Inhibice agregace beta amyloidu a usazování vodného extraktu Cistanche Tubulosa

1. Úvod

Demence je jednou z nejčastějších chorob chronického stárnutí. Světová zpráva o Alzheimerově chorobě v roce 2015 odhaduje, že demencí trpělo asi 46,8 milionu lidí a očekává se, že v roce 2030 to bude 74,7 milionu a v roce 2050 131,5 milionu. Celosvětová populace demencí se bude rok od roku zvyšovat a v budoucnu se vymkne kontrole. . Globální výdaje na zdravotní péči na léčbu demence byly v roce 2010 téměř 604 miliard amerických dolarů a očekává se, že v roce 2030 to bude 1000 miliard. U pacientů s demencí je vyšší riziko náhodné smrti, a proto vyžadují více lékařské péče. To je velká zátěž pro rodinné pečovatele pacientů s demencí. Dopad demence na pečovatele, rodinu a společnost může způsobit velký fyzický, psychický, životní a ekonomický stres. Existují dvě hlavní formy demence, Alzheimerova choroba (AD) a vaskulární demence. AD je nejčastější demencí a je ireverzibilní a progresivní neurodegenerativní poruchou. AD byla v roce 2015 šestou nejčastější příčinou úmrtí ve Spojených státech.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO PREVENCI AD PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Nedávné studie podporují, že neuronová toxicita indukovaná amyloidním peptidem (A ) (plaky) a agregací proteinu tau (tangles) úzce souvisí s patogenezí AD. Akumulace A a proteinu tau v mozku může vést k poškození neuronů a ztrátě paměti. Nerozpustné oligomery A se agregují v extracelulárních placích a bylo popsáno, že vedou k synaptické dysfunkci, neuronové toxicitě a buněčné smrti. Bohužel zatím není k dispozici žádná účinná léčba, která by odstranila A a protein tau, inhibovala tvorbu nebo oligomerizaci A a pozastavila nebo vyléčila nevratné poškození neuronů. Současná terapeutická činidla, jako je galantamin a donepezil, které jsou inhibitory acetylcholinesterázy, mohou pouze dočasně zmírnit ztrátu paměti zvýšením hladiny neurotransmiterů. V roce 2012 nebyly žádné kandidátní léky schopné snížit účinek A ve velkých klinických studiích pacientů s AD. Proto je naléhavě zapotřebí výzkum nové léčby k potlačení prevalence Alzheimerovy choroby. Kovové ionty byly nedávno považovány za klíčový faktor úzce související s agregací A. Kovové chelátory považované za potenciální sloučeniny olova poskytují zcela novou strategii pro přístup proti AD.

Sušený stonek Cistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, se hojně sklízí v poušti Xhinjang v Číně. Jde o významnou tradiční čínskou medicínu, která patří k tonizující čínské medicíně indexované v Čínském lékopisu a používaná po tisíce let k léčbě fyzické slabosti, nedostatku ledvin, neplodnosti, zapomnětlivosti, impotence a stařecké zácpy.Vodný extrakt C. tubulosa (CTE)tobolky byly v Číně schváleny jako botanický lék na vaskulární demenci. Podle klinické studie s 18 pacienty s diagnostikovanou mírnou až středně těžkou AD poskytly kapsle CTE pacientům stabilnější stav paměti ve srovnání s inhibitory acetylcholinesterázy. V naší předchozí studii CTE snížil ukládání amyloidního peptidu (A) a zlepšil ztrátu paměti u potkanů ​​podobných Alzheimerově chorobě. Fenylethanoidové glykosidy, echinakosid (1), akteosid (2) a isoakteosid (3) jsou považovány za hlavní složky CTE. Sloučenina 1 má neuroprotektivní aktivitu proti toxicitě 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP), 1-methyl{{13 }}fenylpyridiniový ion (MPP+) a 6-hydroxydopamin (6-OHDA). Naše předchozí zpráva ukázala, že 1 potlačil oligomerizaci a toxicitu A ve studii in vitro a inhiboval ukládání A, zlepšil zhoršenou paměť a kognitivní dysfunkci u potkanů ​​indukovaných A. Sloučeniny 2 a 3 zvýšily degradaci A a snížily oligomerizaci A in vitro. Sloučenina 3 snížila ukládání A u A-indukovaných krys. Na základě těchto studií již C. tubulosa prokázala, že má potenciál léčit AD. CTE úzce souvisí s anti-A agregací a depozicí. Abychom lépe porozuměli mechanismu CTE, potřebujeme mít pohodlnou a účinnou metodu k identifikaci aktivní složky i obsahu ve vzorcích mozkové tkáně. Většina studií byla navržena pro kvantitativní stanoveníechinakosid, akteosid a isoakteosid v bylináchnebo potraviny pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), ale pouze dvě studie se týkaly stanovení v séru nebo tkáních. Neexistuje však žádná zpráva o simultánní analýze 1–3 v mozkových tkáních po perorálním podání CTE. Z nedávných studií navíc stále není jasné, zda aktivní složky CTE nebo jejich metabolity úspěšně prošly hematoencefalickou bariérou a působily na mozkové neurony. Proto tento výzkum poskytuje pokročilou a citlivou metodu s přesvědčivými důkazy, které jasně ilustrují základní mechanismus CTE proti agregaci a ukládání A.

2. Výsledky

2.1. Izolace a identifikace tří hlavních sloučenin (1–3)

Sušené stonky C. tubulosa byly extrahovány 75% EtOH při teplotě místnosti. Kondenzovaný 75% EtOH extrakt byl podroben pryskyřici a C18 kolonové chromatografii, aby byly získány tři hlavní sloučeniny, echinakosid (1),akteosid (2) a isoakteosid(3). Jejich struktury byly objasněny analýzou spektroskopie NMR (nukleární magnetická rezonance) a ESI-MS (elektrosprejová ionizační hmota) a srovnáním s údaji z literatury (obrázek 1, obrázky doplňkových materiálů S3–S11).

2.2. The Phenylethanoid Glycosides (1–3) Content Assay z CTE

Testovací metoda byla validována pro analýzu fenylethanoidových glykosidů. Sloučeniny 1–3 (5.0 mg) byly přesně zváženy a smíchány s 50% methanolem (40 ml). Směsi byly sonikovány po dobu 5 minut. Tři standardní roztoky fenylethanoidových glykosidů (1–3) byly smíchány jako standardní zásobní roztok (100 ug/ml). Standardní zásobní roztok byl použit k přípravě pěti různých koncentrací (5, 10, 25, 50 a 100 ug/ml) uvedených roztoků, v daném pořadí, ředěním sériovými objemy 50% methanolu. Křivky fenylethanoidních glykosidů (1–3) byly stanoveny pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie (UPLC) od 5 do 100 ug/ml a byly lineární (1, r2= 0,9999; 2, r{{25} }.9999, r2= 0.9998); Vnitrodenní a mezidenní přesnost [% RSD (relativní směrodatná odchylka) byla od 0,1 do 1,8 %] a přesnost (95,6–104,2 %) byly podle UPLC přijatelné pro 1–3. UPLC kvantifikovala obsah 1, 2 a 3 CTE na 254, 38 a 41 mg/g (obrázek S2).

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO LÉČBU AD PACIENTŮ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3. Validace UPLC/MS/MS

Fenylethanoidní glykosidy (1–3) byly smíchány a přidány do homogenátu mozkové tkáně potkana a analyzovány pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie-tandemového hmotnostního spektrometru (UPLC/MS/MS) s extrakcí na pevnou fázi. Dolní mez detekce (LLOQ) 1–3 byla 0,2 ng/mL. Výtěžek fenylethanoidových glykosidů se zvýšil s homogenátem mozkové tkáně (10 ng/ml) na 91,39 % pro 1, 89,54 % pro 2 a 96,81 % pro 3, v daném pořadí (obrázek 2).

2.4. Analýza mozkových tkání krys podobných AD

Po 14 dnech perorálního podávání CTE (200 mg/kg/den) byly mozkové tkáně potkana typu AD odebrány a rozděleny na dvě části, hippocampus a striatum, a obě byly homogenizovány. Vzhledem k tomu, že homogenáty hippocampu a striatum od každé krysy byly příliš omezené na to, aby mohly být vloženy do extrakce na pevné fázi, a aby se zabránilo nadměrným experimentálním chybám, byly homogenáty hippocampu a striata ze čtyř jednotlivých potkanů ​​smíchány do analyzovaného vzorku pro UPLC/MS/MS s použitím pevné látky. metoda extrakce fáze (obrázek 3A, B). Fenylethanoidní glykosidy (1–3) byly pozorovány v hippocampu (obrázek 3A) a striatu (obrázek 3B). V prázdných mozkových tkáních nebyl žádný významný vrchol (obrázek 3C). V hippocampu byl obsah echinakosidu 11,97 ± 0,34 ng/ml, obsah akteosidů byl 1,25 ± 0,16 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 1,38 ± 0,08 ng /ml. Ve striatu byl obsah echinakosidu 22,60 ± 1,69 ng/ml, obsah akteosidů byl 2,03 ± 0,61 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 4,90 ± 0,64 ng/ml. Jak je znázorněno na obrázku 4, CTE by procházel hematoencefalickou bariérou podle významných detekovatelných množství 1–3 v hippocampu a striatu. Obsah 1 je mnohem vyšší než 2 a 3 v CTE analýzou UPLC (obrázek S2). Proto je rozumné pozorovat, že 1 je nejvyšší v mozkové tkáni po perorálním podání CTE.

2.5. Fenylethanoidní glykosidy (1–3) chelatační aktivita kovů

V literatuře bylo stanovení volných sloučenin a jejich kovových komplexů prováděno pomocí HPLC. Měření chelatační aktivity bylo v této studii analyzováno pomocí UPLC. Roztoky 50 µg/ml každého z fenylethanoidových glykosidů (1–3) byly přidány do 10 µg/ml roztoku mědi (Cu), vápníku (Ca), hořčíku (Mg), zinku (Zn), železa (Fe). ) nebo potkaní sérum. Každá sloučenina s každým roztokem kovu nebo sérem byla analyzována pomocí UPLC. Fenylethanoidní glykosidy (1–3) vykazovaly chelatační aktivitu kovů se železem a sérem (obrázek 5, doplňkové materiály obrázek S1).

2.6. Analýza echinakosidu (1) v krysím séru in vivo

Pro pochopení distribuce echinakosidu v krysím séru bylo sérum odebráno od počáteční doby do 720 minut po perorálním podání echinakosidu (1) (100 mg/kg) a analyzováno pomocí UPLC. Obrázek 6 ukazuje závislost koncentrace echinakosidu na čase v krysím séru.

3. Diskuse

Demence, zejména AD, je nevratné stárnutí a chronické onemocnění, které vede ke gordickému uzlu otázek. Tato nepřekonatelná nemoc vede k vážným ekonomickým problémům s obrovskou a rostoucí finanční zátěží. Celosvětově výzkumníci AD vynaložili velké úsilí na zkoumánínové léky proti ADale selhal v několika velkých klinických studiích zaměřených na A v roce 2012. Kromě přímého cílení na A je homeostáza kovových iontů v mozku považována za klíčový důvod související s agregací a ukládáním A, což vede k tvorbě AD. Proto kovové ionty hrají zásadní roli v patogenezi AD a hypotéza chelace kovů se stala důležitým směrem výzkumu.

Podle našich předchozích studiíCTE vykazoval potenciální aktivitu proti demenci. Dokonce ani v klinických studiích na lidech, po 1 roce léčby kapslemi CTE u pacientů se středně závažnou AD, skóre Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog) by nevykazovalo významné zhoršení ve srovnání s před léčbou. CTE udrželo skóre ADAS-cog pacientů s AD stabilní, ale jiné léky na předpis nikoli. Jediný výběr licencovaných léků na předpisléčba ADje inhibitory acetylcholinesterázy (AChEI), jako je donepezil a galanthamin, které krátkodobě zlepšují symptomy AD, ale ke zhoršení dochází po 1 roce léčby. Na základě klinických studií má CTE příležitost být potenciální léčbou pro vývoj anti-AD. Na základě našich předchozích zpráv by echinakosid (1), akteosid (2) a isoakteosid (3) chránily neurony před poškozením A, snížily oligomerizaci A in vitro a významně zlepšily kognitivní dysfunkci indukovanou A in vivo. Studie in vitro ukázala, že účinné dávky 1–3 byly až 5{{10}} µg/ml. Předchozí studie však měly za to, že perorální biologická dostupnost 1 a 2 byla u potkanů ​​velmi nízká (0,83 % pro 1 a 0,12 % pro 2). Sloučenina 1 nemohla být ani identifikována v lidském séru po perorálním podání tablety echinacey. Současné studie ukazují, že 1–3 měly špatnou membránovou permeabilitu a absorpci ve střevních buňkách a většina z 1 by byla metabolizována v gastrointestinálních kanálcích. Obsah sloučeniny 2 v krysím séru byl pouze asi 4,5 ug/ml po 15 minutách intravenózní injekce s dávkou 10 mg/kg akteosidu. Tato studie však ukazuje, že 1–3 by byla detekována v hippocampu a striatu mozkových tkání potkana po perorálním podání CTE (obrázky 3 a 4). Kromě toho obrázek 6 ukazuje, že obsah sloučeniny 1 v krysím séru se zvýšil asi 5krát od 15 minut do 720 minut po perorálním podání sloučeniny 1 (100 mg/kg). Uvažovali jsme, že fenylethanoidní glykosidy CTE projdou hematoencefalickou bariérou a mezi CTE a kovem by došlo k chelatačnímu účinku. Chelace je vratná chemická reakce. Železo je základním prvkem v séru a mozku [10,40]. Obrázek 5 ukazuje, že tři fenylethanoidové glykosidy by měly kov-chelatační aktivitu se železem a sérem. Železo a sérum mění oblast retenčního času píku tří fenylethanoidových glykosidů. Chelatace železa může být zásadním důvodem vedoucím k chybné identifikaci velmi nízké biologické dostupnosti fenylethanoidových glykosidů. Proto by měla být při analýze tří CTE fenylethanoidových glykosidů v krevním séru a mozku zvažována chelatační aktivita kovů, aby se obnovila skutečná biologická dostupnost a farmakokinetika. Kromě toho výsledky ukázaly, že tři fenylethanoidové glykosidy (1–3) projdou hematoencefalickou bariérou a dostanou se do mozkových tkání prostřednictvím tělesného oběhu. Tato studie vyvinula nejrychlejší a nejcitlivější metodu pro analýzu 1–3 pomocí UPLC/MS/MS a poskytla silný důkaz, že fenylethanoidové glykosidy (1–3) jsou hlavními bioaktivními složkami CTE.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO PREVENCI ALZHEIMEROVY NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

4. Materiály a metody

4.1. Přírodní materiál

Stonky C. tubulosa byly shromážděny v květnu 2016 z Hangzhou v Číně. Rostlina byla identifikována vzorky Dr. Lin HC Voucher (č. 20016CT), které byly uloženy v Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Čína.

4.2. Izolace a čištění

Vysušený stonek C. tubulosa byl rozemlet na prášek a poté extrahován pětkrát 75% EtOH. Po odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku byl surový extrakt podroben makroporézní pryskyřici AB-8 sloupcové chromatografii s H20/EtOH gradientovými rozpouštědlovými systémy od 20% EtOH do 100% EtOH. Podle chromatografie na tenké vrstvě byly čtyři frakce (Fr.1~Fr.4) shromážděny pro další separaci. Fr. 2 byla podrobena preparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) na koloně COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm x 20 mm vnitřní průměr, 5 um) s použitím 18% acetonitrilu jako systému mobilní fáze. Průtok byl 15 ml/min. Selektivně byly shromážděny tři hlavní vrcholy zájmu. Frakce obsahující cílové sloučeniny byly dále kondenzovány do sucha a byly získány 1, 2 a 3, v tomto pořadí.

4.3. Experimentální analýza

1H a 13C NMR spektra byla získána za použití spektrometrů Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) s tetramethylsilanem (TMS) jako vnitřním standardem. Preparativní HPLC byla provedena za použití kolony s reverzní fází (kolona Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm vnitřní průměr; Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japonsko) na Shimadzu LC-6AD series přístroj s detektory Prominence HPLC UV-Vis (Kjóto, Japonsko).

Echinakosid (1): bílý prášek; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 5 1.07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H-6), 2,79 ( 2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha-8), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J {{4{4} {80}}}},9 Hz, H-10 ), 5.{100}}0 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8,1, 2,0 Hz, H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H-500), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H-200), 5 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 5 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C-6 125}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 189}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 204}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 219}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (obrázek S3–S5).

Akteosid (2): bílý prášek; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 0,94 (3H, d, J =5,9 Hz, H-6000 ), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H-100), 4,7{157}} (1H, t , J=9.{{160}} Hz, H-400), 5.{209}}1 (1H, s, H{{ 31}}), 6,18 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H{{ 45}}), 6,62 (1H, d, J=7,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H{57} }), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz, H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60) 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 5 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{95} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000 ), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000 ), 70,6 (C{110} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{{125} } ), 113,6 (C-80 ), 114,7 (C-20 ), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{140} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{155} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{170} } ) (obrázky S6–S8). Isoacteosid (3): bílý prášek; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 'H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 1,07 (3H, d, J=6,1 Hz, H-6000), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H-1000), 6,27 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H-6), 6,58 (1H, d, J=8 0,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2), 6,74 (1H, d, J=8},1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60), 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 ( 1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 5 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C{262}} ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C-4000 ), 74,1 (C-500), 74,5 (C-200), 80,9 (C-300), 100,7 (C-1000), 102,7 (C-100) ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C-2 ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C-4 ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C-90 ) (obrázky S9–S11).

4.4. Příprava vodného extraktu C. Tubulosa (CTE)

Prášek stonku C. tubulosa byl dvakrát extrahován refluxováním s vodou po dobu 1,5 hodiny a roztok extraktu byl zfiltrován. Filtrovaný vodný extrakt (CTE) byl před použitím skladován při 4 °C.

4.5. Zvířecí model a plán pokusů

Krysí model podobný AD a experimentální schéma použité v této studii byly takové, jaké byly předepsány v naší předchozí studii [19]. Po infuzi A 1–42 (300 pmol/den) do mozkové komory po dobu alespoň dvou týdnů nebo déle byl potkanům podobným AD podáván CTE (200 mg/ml) perorálním podáním následující den. Po 14 dnech podávání byly krysy usmrceny, aby byly odebrány mozkové tkáně. Aby se předešlo nadměrným experimentálním chybám, byly vzorky od čtyř jednotlivých potkanů ​​spojeny do jednoho vzorku. Pro každou skupinu byly tři vzorky.

4.6. Chemikálie a činidla

Methanol (HPLC kvalita) byl zakoupen od Merck (Darmstadt, Německo). Kyselina mravenčí (98% pro analýzu, ACS) byla zakoupena od Panreac (Barcelona, ​​Španělsko). Acetonitril (HPLC čistota) byl zakoupen od JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). Čistá voda byla připravena pomocí systému ELGA (Woodridge, UK). Hesperidin byl zakoupen od Chromadex a použit jako interní standard (IS) pro UPLC analýzu.

4.7. Zařízení UPLC/MS/MS

Pro analýzu UPLC/MS/MS byla použita ultravýkonná kapalinová chromatografie Waters Acquity TQD (UPLC)/MS/MS (Milford, MA, USA). Chromatografické experimenty byly prováděny na koloně Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 1 00 mm, 1,7 um, Waters) s gradientovou elucí při průtoku 0,4 ml/min. Mobilní fáze byla složena ze směsi kyselina mravenčí-voda (1:1000, obj./obj.) (A) a kyselina mravenčí-acetonitril (1:1000, obj./obj.) (B). Časový program byl následující: 0–5 min, A–B (92:8, v/v) změněno na A–B (62:38, v/v); 5–7 min, AB (62:38, obj.); 7-7.1 min, AB (62:38, v/v) změněno na A–B (92:8, v/v); 7,1–9 min, (92:8, obj./obj.). Objem nástřiku byl 5 ul do systému UPLC/MS/MS se zdrojem iontů s negativní elektrosprejovou ionizací (ESI). Celkové iontové chromatogramy (TIC) pro 1–3 byly provedeny pomocí režimu sledování vícenásobné reakce (MRM). Parametry hmotnosti byly optimalizovány pro získání nejčistších signálů s vysokou intenzitou. Nejlepší volba parametrů byla popsána jako 3000 V kapilární napětí, 20 V kuželové napětí, 125 ◦C teplota zdroje, 400 ◦C desolvační teplota, 50 l/h průtok kuželového plynu, 900 l/h průtok desolvačního plynu a 38 eV kolize energie. Data byla zpracována softwarem MassLynx 4.1 (Milford, MA, USA).

4.8. Příprava vzorků

Mozková tkáň potkana použila k homogenizaci 50% methanol (1 g tkáně na 5 ml methanolu). Homogenát byl centrifugován při 10,{4}} ot./min. při 4 °C po dobu 10 minut. K supernatantu (50 ul) s 10 ul IS (100 ug/ml) byla přidána čistá voda do 1 ml. Směs byla opatrně nanesena na patronu Oasis HLB (hydrofilně-lipofilně vyvážená) (Waters, Milford, MA, USA), která již byla eluována 1 ml methanolu a poté ekvilibrována 1 ml vody za podmínek vakua. Poté, co byl k promytí patrony použit 1 ml 10% methanolu, byl použit 1 ml methanolu k eluci pro získání analyzovaného vzorku, který byl přenesen do další 1,5ml Eppendorfovy zkumavky s 10 ul 1% roztoku kyseliny askorbové a vysušen odpařením. Nakonec byl zbytek z analyzovaného vzorku rozpuštěn ve 200 ul 50% methanolu pro analýzu.

4.9. Příprava kalibrační standardní křivky

Sloučeniny 1–3 byly použity k přípravě kalibračních standardů, respektive přidaných do homogenátu mozkové tkáně a hesperidinu jako vnitřního standardu, aby se získaly konečné koncentrace kalibračního standardu, které byly 1.0, 5.0, 1{{7 }}.0, 50,0 a 100,0 ng/ml.

4.10. Validace

Kalibrační standardní křivka byla získána pomocí testu linearity za použití pěti různých koncentrací 1–3, v rozmezích 1.0, 5.0, 10.0 , 50.0, respektive 100,0 ng/mL, a byl považován za lineární s koeficientem determinace více než 0,99 (R-squared). Dolní mez detekce (LLOQ), definovaná jako ± 20 % koncentrace testovaného vzorku, produkovala signální vrchol spíše než šum. Důvěryhodnost a přesnost metody analýzy byly hodnoceny pomocí testu výtěžnosti při 10 ng/ml 1–3.

4.11. Test aktivity chelatace kovů

UPLC byla použita k analýze chelatačního účinku kovů pomocí 50 µg/ml roztoku CTE fenylethanoidových glykosidů 1–3 obsahujícího 10 µg/ml kovového roztoku mědi, vápníku, hořčíku, zinku, železa nebo potkaního séra. Každá sloučenina s každým roztokem kovu nebo sérem byla analyzována pomocí UPLC. Chelatační efekt kovu by změnil retenční čas na 1–3 v kapalinové chromatografii. Procento chelatačního účinku kovu bylo vypočteno jak je uvedeno níže a data představovala průměr ± SD (n=3).

5. Závěry

Tato studie prokázala, že 1–3 jsou aktivními složkami CTE pro anti-AD aktivitu. Chelace železa se stala novým konceptem pro navrhování nové generace léků pro léčbu AD.CTE je potenciální botanická čínská medicína proti ADcílení na agregaci a ukládání A vyvolanou chelací železa. Kromě toho jsme dále dokázali, že 1–3 by se do mozku dostaly přes krev – hematoencefalickou bariéru (BBB). Aktivní složky a základní mechanismus potvrzení CTE výrazně napomohou kontrole kvality a biologické dostupnosti studií produktů v budoucnu. Prezentovaná pokročilá a účinná analytická metoda bude zároveň užitečná při stanovení 1–3 v rostlinách, potravinách, krvi a mozkových tkáních pro chemický výzkum otisků prstů a farmakokinetický výzkum.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO LÉČENÍ ALZHEIMEROVY NEMOCI PHGS75% ECH 30% ACT 12%