Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chien-Liang Chao, Hsin-Wen Huang, Hui-Chi Huang, Hsin-Fan Chao, Shuen-Wen Yu, Muh-Hwan Su, Chao-Jih Wang a Hang-Ching Lin

Abstraktní

Cistanche tubulosa vodný extrakt(CTE) se již v Číně používá jako botanický lék na předpis k léčbě demence. Naše předchozí studie uváděly, že fenylethanoidové glykosidy CTE (Cistanche tubulosa vodný extrakt) mají aktivitu proti Alzheimerově chorobě (AD) inhibicí agregace a ukládání amyloidního peptidu (A). Nedávné studie se však domnívaly, že fenylethanoidové glykosidy mohou být metabolizovány střevními bakteriemi, protože všechny výsledky analýz ukázaly, že biologická dostupnost fenylethanoidových glykosidů je extrémně nízká. V této studii demonstrujeme, jak chelace železa hraje klíčovou roli v mechanismu inhibice agregace a depozicefenylethanoidové glykosidyCTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt). Kromě toho jsme dále dokázali, že fenylethanoidové glykosidy (1–3) se mohou dostat do mozku. Aktivní CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)Potvrzení složek a akčního mechanismu bude v budoucnu velkou pomocí pro kontrolu kvality produktu a studie biologické dostupnosti. Současně poskytujeme novou analytickou metodu použitelnou při stanovení fenylethanoidních glykosidů (1–3) v rostlinách, potravinách, krvi a tkáních pro chemický výzkum otisků prstů a farmakokinetický výzkum.

klíčová slova: Cistanche tubulosa; fenylethanoidové glykosidy; Alzheimerova choroba; chelace železa

Cistanche tubulosa

1. Úvod

Demence je jednou z nejčastějších chorob chronického stárnutí. Světová zpráva o Alzheimerově chorobě v roce 2015 odhadovala, že demencí trpělo asi 46,8 milionu lidí a očekává se, že v roce 2030 to bude 74,7 milionu a v roce 2050 131,5 milionu [1]. Globální populace demence se bude rok od roku zvyšovat a v budoucnu se vymkne kontrole. Globální výdaje na zdravotní péči na léčbu demence byly v roce 2010 téměř 604 miliard amerických dolarů a očekává se, že v roce 2030 to bude 1000 miliard [2]. Pacienti s demencí mají větší riziko náhodné smrti [3], a proto vyžadují více lékařské péče. To je velká zátěž pro rodinné pečovatele pacientů s demencí. Dopad demence na pečovatele, rodinu a společnost může způsobit velký fyzický, psychický, životní a ekonomický stres. Existují dvě hlavní formy demence, Alzheimerova choroba (AD) a vaskulární demence [4,5]. AD je nejčastější demencí a je ireverzibilní a progresivní neurodegenerativní poruchou [4–6]. AD byla v roce 2015 šestou nejčastější příčinou úmrtí ve Spojených státech [6].

Nedávné studie podporují, že neuronová toxicita indukovaná amyloidním peptidem (A ) (plaky) a agregací proteinu tau (tangles) úzce souvisí s patogenezí AD. Akumulace A a proteinu tau v mozku může vést k poškození neuronů a ztrátě paměti [7]. Nerozpustné oligomery A se agregují v extracelulárních placích a bylo hlášeno, že vedou k synaptické dysfunkci, neuronové toxicitě a buněčné smrti [8]. Bohužel zatím není k dispozici žádná účinná léčba, která by odstranila A a protein tau nebo inhibovala tvorbu nebo oligomerizaci A a pozastavila nebo vyléčila nevratné poškození neuronů. Současná terapeutická činidla, jako je galantamin a donepezil, které jsou inhibitory acetylcholinesterázy, mohou pouze dočasně zmírnit ztrátu paměti zvýšením hladiny neurotransmiterů. V roce 2012 nebyly žádné kandidátní léky schopné snížit A efekt ve velkých klinických studiích pacientů s AD [9]. Proto je naléhavě zapotřebí výzkum nové léčby k potlačení prevalence Alzheimerovy choroby. Kovové ionty byly nedávno považovány za klíčový faktor úzce související s agregací A [10]. Kovové chelátory považované za potenciální sloučeniny olova poskytují zcela novou strategii pro anti-AD přístup [9,11–15].

Sušená nať Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight, Rou Cong Rong, se hojně sklízí v poušti Xinjiang v Číně. Jde o významnou tradiční čínskou medicínu, která patří k tonizující čínské medicíně indexované v Čínském lékopisu a používaná po tisíce let k léčbě fyzické slabosti, nedostatku ledvin, neplodnosti, zapomnětlivosti, impotence a stařecké zácpy [16,17].Vodný extrakt Cistanche tubulosa(CTE) kapsle byly v Číně schváleny jako botanický lék na vaskulární demenci. Podle klinické studie 18 pacientů s diagnostikovanou mírnou až středně těžkou AD, CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)kapsle poskytly pacientům stabilnější stav paměti ve srovnání s inhibitory acetylcholinesterázy [18]. V naší předchozí studii CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)snížení ukládání amyloidního peptidu (A ) a zlepšení ztráty paměti u potkanů ​​podobných Alzheimerově chorobě [19]. Fenylethanoidové glykosidy, echinakosid (1), akteosid (2) a isoakteosid (3) jsou považovány za hlavní složky CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)[20]. Sloučenina 1 má neuroprotektivní aktivitu proti toxicitě 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP) [21], 1-methyl -4-fenylpyridiniový iont (MPP plus) [22] a 6-hydroxydopamin (6-OHDA) [23]. Naše předchozí zpráva ukázala, že 1 potlačil oligomerizaci a toxicitu A ve studii in vitro a inhiboval ukládání A, čímž zlepšil zhoršenou paměť a kognitivní dysfunkci u potkanů ​​indukovaných A [24]. Sloučeniny 2 a 3 zvýšily degradaci A a snížily oligomerizaci A in vitro [25]. Sloučenina 3 snížila ukládání A u A-indukovaných potkanů ​​[25]. Na základě těchto studií již C. tubulosa prokázala, že má potenciál léčit AD. CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)úzce souvisí s anti-A agregací a depozicí [24,25]. Abychom lépe porozuměli CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)mechanismu, potřebujeme mít pohodlnou a účinnou metodu k identifikaci aktivní složky i obsahu ve vzorcích mozkové tkáně. Většina studií byla navržena pro kvantitativní stanovení echinakosidu, akteosidu a isoakteosidu v bylinách nebo potravinách pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) [26–28], ale pouze dvě studie se týkaly stanovení v séru nebo tkáních [29, 30]. Neexistuje však žádná zpráva o simultánní analýze 1–3 v mozkových tkáních po CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)ústní podání. Z nedávných studií navíc stále není jasné, zda CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)aktivní složky nebo jejich metabolity úspěšně prošly hematoencefalickou bariérou a působily na mozkové neurony. Proto tento výzkum poskytuje pokročilou a citlivou metodu s přesvědčivými důkazy, které jasně ilustrují základní mechanismus CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)proti agregaci a depozici.

Cistanche tubulosa vodný extrakt

2. Výsledky

2.1. Izolace a identifikace tří hlavních sloučenin (1–3)

Sušené stonky C. tubulosa byly extrahovány 75% EtOH při teplotě místnosti. Kondenzovaný 75% EtOH extrakt byl podroben pryskyřičné a C18 kolonové chromatografii, aby byly získány tři hlavní sloučeniny, echinakosid (1), akteosid (2) a isoakteosid (3). Jejich struktury byly objasněny analýzou spektroskopie NMR (nukleární magnetická rezonance) a ESI-MS (elektrosprejová ionizační hmota) a srovnáním s literárními údaji [31–33] (obrázek 1, obrázky doplňkových materiálů S3–S11).

2.2. The Phenylethanoid Glycosides (1–3) Content Assay z CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)

Testovací metoda byla validována pro analýzu fenylethanoidových glykosidů. Sloučeniny 1–3 (5.0 mg) byly přesně zváženy a smíchány s 50procentním methanolem (40 ml). Směsi byly sonikovány po dobu 5 minut. Tři standardní roztoky fenylethanoidových glykosidů (1–3) byly smíchány jako standardní zásobní roztok (100 µg/ml). Standardní zásobní roztok byl použit k přípravě pěti různých koncentrací (5, 10, 25, 50 a 100 ug/ml) uvedených roztoků, v daném pořadí, ředěním sériovými objemy 50% methanolu. Křivky fenylethanoidových glykosidů (1–3) byly stanoveny pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie (UPLC) od 5 do 100 µg/ml a byly lineární (1, r2=0,9999; 2, r{{25} }.9999; 3, r2=0.9998). Vnitrodenní a mezidenní přesnost [procento RSD (relativní směrodatná odchylka) byla od 0,1 do 1,8 procenta] a přesnost (95,6–104,2 procenta) byla přijatelná UPLC pro 1–3. UPLC kvantifikovala 1, 2 a 3 CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)obsahy 254, 38 a 41 mg/g, v tomto pořadí (obrázek S2)

2.3. Validace UPLC/MS/MS

Fenylethanoidní glykosidy (1–3) byly smíchány a přidány do homogenátu mozkové tkáně potkana a analyzovány pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie-tandemového hmotnostního spektrometru (UPLC/MS/MS) s extrakcí na pevnou fázi. Dolní mez detekce (LLOQ) 1–3 byla 0,2 ng/mL. Výtěžek fenylethanoidních glykosidů se zvýšil s homogenátem mozkové tkáně (10 ng/ml) na 91,39 procent pro 1, 89,54 procent pro 2 a 96,81 procent pro 3, v tomto pořadí (obrázek 2).

2.4. Analýza mozkových tkání krys podobných AD

Po 14 dnech CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)perorálním podáváním (200 mg/kg/den) byly odebrány mozkové tkáně podobné AD potkanům a rozděleny na dvě části, hippocampus a striatum, a obě byly homogenizovány [19]. Protože homogenáty hippocampu a striatum od každé krysy byly příliš omezené na to, aby mohly být naneseny do extrakce pevnou fází, a aby se předešlo nadměrným experimentálním chybám, byly homogenáty hippocampu a striata ze čtyř jednotlivých krys smíchány do analyzovaného vzorku pro UPLC/MS/MS pomocí extrakční metodou na pevné fázi (obrázek 3A, B). Fenylethanoidní glykosidy (1–3) byly pozorovány v hippocampu (obrázek 3A) a striatu (obrázek 3B). V prázdných mozkových tkáních nebyl žádný významný vrchol (obrázek 3C). V hippocampu byl obsah echinakosidu 11,97 ± {{2{28}}}},34 ng/ml, obsah akteosidů byl 1,25 ± 0,16 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 1,38 ± 0,08 ng/ml ml. Ve striatu byl obsah echinakosidu 22,60 ± 1,69 ng/ml, obsah akteosidů byl 2,03 ± 0,61 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 4,90 ± 0,64 ng/ml. Jak je znázorněno na obrázku 4, CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)by prošel hematoencefalickou bariérou podle významných detekovatelných množství 1–3 v hippocampu a striatu. Obsah 1 je mnohem vyšší než 2 a 3 v CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)analýzou UPLC (obrázek S2). Proto je rozumné pozorovat, že 1 je nejvyšší v mozkové tkáni po orálním CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)správa. Molekuly 2019, 24, x K HODNOCENÍ ODBORNÍKŮ 4 z 12 2.4. Analýza AD-like potkaních mozkových tkání po 14 dnech CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)perorálním podáváním (200 mg/kg/den) byly odebrány mozkové tkáně podobné AD potkanům a rozděleny na dvě části, hippocampus a striatum, a obě byly homogenizovány [19]. Protože homogenáty hippocampu a striatum od každé krysy byly příliš omezené na to, aby mohly být naneseny do extrakce pevnou fází, a aby se předešlo nadměrným experimentálním chybám, byly homogenáty hippocampu a striata ze čtyř jednotlivých krys smíchány do analyzovaného vzorku pro UPLC/MS/MS pomocí extrakční metodou na pevné fázi (obrázek 3A, B). Fenylethanoidní glykosidy (1–3) byly pozorovány v hippocampu (obrázek 3A) a striatu (obrázek 3B). V prázdných mozkových tkáních nebyl žádný významný vrchol (obrázek 3C). V hippocampu byl obsah echinakosidu 11,97 ± {{2{28}}}},34 ng/ml, obsah akteosidů byl 1,25 ± 0,16 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 1,38 ± 0,08 ng/ml ml. Ve striatu byl obsah echinakosidu 22,60 ± 1,69 ng/ml, obsah akteosidů byl 2,03 ± 0,61 ng/ml a obsah isoakteosidů byl 4,90 ± 0,64 ng/ml. Jak je znázorněno na obrázku 4, CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)by prošel hematoencefalickou bariérou podle významných detekovatelných množství 1–3 v hippocampu a striatu. Obsah 1 je mnohem vyšší než 2 a 3 v CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)analýzou UPLC. Proto je rozumné pozorovat, že 1 je nejvyšší v mozkové tkáni po orálním CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)správce.

2.5. Fenylethanoidní glykosidy (1–3) chelatační aktivita kovů

V literatuře bylo stanovení volných sloučenin a jejich kovových komplexů provedeno pomocí HPLC [34,35]. Měření chelatační aktivity bylo v této studii analyzováno pomocí UPLC. Roztoky 50 µg/ml každého fenylethanoidového glykosidu (1–3) byly přidány do 10 µg/ml roztoku mědi (Cu), vápníku (Ca), hořčíku (Mg), zinku (Zn), železa (Fe) nebo krysí sérum. Každá sloučenina s každým roztokem kovu nebo sérem byla analyzována pomocí UPLC. Fenylethanoidní glykosidy (1–3) vykazovaly chelatační aktivitu kovů se železem a sérem (obrázek 5, doplňkové materiály obrázek S1). Molekuly 2019, 24, x PRO PEER RECENZE 5 z 12 vzorku od AD-like potkanů ​​po CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)orální podání (200 mg/kg, po) [1 (tR= 4,19 min), 2 (tR= 5,13 min) a 3 (tR= 5,68 min)] . (c) Prázdná mozková tkáň. Obrázek 4. Fenylethanoidové glykosidy (1–3) byly detekovatelné v mozkových tkáních potkana [19] pomocí UPLC/MS/MS. Data představují průměr ± SD, n=3 pro každou skupinu. 2.5. Fenylethanoidní glykosidy (1-3) chelatační aktivita kovů. V literatuře bylo stanovení volných sloučenin a jejich kovových komplexů provedeno pomocí HPLC [34,35]. Měření chelatační aktivity bylo v této studii analyzováno pomocí UPLC. Roztoky 50 ug/ml každého fenylethanoidového glykosidu (1–3) byly přidány do 10 ug/ml roztoku mědi (Cu), vápníku (Ca), hořčíku (Mg), zinku (Zn), železa (Fe) nebo krysí sérum. Každá sloučenina s každým roztokem kovu nebo sérem byla analyzována pomocí UPLC. fenylethanoidní glykosidy (1-3)

2.6. Analýza echinakosidu (1) v krysím séru in vivo

Abychom porozuměli distribuci echinakosidu v potkaním séru, bylo sérum odebíráno od počáteční doby do 720 minut po perorálním podání echinakosidu (1) (100 mg/kg) a sérum bylo odebíráno od počáteční doby do 720 minut po echinakosidu. (1) orální podávání (100 mg/kg) a analyzováno pomocí UPLC. Obrázek 6 ukazuje profily koncentrace versus čas echinakosidu v krysím séru.

3. Diskuse

Demence, zejména AD, je nevratné stárnutí a chronické onemocnění, které vede ke gordickému uzlu otázek. Tato nepřekonatelná nemoc vede k vážným ekonomickým problémům s obrovskou a rostoucí finanční zátěží. Celosvětově výzkumníci AD vynakládají velké úsilí na zkoumání nových léků proti AD, ale selhali v několika velkých klinických studiích zaměřených na A v roce 2012 [9]. S výjimkou přímého cílení na A je homeostáza kovových iontů v mozku považována za klíčový důvod související s agregací a depozicí A, která vede k tvorbě AD [9,10]. Kovové ionty proto hrají zásadní roli v patogenezi AD a hypotéza chelace kovů se stala důležitým směrem výzkumu [9,13–15].

Podle našich předchozích studií [18,19,24,25], CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)vykazoval potenciální anti-demenci aktivitu. Dokonce i v klinických studiích na lidech po 1 roce léčby CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)kapslí pro pacienty se středně závažnou AD by skóre Alzheimer's Disease Assessment Scale-cognitive subscale (ADAS-cog) nevykazovalo signifikantní zhoršení ve srovnání se stavem před léčbou [18]. CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)udržel ADAS-cog skóre pacientů s AD stabilní, ale jiné léky na předpis nikoli. Jedinou volbou léků na předpis schválených pro léčbu AD jsou inhibitory acetylcholinesterázy (AChEI), jako je donepezil a galanthamin, které krátkodobě zlepšují symptomy AD, ale ke zhoršení dochází po 1 roce léčby [36]. Na základě klinických studií CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)má příležitost být potenciální léčbou pro vývoj anti-AD činidla. Na základě našich předchozích zpráv [24,25] by echinakosid (1), akteosid (2) a isoakteosid (3) chránily neurony před poškozením A, snižovaly oligomerizaci A in vitro a významně zlepšovaly kognitivní dysfunkci indukovanou A in vivo. Studie in vitro ukázala, že aktivní dávky 1–3 byly až 50 ug/ml [24,25]. Předchozí studie však měly za to, že orální biologická dostupnost 1 a 2 byla u potkanů ​​velmi nízká (0,83 procenta pro 1 a 0,12 procenta pro 2) [29,30]. Sloučenina 1 nemohla být ani identifikována v lidském séru po perorálním podání tablety echinacey [37]. Současné studie ukazují, že 1–3 měly špatnou membránovou permeabilitu a absorpci ve střevních buňkách [38] a většina z 1 by byla metabolizována v gastrointestinálních kanálcích [39]. Obsah sloučeniny 2 v krysím séru byl pouze asi 4,5 ug/ml po 15 minutách intravenózní injekce s dávkou 10 mg/kg akteosidu [30]. Tato studie však ukazuje, že 1–3 by byly detekovány v hipokampu a striatu mozkových tkání potkana po CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)orální podání (obrázky 3 a 4). Kromě toho obrázek 6 ukazuje, že obsah sloučeniny 1 v krysím séru se zvýšil asi 5krát od 15 minut do 720 minut po perorálním podání sloučeniny 1 (100 mg/kg). Zvažovali jsme fenylethanoidové glykosidy CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)by prošel hematoencefalickou bariérou a došlo by k chelatačnímu účinku mezi CTE(Cistanche tubulosa vodný extrakt)a kov. Chelace je vratná chemická reakce. Železo je základním prvkem v séru a mozku [10,40]. Obrázek 5 ukazuje, že tři fenylethanoidové glykosidy by měly chelatační aktivitu kovů se železem a sérem. Železo a sérum zjevně mění oblast retenčního času píku tří fenylethanoidových glykosidů. Chelatace železa může být zásadním důvodem vedoucím k chybné identifikaci velmi nízké biologické dostupnosti fenylethanoidových glykosidů. Proto by se při analýze krevního séra a mozku tří CTE měla brát v úvahu chelatační aktivita kovů(Cistanche tubulosa vodný extrakt)fenylethanoidové glykosidy k obnovení skutečné biologické dostupnosti a farmakokinetiky. Kromě toho výsledky ukázaly, že tři fenylethanoidní glykosidy (1–3) projdou hematoencefalickou bariérou a dostanou se do mozkových tkání prostřednictvím tělesného oběhu. Tato studie vyvinula nejrychlejší a nejcitlivější metodu pro analýzu 1–3 pomocí UPLC/MS/MS a poskytla silný důkaz, který dokazuje, že fenylethanoidové glykosidy (1–3) jsou hlavními bioaktivními složkami CTE.(Cistanche tubulosa vodný extrakt).

Extrakt z Cistanche tubulosa

4. Materiály a metody

4.1. Přírodní materiál

Stonky C. tubulosa byly shromážděny v květnu 2016 z Hangzhou v Číně. Rostlina byla identifikována Dr. Lin HC Poukazové vzorky (č. 20016CT) byly uloženy v Sinphar Tian-LiPharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Čína.

4.2. Izolace a čištění

Vysušený stonek C. tubulosa byl rozemlet na prášek a poté pětkrát extrahován 75% EtOH. Po odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku byl surový extrakt podroben sloupcové chromatografii Macroporousresin AB-8 s gradientovými rozpouštědlovými systémy H2O/EtOH od 20 procent EtOH do 100 procent EtOH. Podle chromatografie na tenké vrstvě byly čtyři frakce (Fr.1~Fr.4) shromážděny pro další separaci. Fr. 2 byl podroben preparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) na koloně COSMOSIL® 5C18-AR-II (250 mm x 20 mm vnitřní průměr, 5 um) s použitím 18% acetonitrilu jako systému mobilní fáze. Druhá rychlost byla 15 ml/min. Selektivně byly shromážděny tři hlavní vrcholy zájmu. Frakce obsahující cílové sloučeniny byly dále kondenzovány do sucha a byly získány 1, 2 a 3, v daném pořadí.

4.3. Experimentální analýza

1H a 13C NMR spektra byla získána za použití spektrometrů Bruker Avance DRX 500 MHz (Billerica, MA, USA) s tetramethylsilanem (TMS) jako vnitřním standardem. Preparativní HPLC byla provedena pomocí kolony s reverzní fází (kolona Cosmosil C18-AR-II, 250 mm × 20 mm vnitřní průměr; NacalaiTesque, Inc., Kyoto, Japonsko) na Shimadzu LC-6AD series přístroj s Prominence HPLC UV-Visdetectors (Kjóto, Japonsko).

Echinakosid (1):bílý prášek; ESI-MS m/z: 785 [M-H]-; 1H NMR (CD3OD, 500 MHz): 5 1.07 (1H, d, J=6,2 Hz, Rha-H{{10} }), 2,79 (2H, t, J=5,2 Hz, H-7), 3,56 (1H, m, Ha{{2{93}}}}), 3,79 (1H, m, H-30), 3,91 (1H, m, Hb-8), 4,29 (1H, d, J=7,7, Glc-H-1), 4,38 (1H, d, J=7,9 Hz, H-10), 5.00 (1H, t, J=9,6 Hz, H-40), 5,17(1H, d, J=1,5 Hz, Rha-H-1), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-800), 6,58 (1H, dd, J=8,1,2,0 Hz,H-6), 6,67 (1H, d, J=8,1 Hz, H-5), 6,70 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,77 (1H, d, J=8,2 Hz, H{ {86}}), 6,94 (1H, dd, J=8,3, 2,0 Hz, H-600), 7,05 (1H, d, J=2,0 Hz, H{ {100}}), 5 7,59 (1H, d, J=15,9 Hz, H-700); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 5 18,5 (Rha-C-6), 36,6 (C-7), 62,6 (Glc-C-6), 69,4 (C-6) 124}}), 70,5 (C-40), 70,6 (Rha-C-5), 71,5 (Glc-C-4), 72,0 (Rha-C-3) , 72,3 (C-8), 72,4 (Rha-C-2), 73,8 (Rha-C-4), 74,7 (C-50), 75,1 (Glc-C -2), 76,1 (C-20), 77,8 (Glc-C-5), 77,9 (Glc-C-3), 81,7 (C-30) , 103,1 (Rha-C-1), 104,2 (C-10), 104,7 (Glc-C-1), 114,7 (C-200), 115,3 (C{{ 188}}), 116,3 (C-500), 116,5 (C-2), 117,1 (C-5), 121,3 (C-6), 123,3 (C{{ 203}}), 127,6 (C-100), 131,5 (C-1), 144,7 (C-3), 146,1 (C-4), 146,9 (C{{ 218}}), 148,2 (C-700), 149,8 (C-300), 168,5 (C-900) (obrázek S3–S5)

Akteosid (2):bílý prášek; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 0,94(3H, d, J =5,9 Hz, H{{1{{ 156}}}}), 2,68 (2H, m, H-7), 4,33 (1H, d, J=7,8 Hz, H{{2{159}}}}), 4,70 (1H, t, J=9,0 Hz, H-400), 5,01 (1H, s, H-1000), 6,18 (1H, d, J=15 ,9 Hz, H-80), 6,48 (1H, dd, J=7,9, 1,4 Hz, H-6), 6,62 (1H, d, J=7 0,1 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=2,0 Hz, H-2), 6,75 (1H, d, J=7,9 Hz , H-50), 6,97 (1H, d, J=8,1 Hz, H-60), 7,01 (1H, s, H-20), 7,44 (1H , d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR: (DMSO-d6, 125 MHz): 5 18,2 (C-6000), 35,1 (C-7), 60,8 (C-600), 68,8 (C{{94} } ), 69,2 (C-400 ), 70,3 (C-3000), 70,3 (C-8), 70,4 (C-2000), 70,6 (C{109} } ), 71,7 (C-500), 74,5 (C-200), 79,2 (C-300), 101,3 (C-1000), 102,3 (C{124} } ), 113,6 (C-80), 114,7 (C-20), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{139} }), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,6 (C-10), 129,2 (C-1), 143,6 (C{154} }), 145,0 (C-3), 145,0 (C-30), 145,6(C-70), 148,5 (C-40), 165,7 (C{169} } ) (obrázky S6–S8).

Iso-akteosid (3):bílý prášek; ESI-MS m/z: 623 [M-H]-; 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): 5 1.07 (3H, d, J=6,1 Hz, H{{10} }), 2,65 (2H, m, H-7), 4,35 (1H, d, J=10,0 Hz, H-100), 5,10 (1H, s, H{{ 24}}), 6,27 (1H, d, J=15,9 Hz, H-80), 6,45 (1H, dd, J=8,0, 1,8 Hz, H{{ 38}}), 6,58 (1H, d, J=8,8 Hz, H-5), 6,73 (1H, d, J=1,6 Hz, H{{50} }), 6,74 (1H, d, J=8,1 Hz, H-50), 6,94 (1H, d, J=8,2 Hz, H-60) 7,04 (1H, s, H-20), 7,46 (1H, d, J=15,8 Hz, H-70); 13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): 5 17,9 (C-6000), 35,2 (C-7), 63,5 (C-600), 68,2 (C-5000) ), 70,4 (C-400), 70,6 (C-3000), 71,7 (C-8), 72,1 (C-2000), 73,7 (C{103}} ), 74,1 (C-500 ), 74,5 (C-200 ), 80,9 (C-300 ), 100,7 (C-1000 ), 102,7 (C{118}} ), 113,9 (C-20), 114,9 (C-80), 115,5 (C-5), 115,8 (C-50), 116,3 (C{133}} ), 119,6 (C-6), 121,5 (C-60), 125,5 (C-10), 129,2 (C-1), 143,5 (C{148}} ), 145,0 (C-3), 145,3 (C-30), 145,6 (C-70), 148,5 (C-40), 165,6 (C{163}} ) (obrázky S9–S11).

4.4. Příprava vodného extraktu Cistanche Tubulosa (CTE)

Stonka prášku Cistanche tubulosa byla dvakrát extrahována refluxováním s vodou po dobu 1,5 hodiny a roztok extraktu byl zfiltrován. FiltrovánoCistanche tubulosavodný extrakt(CTE) byl před použitím skladován při 4 ◦C.

5. Závěry

Tato studie prokázala, že 1–3 je aktivní složkou CTE pro anti-AD aktivitu. Chelace železa se stala novým konceptem pro navrhování nové generace léků pro léčbu AD [41]. CTE je potenciální botanická anti-AD čínská medicína zaměřená na agregaci a ukládání A vyvolanou chelací železa. Kromě toho jsme dále dokázali, že 1–3 by se dostaly do mozku přes hematoencefalickou bariéru (BBB). Aktivní složky a základní mechanismus potvrzení CTE výrazně napomohou kontrole kvality a biologické dostupnosti studií produktů v budoucnu. Prezentovaná pokročilá a účinná analytická metoda bude zároveň užitečná při stanovení 1–3 v rostlinách, potravinách, krvi a mozkových tkáních pro chemický výzkum otisků prstů a farmakokinetický výzkum.

Reference

1. Wu, YT; Beiser, AS; Breteler, MMB; Fratiglioni, L.; Helmer, C.; Hendrie, HC; Honda, H.; Ikram, MA; Langa, KM; Lobo, A.; a kol. Měnící se prevalence a incidence demence v čase – aktuální důkazy. Nat. Neurol. 2017, 13, 327–339. [CrossRef]

2. Robinson, L.; Tang, E.; Taylor, JP Demence: Včasná diagnostika a včasná intervence. BMJ 2015, 350, h3029. [CrossRef]

3. Mitchell, R.; Draper, B.; Harvey, L.; Brodatý, H.; Close, J. Přežití a charakteristiky starších lidí s demencí a bez ní, kteří jsou hospitalizováni po úmyslném sebepoškozování. Int. J. Geriatr. Psych. 2017, 32, 892–900. [CrossRef] [PubMed]

4. Ott, A.; Breteler, MM; van Harskamp, ​​F.; Claus, JJ; van der Cammen, TJ; Grobbee, DE; Hofman, A. Prevalence Alzheimerovy choroby a vaskulární demence: souvislost se vzděláním. Rotterdamská studie. BMJ 1995, 310, 970–973. [CrossRef]

5. Kalaria, RN; Maestre, GE; Arizaga, R.; Friedland, RP; Galasko, D.; Hall, K.; Luchsinger, JA; Ogunniyi, A.; Perry, EK; Potočník, F.; a kol. Alzheimerova choroba a vaskulární demence v rozvojových zemích: prevalence, léčba a rizikové faktory. Lanceta. Neurol. 2008, 7, 812–826. [CrossRef]

6. Fakta a čísla o Alzheimerově chorobě 2018. Alzheimerova demence. 2018, 14, 367–429. [CrossRef]

7. Hardy, J.; Selkoe, DJ Amyloidní hypotéza Alzheimerovy choroby: Pokrok a problémy na cestě k terapii. Science 2002, 297, 353–356. [CrossRef]

8. Querfurth, HW; LaFerla, FM Alzheimerova choroba. N. Engl. J. Med. 2010, 362, 329–344. [CrossRef]

9. Ayton, S.; Lei, P.; Bush, AI Metallostáza u Alzheimerovy choroby. Volný Radic. Biol. Med. 2013, 62, 76–89. [CrossRef]

10. Kim, AC; Lim, S.; Kim, YK Účinky kovových iontů na agregaci A a Tau. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 128. [CrossRef]

11. Robert, A.; Liu, Y.; Nguyen, M.; Meunier, B. Regulace homeostázy mědi a železa pomocí chelátorů kovů: Možná chemoterapie Alzheimerovy choroby. A. Chem. Res. 2015, 48, 1332–1339. [CrossRef] [PubMed]

12. Opare, SKA; Rauk, A. Chelátory mědi(I) pro Alzheimerovu chorobu. J. Phys. Chem. B 2017, 121, 11304–11310. [CrossRef] [PubMed]

13. Santos, MA; Chand, K.; Chaves, S. Nedávný pokrok v multifunkčních chelátorech kovů jako potenciálních léků pro Alzheimerovu chorobu. Coord. Chem. Rev. 2016, 327–328, 287–303. [CrossRef]

14. D'Acunto, CW; Kaplánek, R.; Gbelcová, H.; Kájík, Z.; Briza, T.; Vašina, L.; Havlík, M.; Ruml, T.; Král, V. Metalomika pro léčbu Alzheimerovy choroby: Použití nové generace chelátorů kombinující vazebné a transportní vlastnosti kov-kationt. Eur. J. Med. Chem. 2018, 150, 140–155. [CrossRef] [PubMed]

15. Wang, X.; Wang, X.; Guo, Z. Metal-involved theranostics: Objevující se strategie pro boj s Alzheimerovou chorobou. Coord. Chem. Rev. 2018, 362, 72–84. [CrossRef]

16. Shao, ML; Ma, XW; Wu, Z.; Yu, WM; Chen, XN Chinese Pharmacopoeia; Chemical and Industrial Publisher: Peking, Čína, 2005; p. 90.

17. Li, Z.; Lin, H.; Gu, L.; Gao, J.; Tzeng, C.-M. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): Jeden z nejlepších farmaceutických darů tradiční čínské medicíny. Přední. Pharmacol. 2016, 7, 41. [CrossRef] [PubMed]

18. Guo, Q.; Zhou, Y.; Wang, CJ; Huang, YM; Lee, YT; Su, MH; Lu, J. Otevřená, placebem nekontrolovaná studie o kapslích glykosidu Cistanche tubulosa (memo regain (R)) pro léčbu středně těžké Alzheimerovy choroby. Dopoledne. J. Alzheimer's Dis. Jiný Demen. 2013, 28, 363–370. [CrossRef]

19. Wu, ČR; Lin, HC; Su, MH Reverze pomocí vodných extraktů z Cistanche tubulosa z behaviorálních deficitů v modelu potkanů ​​podobných Alzheimerově chorobě: Relevance pro ukládání amyloidu a funkci centrálního neurotransmiteru. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]

20. Wang, YM; Zhang, SJ; Luo, GA; Hu, YN; Hu, JP; Liu, L.; Zhu, Y.; Wang, HJ Analýza fenylethanoidových glykosidů v extraktu herba Cistanchis pomocí LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Sinic. 2000, 35, 839-842.

21. Geng, XC; Tian, ​​XF; Tu, PF; Pu, XP Neuroprotektivní účinky echinakosidu u myšího MPTP modelu Parkinsonovy choroby. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66–74. [CrossRef]

22. Zhao, Q.; Yang, X.; Cai, D.; Ano, L.; Hou, Y.; Zhang, L.; Cheng, J.; Shen, Y.; Wang, K.; Bai, Y. Echinakosid chrání před MPP(plus)-indukovanou neuronální apoptózou prostřednictvím regulace dráhy ROS/ATF3/CHOP. Neurosci. Býk. 2016, 32, 349–362. [CrossRef] [PubMed]

23. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinakosid chrání před 6-hydroxydopaminem indukovanou mitochondriální dysfunkcí a zánětlivými reakcemi v buňkách PC12 prostřednictvím snížení produkce ROS. Evid. Založený doplněk. Alternativa. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

24. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Echinakosid zmírňuje poruchy paměti a cholinergní deficit vyvolané amyloid-beta peptidy prostřednictvím inhibice ukládání amyloidu a toxikologie. Funkce jídla. 2017, 8, 2283–2294. [CrossRef] [PubMed]

25. Shiao, YJ; Su, MH; Lin, HC; Wu, CR Akteosid a isoakteosid chrání amyloid-beta peptidem indukovanou cytotoxicitu, kognitivní deficit a neurochemické poruchy in vitro a in vivo. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18. [CrossRef]