických průmyslů zaměřilo na inhibitory tyrosinázové aktivity [9]. Různé chemikálie jako arbutin, kyselina kojová, hydrochinon a kyselina askorbová, které jsou inhibitory syntézy melaninu, se používají jako činidla pro bělení kůže [10]. Tyto látky však špatně pronikají kůží a při delším používání mohou mít vedlejší účinky, jako je podráždění kůže, zánět, svědění a pigmentace [11]. Proto existuje potřeba vyvinout účinná bělicí činidla, která mohou bezpečně léčit a předcházet hyperpigmentaci lidské kůže bez podráždění.

Elaeagnus umbellata (EU) je rostlina, která je široce rozšířena po celé Asii a pro své související farmakologické účinky se již dlouho používá jako lidová léčivá rostlina. Květiny a semena z EU se tradičně používaly k léčbě respiračních onemocnění, včetně těch, které postihují srdce a plíce, zatímco listy se používaly jako tonikum a k léčbě střevních onemocnění [12,13]. Kromě toho se EU používá jako myorelaxans, analgetikum, antiulcerózní, antidiabetikum a antipyretikum [14]. Složky EU mají protirakovinné [15], antioxidační a protizánětlivé účinky [16] a extrakt EU ovlivňuje bělení kůže a zlepšení vrásek [17]. Studie týkající se účinku bělení kůže větvemi a listy ve frakcích EU však dosud nebyly provedeny. Účelem této studie proto bylo pozorovat in vitro antioxidační aktivitu a inhibici melanogeneze EU frakcí odvozených z větví a listů na buňkách myšího melanomu B16-F10 produkujících melanin a potvrdit potenciál větví a listů odvozený z EU jako kosmetický prostředek na bělení kůže.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály a činidla

2.2. Příprava EU extraktu a frakcí stejně jako příprava vzorků

Větve a listy (1:1) EU poskytl Jeonbuk Institute for Food Bioindustry (Jeonju, Jeonbuk, Korea). EU (50 g) byla rozemleta pomocí mixéru a EU prášky byly extrahovány 70procentním ethanolem po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo bylo sterilně přefiltrováno přes standardní síto (Advantec MFS, Taipei, Taiwan) a odpařeno za sníženého tlaku za použití rotační odparky (EYELA, N-1110, Tokio, Japonsko). Extrakt byl lyofilizován pomocí lyofilizačního zařízení (OPERON, FDU-8606, Gimpo, Korea), aby se odstranil zbytkový ethanol a získalo se 2,4 g (výtěžek, 4,8 procenta) prášku EU 70% ethanolového extraktu (EUEE). EUEE (2,4 g) byl suspendován v destilované vodě a byl rozdělen mezi ethylacetátové (EUEA, 0,19 g) nebo butanolové (EUBu, 0,91 g) frakce. Všechny extrakty a frakce byly až do použití skladovány při 4 °C.

2.3. Analýza vysoce výkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC).

Chromatografické analýzy byly prováděny za použití systému Elite Lachrom HPLC-DAD vybaveného UV detektorem (Hitachi HighTechnologies Co., Tokyo, Japonsko). Pro kvantifikaci na základě metody vnitřního standardu byl použit UV detektor při 260 nm a analytická kolona YMC ODS-AM (5 mM, 4,6 × 25 0 mM) (Kyoto, Japonsko). Teplota kolony byla 35 °C a průtok mobilní fáze byl 1 ml/min. Eluentem byl gradient rozpouštědla (A)=0,1 procenta kyseliny octové ve vodě a rozpouštědla (B)=0,1 procenta kyseliny octové v acetonitrilu. Doba běhu byla 35 minut a gradient byl následující: (A)/(B)=88/12 (0 min) → (A)/(B)=78/22 (0– 18 min) → (A)/(B)=72/28 (18–28 min) → (A)/(B)=62/38 (28–35 min). HPLC analýza je znázorněna na obrázku 1.

2.4. Buněčná kultura

Buněčná linie myšího melanomu B16-F10 (CRL-6475) byla zakoupena od American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Buňky byly kultivovány v DMEM doplněném 10 procenty teplem aktivovaného FBS a 1 procentem streptomycinu (100 ug/ml)/penicilinu (100 jednotek/ml). Buňky B16-F10 byly inkubovány ve zvlhčeném 5% CO2 při 37 ◦C.

2.5. Test buněčné životaschopnosti

Cytotoxicita vzorků byla hodnocena pomocí MTT testu. Buňky melanomu B16-F10 (1 × 104 buněk/jamka) byly kultivovány v 96-jamkové destičce a inkubovány s různými koncentracemi extraktu a frakcí (12,5, 25, 50 a 100 µg/ml) nebo arbutinu (100 µg/ml) po dobu 24 hodin při 37 ◦C. Po inkubaci bylo do jamek přidáno 500 ug/ml roztoku MTT a destička byla dále inkubována po dobu 4 hodin při 37 °C. Poté bylo médium z každé jamky odstraněno a bylo přidáno 200 ul dimethylsulfoxidu (DMSO), aby se solubilizovaly krystaly formazanu. Absorbance destičky byla detekována při 570 nm na čtečce mikrodestiček (Synergy HTX Multi-Mode Reader, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.6. DPPH Radical Scavenging Activity

Aktivita vychytávání radikálů DPPH extraktu a frakcí EU byla potvrzena měřením redukční síly radikálů DPPH v každém vzorku. Různé koncentrace (12,5, 25 a 5 0 ug/ml) EU extraktu a frakcí nebo 20 ug/ml kyseliny askorbové (pozitivní kontrola) v 500 ul byly přidány do 2 ml 0,15 mM roztoku DPPH. Roztok byl vortexován po dobu 10 s, aby bylo zajištěno důkladné promíchání, a byl inkubován po dobu 30 minut při teplotě místnosti ve tmě. Absorbance směsi byla poté měřena při 517 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Biotek, Winooski, VT, USA).

2.7. ABTS Radical Scavenging Assay

Roztok zachycující radikály ABTS byl připraven smícháním 7,4 mM roztoku ABTS a 2,6 mM persíranu draselného v poměru 1:1 (pH 7,4) a reakcí roztoku při teplotě místnosti po dobu 24 hodin. Roztok ABTS byl poté upraven na absorbanci 0,70 ± 0,03 při 732 nm. Každý 10 ul vzorek reagoval se 190 ul roztoku ABTS po dobu 10 minut při teplotě místnosti a absorbance se měřila při 732 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Biotek, Winooski, VT, USA).

2.8. Aktivita inhibice tyrosinázy hub

K analýze inhibiční aktivity tyrosinázy, která hraje klíčovou roli v melanogenezi, byly použity houbové tyrosinázy a substrát L-DOPA. Nejprve bylo postupně přidáno 15 0 ul 0,1 M fosfátového pufru (pH 6,8), 20 ul 5 mM roztoku L-DOPA a 20 ul různých koncentrací extraktu EU a frakcí a 100 ul 250 K zahájení reakce byla přidána U/ml houbové tyrosinázy. Směsi byly inkubovány při 37 °C po dobu 10 minut a absorbance byla měřena při 475 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Biotek, Winooski, VT, USA). Aktivita inhibice tyrosinázy byla vypočtena pomocí následujícího vzorce:

2.9. Stanovení aktivity buněčné tyrosinázy

Buňky melanomu B16-F10 byly nasazeny v hustotě 1 x 105 buněk/jamka do šestijamkových destiček obsahujících 2 ml DMEM. Bylo založeno šest skupin: kontrolní skupina, neléčená; skupina -MSH, pouze 100 nM -MSH; arbutinová skupina, -MSH a arbutin (10 mM); skupina EUEE, -MSH a extrakt EUEE (12,5, 25 a 50 ug/ml); skupina EUEA, frakce -MSH a EUEA (12,5, 25 a 50 ug/ml); a EUBu skupina, -MSH a EUBu frakce (12,5, 25 a 50 ug/ml). Šestijamkové destičky byly inkubovány přes noc při 37 °C v inkubátoru s 5% CO2. Poté byly buňky vystaveny působení -MSH (100 nM) po dobu 48 hodin a ošetřeny různými koncentracemi EUEE, EUEA a EUBu nebo arbutinu (10 mM) po dobu 24 hodin. Buňky byly třikrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a lyžovány. Lyzát byl centrifugován při 16,000x g po dobu 20 minut.

Dále byl stanoven obsah proteinu v každém lyzátu pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Vantaa, Finsko). Hladiny proteinu byly poté upraveny na 20 µg ve všech vzorcích. Lyzáty (100 ul) obsahující 2,5 mM L-DOPA v 0,1 M fosfátovém pufru byly přeneseny do jamek v 96-jamkové destičce a inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C. Absorbance lyzátů byla měřena při 475 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Biotek, Winooski, VT, USA). Mezibuněčná aktivita tyrosinázy byla vypočtena pomocí následujícího vzorce:

OD představuje absorbanci vzorku a ODb představuje absorbanci kontroly. Jako standard byl použit arbutin.

2.10. Měření obsahu melaninu

Pro stanovení množství melaninu v B16-F10 buňkách byly tyto naočkovány do 24-jamkové destičky v hustotě 2 x 104 buněk/jamku a inkubovány po dobu 24 hodin v DMEM s 10 procenty FBS. Buňky B16-F10 byly předem ošetřeny různými koncentracemi EUEE, EUEA a EUBu (12,5, 25 a 50 ug/ml) a pozitivním kontrolním arbutinem (10 mM) po dobu 1 hodiny, poté reagovaly se 100 nM - MSH na dalších 72 hodin. Poté byly buňky sklizeny po promytí PBS. Peleta získaná centrifugací (12,000xg, 10 min) byla lyžována v 1N NaOH obsahujícím 10 procent DMSO při 90 °C po dobu 30 min. Obsah melaninu v každé jamce byl měřen při 405 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Biotek, Winooski, VT, USA). Pro stanovení množství melaninu byla celková množství produkovaná během experimentu považována za standard (100 procent) a míra inhibice každé skupiny ošetřené extraktem a frakcí byla stanovena v poměru k tomuto standardu.

2.11. Analýza Western Blot

Buňky myšího melanomu B{{0}}F10 (1 × 106 buněk/jamka) byly kultivovány v 6 cm miskách a inkubovány přes noc při 37 °C a buňky byly předem ošetřeny -MSH (10 uM) po dobu 24 h. Poté byly buňky ošetřeny různými koncentracemi (12,5, 25 a 50 ug/ml) EU extraktu a frakcí nebo 100 ug/ml arbutinu po dobu 24 hodin. Buňky byly sklizeny pomocí PBS a poté centrifugovány při 12,000x g po dobu 15 minut při 4 °C. Po odstranění supernatantu byly buňky lyžovány za použití ledově chladného Pro-prep proteinového lyzačního pufru s přídavkem 1 procenta inhibitorů proteázy a fosfatázy a ponechány na ledu po dobu 40 minut. Frakcionované proteiny byly kvantifikovány pomocí Bradfordova proteinového testu. Stejná množství proteinů (25 ug) byla nanesena a separována 8 procent nebo 10 procent dodecylsulfát sodný-polyakrylamidová gelová elektroforéza a přenesena na polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu. PVDF membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku (TBS) s 0,1% Tween 20 (TBS-T) pufrem po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě a inkubovány se specifickými primárními protilátkami proti p-CREB, CREB, p -ERK, ERK, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosináza a -aktin přes noc při 4 ◦C.

Poté byly membrány třikrát promyty TBS-T pufrem po dobu 10 minut a ponechány reagovat po dobu 2 hodin se sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou při teplotě místnosti. Membrány byly pětkrát propláchnuty pufrem TBS-T a proteiny byly detekovány pomocí vylepšeného chemiluminiscenčního roztoku. Obrázky pásů byly získány pomocí Davinch-In vivo a západního zobrazovacího systému (Davinch-K, Soul, Korea).

2.12. Statistická analýza

Všechny hodnoty jsou uvedeny jako průměry ± SEM (standardní chyba průměru) alespoň tří nezávislých experimentů a pro statistickou analýzu byl použit software GraphPad Prism 5.{1}} (GraphPad, San Diego, CA, USA). K porovnání statistických rozdílů mezi skupinami byla použita jednocestná analýza rozptylu následovaná Bonferroniho post hoc analýzou. Za statisticky významnou byla považována p-hodnota menší než 0.05 (p < 0,05).

3. Výsledky

3.1. HPLC analýza EU

Konečné výtěžky (v procentech) EUEE, EUEA a EUBu byly 4,8 procenta, 0,18 procenta a 1,82 procenta, v daném pořadí na základě čerstvé hmotnosti. HPLC byla použita k analýze obsahu luteolinu, indikátorové sloučeniny EU extraktu a frakcí. Ve srovnání s píkem standardní složky byl potvrzen pík luteolinu v EU extraktu a frakcích. Koncentrace luteolinu v EUEE, EUEA a EUBu byla 499,03, 1948,05 a 994.00 mg/ml (obrázek 1).

3.2. Vliv EU na antioxidační aktivitu a inhibiční aktivitu tyrosinázy

Antioxidační aktivity různých koncentrací EUEE, EUEA a EUBu byly měřeny pomocí testu DPPH/ABTS. Aktivity EUEE, EUEA a EUBu pohlcující radikály DPPH a ABTS se zvýšily v závislosti na dávce (obrázek 2A, B), s kyselinou askorbovou jako pozitivní kontrolou. Aktivity vychytávání radikálů DPPH a ABTS při 50 ug/ml EU extraktu a frakcí byly obě vyšší a vykazovaly podobné výsledky jako pozitivní kontrola, kyselina askorbová. Pro měření inhibičního účinku enzymů zprostředkovaných melanogenezí v EU extraktu a frakcích byl proveden test inhibice tyrosinázy hub (obrázek 2C) s L-DOPA jako substrátem za bezbuněčných podmínek. Výsledky ukázaly, že tyrosinázová aktivita byla inhibována EU extraktem a frakcemi v závislosti na dávce. Zejména inhibiční aktivita tyrosinázy 50 ug/ml EUextraktu a frakcí vykazovala podobné výsledky jako arbutin,

Inhibiční účinek EU na tyrosinázu tedy souvisí s oxidací L-DOPA na chinon DOPA při melanogenezi Celkově měly EU frakce větší antioxidační a tyrosinázový inhibiční účinek než extrakt. Navíc EU frakce, zejména EUBu, začaly vykazovat podobné účinky jako pozitivní kontrolní skupina v dávce 25 ug/ml.

Obrázek 2. Antioxidační aktivity a inhibiční aktivita houbové tyrosinázy EU. Radikální vychytávací aktivita DPPH (A) a ABTS (B) extraktu a frakcí EU. Kyselina askorbová (20 ug/ml) byla použita jako pozitivní kontrola. Inhibiční účinek na tyrosinázu pomocí L-DOPA extraktu a frakcí EU (C). Arbutin (10 mM) byl použit jako pozitivní kontrola. Všechny grafy ukazují procenta kontroly a data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM (n=3). Statistická významnost byla stanovena na * p < 0,05, ** p < 0,01 a *** p < 0,001 ve srovnání se skupinou s kyselinou askorbovou nebo arbutinem.

3.3. Vliv EU na životaschopnost buněk B16-F10

K posouzení buněčné cytotoxicity EU byly buňky melanomu B16-F10 ošetřeny různými koncentracemi (12,5, 25, 50 a 100 ug/ml) extraktu a frakcí EU po dobu 24 hodin a životaschopnost buněk byla analyzována pomocí MTT test. Výsledky jsou uvedeny jako procento životaschopnosti buněk vzhledem ke kontrole. EU extrakt a frakce nebyly cytotoxické v testovaném koncentračním rozmezí 12 5 50 ug/ml až B16-F10 buněk. Cytotoxicita však byla potvrzena u buněk B16-F10 při koncentraci 100 ug/ml EU frakcí (EUEA a EUBu) (obrázek 3). Proto byly provedeny následné experimenty s použitím koncentrací 12,5, 25 a 50 ug/ml EU extraktu a frakcí.

3.4. Vliv EU na syntézu melaninu

Pro stanovení antimelanogenního účinku EU byl zkoumán inhibiční účinek extraktu EU a frakcí na syntézu melaninu v buňkách B16-F10. Buňky B16-F10 byly ošetřeny extraktem EU a frakcemi při 12,5, 25 a 50 ug/ml nebo arbutinem při 10 mM po dobu 1 hodiny a poté byly stimulovány -MSH (100 mM) po dobu 72 hodin . Obsah melaninu se zvýšil o 305,44 procent při stimulaci pomocí -MSH ve srovnání s obsahem kontroly (obrázek 4A). Avšak skupiny léčené EU při koncentraci 50 ug/ml měly významně snížený obsah melaninu ve srovnání s obsahem skupiny stimulované pouze -MSH a výsledky byly podobné jako u kontrolní skupiny. Kromě toho ve srovnání s kontrolou pozitivní na arbutin vykazovaly EU frakce v koncentraci 50 ug/ml nižší úroveň produkce melaninu. V souladu s těmito výsledky, jak se koncentrace extraktu EU a frakcí zvyšovaly, zvyšovala se rychlost inhibice syntézy melaninu v buňkách B16-F10 (obrázek 4B).

Zejména rychlost inhibice syntézy melaninu ve frakcích EU při koncentraci 50 ug/ml byla významně vyšší než u arbutinu. Proto měly EU frakce významný na dávce závislý inhibiční účinek na syntézu melaninu v buňkách melanomu B16-F10.

3.5. Vliv EU na syntézu melaninu a aktivitu buněčné tyrosinázy

Potvrdili jsme vliv EU extraktu a frakcí na intracelulární aktivitu tyrosinázy zapojenou do mechanismu melanogeneze v buňkách melanomu B16-F10. Všechny skupiny, kromě kontroly, byly stimulovány a-MSH (100 nM) po dobu 48 hodin a poté ošetřeny různými koncentracemi EU extraktu a frakcí (12,5, 25 a 50 ug/ml) nebo arbutinem ( 10 mM) po dobu 24 hodin. V důsledku toho extrakt a frakce EU významně inhibovaly tyrosinázovou aktivitu indukovanou MSH v buňkách B16-F10 způsobem závislým na dávce (obrázek 4C). Intracelulární aktivita tyrosinázy se zvýšila o 251,00 procent při stimulaci a-MSH ve srovnání s kontrolou. Avšak skupiny léčené EU při koncentraci 50 ug/ml významně snížily aktivitu tyrosinázy ve srovnání s aktivitou skupiny stimulované pouze a-MSH.

Aktivita tyrosinázy byla tedy inhibována v závislosti na dávce ošetřením EU v buňkách B16-F10 a účinek byl zvláště silný při kon. centrování 50 ug/ml. Inhibice aktivity tyrosinázy EUEE v koncentraci 50 ug/ml byla nižší než u arbutinu (85,13 procenta), zatímco inhibice aktivity tyrosinázy u frakcí EU (EUEA a EUBu) byla vyšší než u arbutinu (121,99 a 128,11 procenta). , respektive). V souladu s těmito výsledky, jak se koncentrace extraktu EU a frakcí zvyšovaly, zvyšovala se míra inhibice aktivity intracelulární tyrosinázy v buňkách B16-F10 (obrázek 4D).

Obrázek 4. Syntéza melaninu a aktivity buněčné tyrosinázy EU. Obsah melaninu v EU extraktu a frakcích v B16-F10 melanomových buňkách (A). Rychlost inhibice syntézy melaninu EU extraktu a frakcí v B16-F10 melanomových buňkách (B). Intracelulární tyrosinázová aktivita EU extraktu a frakcí v B16-F10 melanomových buňkách (C). Míra inhibice intracelulární tyrosinázové aktivity EU extraktu a frakcí v B16-F10 melanomových buňkách (D). Výsledky (A, C) jsou uvedeny jako procenta na základě skupiny -MSH. Výsledky (B, D) jsou uvedeny jako procenta na základě kontrolní skupiny. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM (n=3). Statistická významnost byla stanovena na *** p < 0,001 ve srovnání s buňkami B16-F10 stimulovanými -MSH a # p < 0,05, ## p < 0,01 a ### p < 0,001 ve srovnání s skupina arbutinu.

3.6. Vliv EU na expresi CREB a ERK proteinů souvisejících s melanogenezí

Melanogeneze chrání lidskou pokožku před různými vnějšími podněty a na tomto procesu se podílejí různé mechanismy. -MSH, hormon zapojený do první fáze melanogeneze, stimuluje melanocyty k fosforylaci CREB a ERK, čímž indukuje syntézu down-signálních proteinů spojených s melanogenezí [18]. V této studii jsme zkoumali proteiny regulované melanogenezí, včetně CREB a ERK, abychom určili mechanismus inhibice melanogeneze EU na syntézu melaninu indukovanou -MSH v buňkách melanomu B16-F10. V důsledku toho jsme potvrdili, že fosforylace CREB a ERK se významně zvýšila, když byly buňky B16-F10 stimulovány pomocí -MSH. Nicméně, když byly buňky ošetřeny EU extraktem a frakcemi, -MSH-indukovaná fosforylace byla potlačena způsobem závislým na dávce. Zejména je vidět, že extrakt EU a frakce o koncentraci 50 µg/ml jsou nejúčinnější mezi různými koncentracemi ošetření (obrázek 5A–D).

3.7. Vliv EU na expresi MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázových proteinů souvisejících s melanogenezí

Aby se zjistilo, zda extrakt a frakce EU ovlivňují expresi proteinů souvisejících s melanogenezí indukovanou -MSH, byl proveden western blotting, aby se vyhodnotila exprese proteinů MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy. Hladiny všech proteinů souvisejících s melanogenezí byly významně zvýšeny stimulací -MSH, ale extrakt a frakce EU účinně potlačovaly expresi MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázových proteinů u -MSH-stimulovaných Buňky B16-F10 (obrázek 6). V souladu s předchozími výsledky, zejména s většinou extraktů a frakcí EU při 50 ug/ml, byla exprese těchto proteinů více inhibována než ta, která byla zjištěna po ošetření pozitivním kontrolním arbutinem. Kromě toho ošetření frakcemi EU vyvolalo větší účinek při stejné koncentraci ve srovnání s extraktem EU.

Obrázek 6. Inhibiční účinek EU na expresi proteinů MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy související s melanogenezí. Reprezentativní obrázek pásma Western blotting MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy EUEE (A), EUEA (B) a EUBu (C). Při použití programu GelQuantNET je relativní intenzita pásma Western blotting znázorněna jako následující sloupcový graf; MITF/ -aktin, TRP-1/ -aktin, TRP-2/ -aktin a tyrosináza/ -aktin. -aktin byl použit jako vnitřní kontrola westernového přenosu. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM (n=3). Statistická významnost byla nastavena na * p < 0.{16}}5, **p < 0,01 a *** p < 0,001 ve srovnání s B{ stimulovanou -MSH {22}}Buňky F10.

4. Diskuze

Melanocyty se nacházejí v základní vrstvě kůže a stupeň syntézy melaninu v melanocytech určuje barvu lidské kůže [19]. Melanin je kožní pigment, který chrání pokožku tím, že snižuje množství ROS generovaných škodlivými ultrafialovými paprsky. Když je kůže vystavena UV záření, aktivuje se a-MSH, který stimuluje melanocyty, a melanocyty produkují melanin (20). Nadměrná produkce melaninu však může způsobit pigmentaci kůže a způsobit estetické problémy.

Vazba a-MSH na melanocytový receptor melanocytově specifický melanokortin-1 receptor (MC1R) aktivuje signalizační protein adenylátcyklázu a zvyšuje intracelulární hladiny cAMP 121]. Se zvyšováním hladiny cAMP v melanocytech se aktivují signální dráhy CREB a ERK, které podporují produkci proteinů zapojených do melanogeneze. 18,22]. Tato aktivovaná signální dráha CREB a ERK up-reguluje expresi MITF a následně podporuje expresi TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy (23MITF je transkripční faktor pro regulaci tyrosinázy a hraje ústřední roli při regulaci syntézy melaninu, včetně regulace proliferace, diferenciace a přežití melanocytů (24). Tento protein nejen reguluje melanogenezi regulací subproteinů, včetně TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy, ale podílí se také na regulaci progrese buněčného cyklu (25]. Celkově vzato, vazba a-MSH-MC1R způsobená vnější stimulací, jako je UV záření, aktivuje především signální dráhy CREB a ERK v melanocytech, čímž zvyšuje expresi MITF, TRP -1, TRP-2 a tyrosinázové proteiny k indukci produkce melaninu. Inhibice tohoto procesu proto může vést k inhibici syntézy melaninu v melanocytech.

V současnosti jsou různá používaná činidla pro bělení kůže, včetně hydrochinonu a hydrokortizonu, většinou škodlivé chemikálie a dlouhodobé užívání může způsobit nežádoucí účinky, včetně podráždění kůže a svědění [1,26–28]. Proto je nutné zaměřit se na vývoj bezpečných a účinných přírodních látek pro bělení kůže s minimálními vedlejšími účinky jako EU [29].

V této studii jsme zkoumali, jak EU frakce inhibují procesy syntézy melaninu a snižují produkci melaninu, což má za následek efekt bělení kůže u buněk melanomu B16-F10.

Vzhledem k tomu, že oxidační stres způsobený UV zářením indukuje ukládání melaninových pigmentů, aktivita vychytávání radikálů a inhibice aktivity ROS jsou účinné při potlačování melanogeneze a přírodní produkty s takovou antioxidační aktivitou mohou mít vynikající bělící účinky [30,31]. Nejprve jsme proto zkoumali antioxidační aktivitu extraktu a frakcí EU v buňkách melanomu B16/F10 pomocí testů DPPH a ABTS, což jsou běžné a jednoduché metody pro analýzu antioxidační aktivity rostlin in vitro. DPPH je stabilní volný radikál a používá se k analýze aktivity vychytávání radikálů hydrofobních sloučenin pomocí redukčních činidel, jako je kyselina askorbová a tokoferol. Test ABTS může měřit aktivitu vychytávání radikálů pro hydrofobní a hydrofilní sloučeniny, antioxidanty narušující řetězce a antioxidanty poskytující vodík [24]. Potvrdili jsme vysokou aktivitu vychytávání radikálů DPPH a ABTS extraktů a frakcí EU. Zejména účinky byly nejsilnější při koncentraci 50 µg/ml a EU frakce měly lepší antioxidační aktivitu ve srovnání s extraktem.

Tyrosináza je hlavním enzymem zapojeným do melanogeneze a mnoho činidel pro bělení kůže je primárně inhibitory tyrosinázy. Proto jsme zkoumali vliv EU frakcí na aktivitu tyrosinázy, která podporuje melanogenezi. Potvrdili jsme inhibiční účinek L-DOPA na aktivitu buněčné tyrosinázy, abychom určili, zda extrakt a frakce EU přímo inhibují aktivitu tyrosinázy. Výsledkem bylo, že extrakt a frakce EU zaznamenaly zvýšení inhibičního účinku na tyrosinázu v závislosti na dávce. Navíc, v souladu s výše uvedenými výsledky, EU byla nejúčinnější při koncentraci 50 µg/ml a EU frakce měly větší účinek než extrakt. Zejména koncentrace EUBu (50 ug/ml) měla větší účinek než koncentrace arbutinu, což je pozitivní kontrola.

Dále jsme zkoumali účinek EU extraktu a frakcí na bělení kůže na melanogenezi v buňkách melanomu B16-F10 indukované -MSH. Nejprve jsme použili MTT test ke stanovení koncentračního rozmezí, ve kterém EU extrakt a frakce byly necytotoxické pro B16-F10 buňky. Naše výsledky potvrdily, že v koncentračním rozmezí 12,5 až 50 µg/ml nebyla žádná cytotoxicita.

Po stimulaci buněk B16-F10 pomocí -MSH k indukci syntézy melaninu byl identifikován účinek EU extraktu a frakcí na bělení kůže na obsah melaninu a aktivitu intracelulární tyrosinázy. Vzory EU extraktu a frakcí na obsah melaninu a aktivitu intracelulární tyrosinázy ukázaly podobné výsledky. Ošetření všemi EU extrakty a frakcemi ukázalo, že obsah melaninu a intracelulární aktivita tyrosinázy byly potlačeny v závislosti na dávce. Konkrétně při koncentraci 50 ug/ml EU frakcí byla pozorována více než 50procentní ztráta obsahu melaninu a intracelulární tyrosinázové aktivity ve srovnání se skupinou stimulovanou pouze -MSH (obrázek 4A, C).

Signální dráhy CREB a ERK jsou hlavní signální dráhy, které jsou aktivovány stimulací -MSH v melanogenezi. Klíčovou roli v procesu syntézy melaninu proto hrají CREB a ERK, které se účastní různých mechanismů. Stimulace -MSH v melanomových buňkách B16-F10 zvýšila expresi MITF a rodiny genů tyrosinázy související s melanogenezí (TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy) prostřednictvím aktivace CREB a ERK. V této studii poskytujeme důkazy, že extrakt a frakce EU inhibují syntézu melaninu, jakož i zapojené upstream signální dráhy, CREB a ERK.

Když byly hladiny TRP-1 a TRP-2 zvýšeny regulovanou expresí MITF, byla podporována exprese tyrosinázy a enzymy související s melanogenezí produkovaly melanin [18,32]. Exprese proteinů zprostředkovaných melanogenezí byla pozorována pomocí western blottingu ke stanovení antimelanogenního účinku extraktu EU a frakcí v buňkách melanomu B16-F10. Naše výsledky potvrdily, že exprese proteinů MITF, TRP-1, TRP-2 a tyrosinázy se významně zvýšila ve skupině stimulované -MSH.

Ošetření extraktem a frakcemi EU však snížilo expresi těchto proteinů souvisejících s melanogenezí způsobem závislým na dávce. Zejména byl pozorován významný pokles exprese při koncentraci 50 ug/ml EU frakcí. Naše výsledky ukazují, že 50 ug/ml EU frakcí inhibovalo expresi MITF, důležitého transkripčního faktoru, který významně inhibuje expresi tyrosinázy, a tím inhibuje produkci melaninu.

Na základě těchto výsledků jsme zjistili, že 50 µg/ml EU frakcí inhibovalo produkci -MSH-stimulované produkce melaninu v B16-F10 melanomových buňkách snížením signalizace související s melanogenezí na základě vynikajícího antioxidačního účinku. Naše výsledky proto naznačují, že EU frakce může být potenciálním kandidátem na bělící léčbu, která účinně kontroluje melanogenezi.5. Závěry

V této studii jsme hodnotili antioxidační a antimelanogenní účinky na melanogenezi indukovanou -MSH v buňkách melanomu B16-F10, abychom potvrdili funkci EU frakcí jako činidel pro bělení kůže. Závěrem jsme zjistili, že EU frakce mají silné antioxidační účinky a inhibují proteiny související s melanogenezí, jako je TRP-1, TRP-2 a tyrosináza, regulací MITF, a jsou tedy cennými přírodními inhibitory melanogeneze.

K inhibici syntézy melaninu v buňkách B16F10 stimulovaných -MSH byla nutná koncentrace (50 ug/ml) EU extraktu a frakcí. Kromě toho jsme potvrdili, že EU frakce mají vynikající antioxidační a inhibiční účinky na produkci melaninu. V důsledku toho by EU mohla být užitečná pro terapeutická činidla na přírodní bázi pro léčbu kožních onemocnění a jako činidla pro bělení kůže v kosmetickém průmyslu.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, J.-HL a D.-KK; Správa dat, BL; Formální analýza, J.-HL; Akvizice financování, Y.-ML; Investigation, J.-HL a Y.-DJ; Metodika, BL, H.-WS a B.-JS; Administrace projektu, Y.-ML a D.-KK; Software, D.-KK; Supervision, Y.-ML a D.-KK; Vizualizace, J.-HL; Psaní – původní návrh, J.-HL; Psaní – recenze a úpravy, J.-HL a Y.-DJ Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování:

Tento výzkum byl podpořen Ministerstvem obchodu, průmyslu a energetiky (MOTIE), Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) prostřednictvím programu podpory pro regiony průmyslové spolupráce (P0004749).

Střet zájmů:

Autoři prohlašují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Vzorová dostupnost:

Vzorky sloučenin nejsou u autorů k dispozici.

Zkratky

-MSH -hormon stimulující melanocyty

CREB cAMP protein vázající prvek odpovědi

DOPA 3,4-dihydroxyfenylalanin

EU Elaeagnus umbellata

EUEE EU 70% etanolový extrakt

Ethylacetátová frakce EUEA EU

EUBu EU butanolová frakce

MC1R melanocytově specifický melanokortin-1 receptor

MITF Transkripční faktor spojený s mikroftalmií

ROS Reaktivní formy kyslíku

TRP Protein související s tyrosinázou

Reference

1. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Přehled přípravků na bělení pokožky s náhledem na nelegální kosmetický trh v Evropě. J. Eur. Akad. Dermatol. Venereol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

2. Costin, GE; Sluch, VJ Pigmentace lidské kůže: Melanocyty upravují barvu kůže v reakci na stres. Faseb J. 2007, 21, 976–994. [CrossRef]

3. Lin, YS; Wu, WC; Lin, SY; Hou, WC Glycinhydroxamát inhibuje aktivitu tyrosinázy a obsah melaninu prostřednictvím downregulace signálních drah cAMP/PKA. Aminokyseliny 2015, 47, 617–625. [CrossRef]

4. Fernandez-Garcia, E. Ochrana kůže proti UV záření dietními antioxidanty. Jídlo. Funct. 2014, 5, 1994–2003. [CrossRef]

5. Kowalska, J.; Banach, K.; Rok, J.; Beberok, A.; Rzepka, Z.; Wrze´sniok, D. Molekulární a biochemické základy fototoxicity indukované fluorochinolony — Studium antioxidačního systému v lidských melanocytech vystavených UV-A záření. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 9714. [CrossRef] [PubMed]

6. MatÉs, JM; Pérez-Gómez, C.; Castro, IND Antioxidační enzymy a lidská onemocnění. Clin. Biochem. 1999, 32, 595-603. [CrossRef]

7. Bickers, DR; Athar, M. Oxidační stres v patogenezi kožních onemocnění. J. Investig. Dermatol. 2006, 126, 2565–2575. [CrossRef]

8. Kim, YJ; Uyama, H. Inhibitory tyrosinázy z přírodních a syntetických zdrojů: Struktura, mechanismus inhibice a perspektiva do budoucna. Buňka. Mol. Life Sci. 2005, 62, 1707–1723. [CrossRef]

9. Pillaiyar, T.; Maničkam, M.; Namasivayam, V. Činidla pro bělení kůže: perspektiva inhibitorů tyrosinázy z lékařské chemie. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

10. Smit, N.; Vilanová, J.; Pavel, S. Honba za přírodními prostředky pro bělení kůže. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 5326–5349. [CrossRef]

11. Draelos, ZD Přípravky pro zesvětlení pleti a kontroverze hydrochinonu. Dermatol. Ther. 2007, 20, 308–313. [CrossRef]

12. Anna, MI; Chiara, G.; Marinella, DL; Deborah, P.; Fabiano, C.; Nunziatina, DT; Claudia, M.; Maria, LT; Alessandra, B. Antioxidační aktivita sloučenin izolovaných z Elaeagnus umbellata podporuje pohodu lidských gingiválních fibroblastů. J. Nat. Prod. 2020, 83, 626–637.

13. Sabir, SM; Dilnawaz, S.; Imtiaz, A.; Hussain, M.; Kaleem, MT Antibakteriální aktivita Elaeagnus umbellata (Thunb.) léčivé rostliny z Pákistánu. Saudská Arábie. Med. J. 2007, 28, 259–263.

14. Nazir, N.; Záhoř, M.; Nisar, M.; Khan, I.; Karim, N.; Abdel-Halim, H.; Ali, A. Fytochemická analýza a antidiabetický potenciál Elaeagnus umbellata (Thunb.) u streptozotocinem indukovaných diabetických potkanů: Farmakologický a výpočetní přístup. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2018, 18, 332. [CrossRef]

15. Wang, SY; Bowman, L.; Ding, M. Variace v kapacitě vychytávání volných radikálů a antiproliferativní aktivitě mezi různými genotypy olivy podzimní (Elaeagnus umbellate). Planta. Med. 2007, 73, 468–477. [CrossRef] [PubMed]

16. Nazir, N.; Záhoř, M.; Nisar, M.; Karim, N.; Latif, A.; Ahmad, S.; Uddin, Z. Hodnocení neuroprotektivních a anamnestických účinků Elaeagnus umbellate Thunb. O skopolaminem indukovaném poškození paměti u myší. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2020, 20, 143.

17. Park, SH; Jhee, KH; Yang, SA Ochranné účinky ethanolového extraktu z listů Elaeagnus umbellata na produkci melaninu indukovanou MSH v B16-F0 buňkách a poškození vyvolané UVB v buňkách CCD-986sk. J. Life Sci. 2019, 29, 555–563.

18. Qian, W.; Liu, W.; Zhu, D.; Cao, Y.; Tang, A.; Gong, G.; Su, H. Přírodní sloučeniny pro bělení kůže pro léčbu melanogeneze (Přehled). Exp. Ther. Med. 2020, 20, 173–185. [CrossRef]

19. Gillbro, JM; Olsson, MJ Melanogeneze a mechanismy činidel zesvětlujících pokožku – existující a nové přístupy. Int. J. Cosmet. Sci. 2011, 33, 210–221. [CrossRef]

20. Saba, E.; Kim, SH; Lee, YY; Park, CK; Oh, JW; Kim, TH; Kim, HK; Roh, SS; Výtažek z korejského červeného ženšenu Rhee, MH zlepšuje melanogenezi u lidí a vyvolává účinky proti stárnutí u ultrafialově ozářených bezsrstých myší. J. Ginseng. Res. 2020, 44, 496–505. [CrossRef] [PubMed]

21. Bertolotto, C.; Abbe, P.; Hemesath, TJ; Bille, K.; Fisher, DE; Ortonne, JP; Ballotti, R. Genový produkt mikroftalmie jako signální převodník v cAMP-indukované diferenciaci melanocytů. J. Cell. Biol. 1998, 142, 827–835. [CrossRef]

22. Lee, HJ; Lee, WJ; Chang, SE; Lee, GY Hesperidin, oblíbený antioxidant inhibuje melanogenezi prostřednictvím erk1/2 zprostředkované degradace MITF. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 18384–18395. [CrossRef]

23. Cena, ER; Horstmann, MA; Wells, AG; Weilbaecher, KN; Takemoto, CM; Landis, MW; Fisher, DE signalizace hormonu stimulujícího alfa-melanocyty reguluje expresi mikroftalmie, genu deficitního u Waardenburgova syndromu. J. Biol. Chem. 1998, 273, 33042–33047. [CrossRef]

24. Vance, KW; Goding, ČR Transkripční síť regulující vývoj melanocytů a melanom. Pigment. Buňka. Res. 2004, 17, 318–325. [CrossRef]

25. Bondurand, N.; Pingault, V.; Goerich, DE; Lemort, N.; Sock, E.; Le Caignec, C.; Wegner, M.; Goossens, M. Interakce mezi SOX10, PAX3 a MITF, tři geny změněné u Waardenburgova syndromu. Hučení. Mol. Genet. 2000, 9, 1907–1917. [CrossRef]

26. McGregor, D. Hydroquinone: An Evaluation of the Human Risks from its Carcinogenic and Mutagenic Properties. Crit. Rev. Toxicol. 2007, 37, 887–914. [CrossRef]

27. Kolbe, L.; Kligman, AM; Schreiner, V.; Stoudemayer, T. Kortikosteroidy indukovaná atrofie a poškození bariéry měřené neinvazivními metodami na lidské kůži. Kůže. Res. Technol. 2001, 7, 73–77. [CrossRef] [PubMed]

28. Huang, HC; Chang, SJ; Wu, CY; Ke, HJ; Chang, TM [6]-Shogaol inhibuje melanogenezi indukovanou -MSH prostřednictvím urychlení degradace MITF zprostředkované ERK a PI3K/Akt. Biomed. Res. Int. 2014, 2014, 842569. [CrossRef]

29. Ozen, T.; Yenigun, S.; Altun, M.; Demirtas, I. Fytochemické složky, ChE a inhibice ureázy, antiproliferační a antioxidační vlastnosti Elaeagnus umbellata Thunb. Hřeben. Chem. Vysoký. Propustnost. Obrazovka. 2017, 20, 559–578. [CrossRef]

30. Floegel, A.; Kim, DO; Chung, SJ; Koo, SI; Chun, OK Srovnání testů ABTS/DPPH pro měření antioxidační kapacity v oblíbených potravinách v USA bohatých na antioxidanty. J. Food Compos. Anální. 2011, 24, 1043–1048. [CrossRef]

31. Hseu, YC; Chen, XZ; Gowrisankar, YV; Yen, HR; Chuang, JY; Yang, HL Účinky ektoinu na bělení kůže prostřednictvím potlačení melanogeneze stimulované -MSH a aktivace antioxidačních drah Nrf2 v keratinocytech ozářených UVA. Antioxidanty 2020, 9, 63. [CrossRef] [PubMed]

32. Jang, EJ; Shin, Y.; Park, HJ; Kim, D.; Jung, C.; Hong, JY; Kim, S.; Lee, SK Antimelanogenní aktivita fytosfingosinu prostřednictvím modulace signální dráhy transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií. J. Dermatol. Sci. 2017, 87, 19–28. [CrossRef] [PubMed]

Ji-Hyun Lee 1,†, Bori Lee 2,†, Yong-Deok Jeon 3, Hyun-Woo Song 2, Young-Mi Lee 2, Bong-Joon Song 4 a Dae-Ki Kim 1,*

1 Department of Immunology and Institute of Medical Science, Jeonbuk National University Medical School, 20, Geonji-ro, Deokjin-gu, Jeonju-si 54907, Jeollabuk-do, Korea; jihyunsh1211@naver.com

2 Department of Oriental Pharmacy, College of Pharmacy a Wonkwang-Oriental Medicines Research Institute, Wonkwang University, Iksan 54538, Jeonbuk, Korea; leebori1004@naver.com (BL); cristblack@naver.com (H.-WS); ymlee@wku.ac.kr (Y.-ML)

3 Katedra korejské farmacie, Univerzita Woosuk, 443 Samnye-ro, Samnye-up, Wanju-Gun 55338, Jeollabuk-do, Korea; ydjeon1211jh@woosuk.ac.kr

4 Department of Food Science and Biotechnology, Wonkwang University, Iksan 54538, Jeonbuk, Korea; twinf1@hanmail.net

Korespondence: daekim@jbnu.ac.kr; Tel.: plus 82-63-2703080

Tito autoři se na této práci podíleli stejnou měrou.

For more information:1950477648nn@gmail.com