Vliv simulace lidského trávení in vitro na obsah fenolických látek a biologické aktivity vodných extraktů z tureckého druhu Cistus část 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

3. Diskuse

Volné radikály mohou napadnout proteiny, lipidy nebo DNA, aby získaly elektron, což má za následek různé zdravotní problémy. Z tohoto důvodu je nezbytné vyvážit antioxidační systém těla a volné radikály vzniklé oxidací. V případě zhoršení této rovnováhy vzniká oxidační stres [29]. Oxidační stres je jedním z hlavních faktorů vedoucích k různým chronickým poruchám, jako je rakovina, cukrovka, kardiovaskulární onemocnění, Alzheimerova choroba atd. I když v lidském těle existují samo-antioxidační systémy, které bojují s oxidačním poškozením tkání a orgánů, tyto obranné systémy mohou ztratit svou účinnost v důsledku různých podmínek, jako je nadměrná konzumace alkoholu, kouření, stres, chronické užívání drog a radiace atd. [30]. Různé vědecké zprávy ukázaly, že sekundární rostlinné metabolity hrají významnou roli v prevenci oxidačního stresu a jeho škodlivých účinků [13,14,31] I když je biologická dostupnost důležitým parametrem ovlivňujícím biologickou aktivitu těchto sloučenin, nebyla brána v úvahu při většina studií. Je však dobře známo, že sekundární metabolity podléhají strukturálním transformacím v důsledku různých podmínek pH, enzymatické aktivity a tělesné teploty v gastrointestinálním systému. Kromě toho jsou významnými faktory ovlivňujícími jejich biologickou dostupnost také chemické vlastnosti sekundárních metabolitů, jako je molekulová hmotnost, polarita a stupeň vazby na makromolekuly v rostlinné matrici [13]. V souladu s tím je absorpce sloučenin nebo jejich metabolitů do krevního řečiště po požití nezbytná pro uplatnění jejich systémových fyziologických účinků. Simulační modely trávení in vitro mohou poskytnout důkazy pro posouzení možných charakteristik biologické dostupnosti látek. Zatímco potvrzení v humánních zkouškách je nezbytné pro tvrzení o jakékoli funkční vlastnosti, in vitro simulační modely se široce používají jako alternativy k in vivo studiím nebo humánním zkouškám, které jsou často eticky diskutabilní, náročné na zdroje, drahé a časově náročné [32].

Kliknutím sem se dozvíte více

Několik výzkumníků také zkoumalo antioxidační potenciál extraktů připravených z různých orgánů druhu Cistus. Podle literárního průzkumu se jedná o první studii na druzích Cistus týkající se biologické dostupnosti fenolických látek a jejich vlivu na antioxidační aktivitu pomocí simulačního modelu trávení in vitro. Karas a kol. [33] navrhli, že 10 procent polyfenolických složek zůstává nestráveno v rostlinné matrici a 90 procent z nich je podrobeno trávení v žaludeční nebo střevní fázi (přibližně 48 procent a 52 procent, v tomto pořadí). Jak již bylo zmíněno dříve, všechna fenolická množství ve vodných extraktech byla negativně ovlivněna postupem simulace lidského trávení in vitro. Byly tak zjištěny významné ztráty ve fenolických obsahech biodostupných vzorků všech extraktů. Kromě toho byly celkové koncentrace proanthokyanidinů ve vzorcích IN ve všech vodných extraktech pod hranicí detekce. Různé studie také podnítily negativní vliv procesu trávení na fenolické sloučeniny v rostlinných extraktech a tím související bioaktivity. Například jsme uvedli celkový obsah fenolů v Salvia virgata Jacq. byl také nepříznivě ovlivněn trávicím postupem v naší předchozí studii. Kromě toho množství hlavních metabolitů extraktu, tj. rutinu a kyseliny rozmarinové, mělo tendenci klesat [13]. Naproti tomu několik studií uvádí protichůdné výsledky. Ve studii Celeba a kol. [34] pozorovali zvýšení celkového množství fenolové kyseliny, flavonoidů a fenolů v biodostupných vzorcích metanolového extraktu z Hypericum perfoliatum L. Ve skutečnosti měly hlavní metabolity, kvercitrin, chlorogenová a gallová, poměr biologické dostupnosti přes 100 procento . Tyto studie ukázaly, že účinky procesu trávení se mohou lišit v závislosti na rostlinných materiálech. Pro objasnění těchto rozdílů je nezbytné zvážit mechanismus působení trávicího systému na fenolické látky. (výhody bioflavonoidů) Serra et al.[35] navrhl, že fenolové sloučeniny se nacházejí hlavně v glykosidech, polymerech a esterových formách v rostlinné matrici a jsou hydrolyzovány v trávicím systému před absorpcí. Strukturální přeměny fenolických sloučenin v gastrointestinálním traktu mohou ovlivnit různé faktory. Například sloučeniny s vyšší molekulovou hmotností, jako jsou proanthokyanidiny nebo prokyanidiny, musí být před absorpcí ve střevě hydrolyzovány. Struktura rostlinné matrice je také významným faktorem biologické dostupnosti fenolických látek; (koupit cistanche)fenolické sloučeniny se mohou vázat na makromolekuly v rostlinné matrici, jako jsou vlákna, proteiny a molekuly lipidů. Tedy pouze uvolněné fenolické složky z matrice se mohou stát absorbovatelnými z gastrointestinálního traktu. Rozdílné hodnoty pH a enzymatické působení střevní mikrobioty navíc patří k dalším rozhodujícím faktorům ovlivňujícím transformaci chemické struktury fenolických sloučenin [36]. Ve světle těchto údajů můžeme předpokládat, že odlišné výsledky získané z podobných typů experimentálních studií mohou být způsobeny složitostí trávicího systému a složením rostlinné matrice. Jak je uvedeno v tabulce 3, biologicky dostupné vzorky extraktů Cistus vykazovaly slabší antioxidační aktivitu než netrávené a postgastrické protějšky kvůli jejich nižšímu obsahu fenolů.

Cistancheumětzlepšit imunitu

Navíc oba extrakty C. saluifolius vykazovaly lepší antioxidační aktivitu v testech DPPH, CUPRAC, FRAP a TOAC ve srovnání s jinými druhy. Kromě toho oba extrakty C. paroifforus vykazovaly vyšší aktivitu vychytávání DMPD radikálů než extrakty jiných druhů. Jak je uvedeno v tabulce 1, celkový obsah fenolických látek, flavonoidů a kyseliny fenolové v C. salviifolius byl vyšší než v ostatních vzorcích. Vyšší antioxidační potenciál extraktů C. salviifolius tedy může souviset s jeho fenolickým obsahem.

Kromě toho snížení antioxidačních potenciálů, inhibičních aktivit na enzymy související se sacharidy a AGEs biodostupných vzorků může souviset s poklesem markerových flavonoidních glykosidů. Extrakty Cistus však obsahovaly i další fenolické látky, jak je znázorněno na obrázku 1. Pro sledování vlivu trávení na biologickou aktivitu je proto nutná podrobná chromatografická analýza extraktů.

Inhibiční potenciál rostlinných extraktů na trávicí enzymy v poslední době přitahuje větší pozornost kvůli obavám o bezpečnost syntetických inhibitorů. Inhibiční účinek rostlinných extraktů byl proto stanoven v několika studiích a tento účinek byl obecně spojován s fenolickými látkami, jako jsou flavonoidy, fenolové kyseliny, proanthokyanidiny atd. Sun et al. [37] navrhli, že polyfenolické sloučeniny projevují své inhibiční účinky vazbou s enzymy uvedenými výše pomocí hydrofobních sil a nekovalentních vazeb. Proto inhibice aktivity enzymů o-amylázy a a-glukosidázy polyfenoly souvisí s jejich molekulárními strukturami. I když byl tento mechanismus interakce studován pomocí různých technik, jako je kinetika inhibice, molekulární dokování, zhášení fluorescence atd., nebyl dosud učiněn žádný jistý závěr [38]. Četné studie však uvádějí, že inhibice trávicích enzymů rostlinných extraktů přímo souvisí s jejich fenolickým obsahem. Podobné studie o enzymatických inhibičních aktivitách druhů Cistus byly také popsány dříve. Sayah a kol. [39] zkoumali inhibiční aktivity -amylázy a -glukosidázy 8{{10}}% methanolických a vodných extraktů z C. monspeliensis a C. saluifolius. Jejich výsledky byly v souladu s touto studií a odhalily, že vodný extrakt C. salvifolius vykazoval vyšší o-glukosidázu (ICso ug/ml:0.95±0.14) a -amylázu (IC5{ {55}} ug/ml:217,1±0,15) inhibiční aktivitu než vodný extrakt C. monspeliensis （IC50 ug/ml∶ 14,58±1,26） a （IC50 4g/ml:886,10±0,10). Míry inhibice obou vodných extraktů na tyto enzymy byly vyšší než u referenční sloučeniny akarbózy (ICso ug/ml:18,01±2.00)Podobně jako v naší studii zjistili korelaci s mírami inhibice enzymů a celkovým množství fenolů a flavonoidů. Celkový obsah fenolických látek a celkový obsah flavonoidů ve vodném extraktu C. saloijfolius (408,43±1,09 mg GAE a 14000±1,15 RE) byly vyšší než ve vodném extraktu C. monspeliensis (261,76±1,9 mg GAE a 78.00±1,15 RE). Orhan a kol. [40] také zkoumali inhibiční potenciál trávicích enzymů 80% vodných a ethanolických extraktů z listů C.laurifolius. Podle jejich výsledků 80 procent ethanolového extraktu (71,7 procent ± 0,6) vykazovalo silnou inhibiční aktivitu na amylázu ve srovnání s vodným extraktem (39,3 procent ± 2,2) při koncentraci 1 mg/ml. Navrhli, že fenolové sloučeniny, zejména flavonoidy, přímo ovlivňují sekreci inzulínu tím, že zabraňují apoptóze beta-buněk a podporují antidiabetickou aktivitu. Tato hypotéza, korelující s našimi výsledky, ukazuje, že ND vzorek vodných extraktů C. salviifolius vykazoval nejvyšší celkový obsah flavonoidů a fenolů a největší inhibiční aktivity -amylázy a o-glukosidázy. Jak je uvedeno v tabulce 4, vodný extrakt C. salviifolius vykazoval lepší inhibiční aktivity na trávicí enzymy než ostatní extrakty. Navíc IN vzorky vodných extraktů obsahovaly nižší množství fenolů a flavonoidů než vzorky ND, a proto v této práci odhalily nižší enzymové inhibiční aktivity. Zatímco fenolické obsahy extraktů byly negativně ovlivněny procesem trávení, stále vykazovaly významnou inhibiční aktivitu na trávicí enzymy. V několika studiích byly flavonoidní glykosidy popsány jako hlavní metabolity rostlinných extraktů se silnými inhibičními potenciály -amylázy a -glukosidázy[41-43]Zatímco inhibiční mechanismus fenolických sloučenin na trávicí enzymy nebyl dosud odhalen, struktura- studie vztahu aktivity byly provedeny na některých fenolických složkách, jako jsou flavonoidy, fenolové kyseliny, proanthokyanidiny a taniny. Studie vztahu mezi strukturou a aktivitou flavonoidů ukázaly, že dvojná vazba C2=C3 C-kruhu zvyšuje potenciál těchto sloučenin inhibovat trávicí enzymy. Protože tato vazba zvyšuje elektronovou hustotu, zvyšuje se síla interakce mezi flavonoidem a enzymem [44]. Kromě toho hydroxylové skupiny na C-5 a C-7 usnadňují inhibiční potenciál flavonoidů na -amylázu. Bylo také navrženo, že hydroxylace skeletu flavonoidů pozitivně ovlivňuje jejich inhibiční potenciál enzymů a-amylázy a -glukosidázy[45]. Jak bylo uvedeno dříve, všechny markerové flavonoidy v této studii byly flavonolové glykosidy nesoucí výše popsané strukturální požadavky. Avšak po in vitro štěpení jejich související aktivity významně poklesly v biologicky dostupných vzorcích vodných extraktů.

Inhibiční potenciál rostlinných extraktů na AGE obecně souvisí s několika faktory, tj. s jejich fenolickým obsahem, antioxidačním potenciálem, schopností chelatovat kovy, proteinovými interakcemi a aktivitami blokujícími AGE receptory [13]. Jak je uvedeno v tabulce 4, biologicky dostupné vzorky vodných extraktů vykazovaly nižší AGE inhibiční aktivity ve srovnání se vzorky ND, protože in vitro štěpení nepříznivě ovlivnilo obsah fenolů v extraktech. Podle aktuálních výsledků studie byl vzorek ND vodného extraktu C. (cistanche a tongkat ali redditSaluifolius měl nejvyšší AGE inhibiční aktivitu, stejně jako celkový obsah fenolů a flavonoidů. Pro srovnání, IN vzorek vodného extraktu C. monspeliensis vykazoval nejslabší inhibiční potenciál AGE, což lze přičíst jeho nejnižšímu obsahu celkových flavonoidů a fenolů. Vzhledem k tomu, že flavonoidy jsou široce distribuovány v rostlinných extraktech, ovoci, zelenině a nápojích, několik studií zintenzivnilo inhibiční potenciál flavonoidů na formace AGE. Stejné flavonoidy přiřazené jako markerové fenolické látky v této studii byly také uvedeny jako markerové sloučeniny v jiných studiích[46-48].

Podobně jako u inhibice trávicího enzymu byly AGE inhibiční aktivity flavonoidů stimulovány dvojnou vazbou C2=C3 a hydroxylací kruhů A a C. Navázání cukru na flavonoidní kostru však vede ke snížení inhibiční aktivity [49]. Na druhé straně Cervantes-Lauren et al.[50] navrhl, že flavon-3-glykosidů měl větší inhibiční potenciál AGE než ostatní flavonoidní glykosidy. Tato hypotéza může být vysvětlením pro sníženou inhibici AGE v biologicky dostupných vzorcích. Například kvercitrin a hyperosid nebyly detekovány v biologicky dostupných vzorcích vodného extraktu C. monspeliensis, což je důvodem nižší aktivity IN vzorků C. monspeliensis ve srovnání s extrakty z jiných druhů. I když kvercitrin nebyl ve vodném extraktu C. saloifolius detekován, významně vyšší množství hyperosidu a salidrosidu může být příčinou jeho vysoké inhibiční aktivity AGE. Obecně byla pozorována pozitivní korelace mezi obsahem markerových flavonoidů ve vzorcích a jejich inhibičními potenciály na AGEs.

4. Materiál a metody

4.1.Chemikálie

Všechny reference, enzymy a chemikálie použité v experimentech byly zakoupeny od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). V experimentech byly použity materiály analytické kvality.

4.2. Vzorky rostlin

Letecké části C.creticus a C.saloifolius byly shromážděny z kampusu Yeditepe University (Kayisdagi, Istanbul) během posledního dubnového týdne 2018. Letecké části C.mon-speliensis a C. paroiflorus byly shromážděny z blízkosti Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir ve druhém květnovém týdnu 2018. Letecké části C. laurifolius byly odebrány z Kemer-Doganhisar road, Konya, v prvním červnovém týdnu 2018. Prof. Dr. Erdem Yesilada ověřil rostlinné materiály. Poukazové vzorky pro C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroiflorus (YEF18016) a C. salvifolius (YEF18014) byly uloženy na Herbářovém oddělení Fakulty farmacie farmacie, Yeditepe University, Istanbul, Turecko. 4.3. Postup extrakce

Vodná extrakce byla zvolena, protože se běžně používá jako technika přípravy v tradiční medicíně. Hrubě na vzduchu vysušené a práškové vzdušné části druhu Cistus (100 g) byly extrahovány horkou destilovanou vodou (80 stupňů, 1,5 1) za použití třepacího zařízení po dobu 15 minut. Poté byly vodné extrakty zfiltrovány přes filtrační papír a odpařeny do sucha za sníženého tlaku. Po dokončení lyofilizační procedury byly extrakty rozpuštěny v destilované vodě pro další zpracování (nenatrávený vzorek: ND) (výtěžek extraktů: 13,04 procenta pro C. creticus, 15,7 procenta pro C. laurifolus, 12,8 procenta pro C. monspeliensis ,14,94 procenta pro C.parviflorus,14,74 procenta pro C.salvifolius). 4.4. Metoda simulace lidského trávení in vitro

Simulační model lidského trávení byl aplikován na vzorky Cistus in vitro podle metody popsané dříve Celebem a kol.[34]. Nejprve bylo 1 g NaCl a 1,6 g pepsinu rozpuštěno v 500 ml destilované vody, aby se získal simulovaný roztok žaludeční tekutiny (SGF) Později bylo pH roztoku SGF upraveno na 2 pomocí HCl (5 M); 17,5 ml tohoto roztoku byla smíchána s 2,5 ml rostlinných vzorků a tato směs byla umístěna do třepací vodní lázně při 37 stupních po dobu 2 hodin, aby se napodobily peristaltické pohyby trávicího systému. Po 2 hodinách byly vzorky vloženy do ledové lázně, aby se inaktivovaly enzymatické reakce; 2 ml vzorků byly ponechány stranou jako "postgastrický" (PG) vzorek pro další experimenty. Celulózová dialyzační membrána naplněná správným množstvím NaHC03 (1 M, pH 7) byla umístěna ve studených roztocích vzorků; tak byla napodobena gastrointestinální absorpce. Poté bylo s roztoky spojeno 4,5 ml roztoku žlučových kyselin/pankreatinu a směs byla inkubována další 2 hodiny při 37 stupních. Nakonec byla tekutina uvnitř dialyzační membrány získána jako "biologicky dostupný" vzorek (IN). Po ukončení procedury byly všechny vzorky uchovány při -20 stupních pro další experimenty. 4.5. Odhad fenolického profilu in vitro 4.5.1. Test celkového obsahu fenolů Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu fenolů ve vzorcích bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle metody popsané dříve Barakem et al.【32】;75 ul NagCO3（20 procent v H2O ） byl přidán do 20 μl čerstvě připraveného vzorku a referenčních roztoků. Poté bylo se směsí smícháno 100 ul Folin-Ciocalteuova činidla. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti ve tmě byla měřena absorbance při 690 nm. Kyselina galová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky a celkový obsah fenolů byl vyjádřen jako ekvivalenty kyseliny gallové (GAE). 4.5.2. Test celkového obsahu flavonoidů Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu flavonoidů ve vzorcích bylo řízeno v šabloně 96-jamkové destičky v souladu s dříve vysvětlenou metodou Bardakci et al. 【51】; 150 μl 75% ethanolu, 10 μl chloridu hlinitého a 10 μl 1M trihydrátu octanu sodného bylo odděleně kombinováno s 50 ul roztoku vzorku a referenčního roztoku. Poté byly tyto směsi inkubovány při teplotě temné místnosti po dobu 30 minut. Po inkubační době byla vypočtena absorbance při 405 nm. Kvercetin byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro sestavení kalibrační křivky a celkový obsah flavonoidů byl reprezentován jako ekvivalenty kvercetinu (QE).

4.5.3. Zkouška celkového obsahu kyseliny fenolové

Celkový obsah fenolové kyseliny ve vzorcích byl měřen spektrofotometricky podle postupu popsaného dříve Barakem et al. [52]. Nejprve byla správná množství dusitanu sodného a molybdenanu sodného rozpuštěna v destilované vodě, aby se získalo Arnowovo činidlo. Poté byl 1 ml vzorků oddělen s 1 ml Arnowova činidla, 1 ml 0,1 M HCl a 1 ml 1 M NaOH. Poté byl objem směsi upraven na 10 ml destilovanou vodou a okamžitě byla odečtena absorbance při 490 nm. Kyselina kávová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky a celkový obsah kyseliny fenolové byl uveden jako ekvivalenty kyseliny kávové (CAE).

4.5.4. Zkouška celkového obsahu proanthokyanidinů

Spektrofotometrické stanovení celkového obsahu proanthokyanidinů ve vzorcích bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle metody Baraka et al. [11]. Stručně, 25 ul roztoků vzorků bylo smícháno se 150 ul 4% vanilinu a 75 ul roztoků HC1 (32 procent), v daném pořadí. Po 15 minutách inkubace při teplotě temné místnosti byla absorbance upravena na 492 nm. Katechin hydrát byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Jako kontrolní roztok byl použit methanol. Celkový obsah proanthokyanidinů ve vzorcích byl uveden jako ekvivalenty katechinů (CE).

4.6. Testy aktivity vychytávání volných radikálů 4.6.1. Test aktivity pohlcování radikálů DPPH

Aktivita vychytávání radikálů DPPH vzorků byla stanovena v 96-jamkové destičce podle metody upravené Celebem et al.[53]. Nejprve bylo čerstvě připraveno 150 uM roztoku DPPH. Poté bylo 200 ul roztoku DPPH smícháno s 25 ul roztoků vzorků. Poté byla tato směs inkubována při teplotě temné místnosti po dobu 50 minut. Absorbance byla vypočtena při 540 nm. Butylovaný hydroxytoluen (BHT) byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích. Jako kontrolní roztok byl použit methanol. Aktivita vzorků byla prezentována jako EC50, odpovídající koncentraci vykazující 50% aktivitu.

4.6.2. Test aktivity DMPD zachycující radikály

Aktivita zachycování radikálů DMPD* (N,N-dimethyl-p-fenylendiamin) vzorků byla prováděna v templátu 96-jamkové destičky podle metody popsané dříve Inanem et al. [13]. Za prvé, 10{{10}} mM roztok DMPD plus, 0,05 M FeCl; 6H20 roztok a 0,01 M acetátový pufr byly čerstvě připraveny. Poté byl smíchán 1 ml roztoku DMPD, 100 ml acetátového pufru a 0,2 ml roztoku FeCl3-6H2O a později bylo 15 ul roztoků vzorků smícháno s 210 μl této směsi. Po inkubační době při teplotě temné místnosti po dobu 50 minut byla měřena absorbance při 492 nm. Trolox byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Koncentrace roztoků vzorků byly 1 mg/ml. Aktivity DMPD pohlcující radikály vzorků byly uvedeny jako ekvivalenty Troloxu (TE). 4.7. Zkoušky aktivity snižující kov

4.7.1. Ferric Reducing Antioxidant Power Assay (FRAP)

Stanovení FRAP aktivity vzorků bylo provedeno na 96jamkové destičce podle postupu popsaného dříve Bardakci et al.[54]. Na začátku experimentu bylo činidlo FRAP vytvořeno smícháním roztoků acetátového pufru, tripyridyltriazinu železitého a FeCl;6H2O. Poté bylo činidlo FRAP vloženo do 37stupňové pece na 30 min. Poté bylo 10 ul roztoků vzorků smícháno s 30 ul destilované vody a 260 ul FRAP činidla, v daném pořadí. Po inkubační době při 37 stupních po dobu 30 minut byla absorbance upravena na 593 nm. K vyhodnocení výsledků byla vytvořena standardní křivka použitím různých molarit roztoku síranu železnatého (0,{15}} mM). BHT byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích. FRAP aktivity vzorků byly prezentovány jako mM FeSO4 v 1 g suchého extraktu.

4.7.2. Test antioxidační kapacity snižující měď (CUPRAC)

Aktivita CUPRAC vzorků byla stanovena v 96-jamkové destičce templátu podle metody upravené Celebem et al. 【31】; 85 μl CuSO4 （10 mM）, roztoky neocuprainu a octanu amonného a 51 ul destilované vody bylo přidáno do 43 ul roztoků vzorků, odděleně. Po inkubační době (20 minut) při 50 stupních ve vodní lázni byla měřena absorbance při 450 nm. Kyselina askorbová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Aktivity CUPRAC vzorků byly prezentovány jako ekvivalenty kyseliny askorbové (AAE). 4.8. Test celkové antioxidační aktivity (TOAC)

Stanovení celkové antioxidační aktivity vzorků bylo provedeno na 96-jamkové destičce podle postupu Celeba et al. [55]. Nejprve bylo smícháno určité množství dihydrogenfosforečnanu sodného, ​​tetrahydrátu molybdenanu amonného a kyseliny sírové, aby se získal roztok oktaacetátu trehalózy. Poté bylo 300 ul roztoku oktaacetátu trehalózy přidáno do 30 ul roztoků vzorků. Po inkubační době při 95 stupních ve vodní lázni po dobu 90 minut byla stanovena absorbance při 690 nm. Kyselina askorbová byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích pro získání kalibrační křivky. Aktivity oktaacetátu trehalózy vzorků byly reprezentovány jako ekvivalenty kyseliny askorbové (AAE). 4.9. Odhad indexu biologické dostupnosti

Index biologické dostupnosti (BAvI) byl vypočten podle teoretické rovnice popsané v Inan et al.[13]:

BAVI=CIN/CND „Index biologické dostupnosti“ (BAvI) byl popsán jako poměr počtu fenolických látek v biologicky dostupném vzorku (IN) k počtu v nenatráveném vzorku (ND). 4.10. Kvantifikace markerových flavonoidů pomocí HPTLC

Kvantitativní stanovení koncentrací salidrosidu, hyperosidu a kvercitrinu ve všech simulačních vzorcích (ND, PG, IN) vodných extraktů z druhů Cistus bylo provedeno pomocí vysokoúčinné tenkovrstvé chromatografie (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Švýcarsko). podle metody ověřené Guzelmericem et al. [16]. Hyperosid, salidrosid a kvercitrin byly připraveny v koncentracích 25,50 a 10{{30}} ug/ml a koncentrace čerstvě připravených roztoků vzorků byly upraveny na 10 mg/ml. Tyto roztoky byly aplikovány na normální fázi silikagelové desky se skleněným podkladem (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Německo） s určitými objemy (1-5 μl standardních roztoků a 5 μl roztoků vzorků) pomocí 100 μl injekčních stříkaček（ Hamilton, Bonaduz, Švýcarsko） Postup aplikace byl proveden pomocí aplikátoru vzorků Linomat 5. Proces vývoje byl proveden v automatické vývojové komoře (ADC 2) a ethylacetát:dichlormethan, kyselina octová, kyselina mravenčí: voda (10:25:10 :10:10:10me) byla vybrána jako mobilní fáze. Poté byly destičky derivatizovány pomocí Natural Product Reagent (NPR) (1 g 2-aminoethylesteru kyseliny difenylborité ve 200 ml ethylacetátu) v imerzním zařízení (CAMAG) Zatímco hyperosid a kvercitrin byly analyzovány spektrofotometricky při 260 nm, množství salidrosidu bylo měřeno při 330 nm UV skenerem. Hodnoty Rf standardů byly stanoveny jako hyperosid （0,35）, kvercitrin）(c0,45）, tilirosid） 0,65）. Korelační koeficienty（r²）byly zjištěny jako být ×0,98 pro kvantifikaci markerových flavonoidů.

4.11. Inhibiční aktivita na enzymy související s diabetem 4.11.1. - Inhibiční aktivita glukosidázy

-glukosidázové inhibiční aktivity neštěpených a biologicky dostupných vzorků získaných z vodných extraktů druhů Cistus byly zkoumány podle metody dříve vysvětlené Balanem et al. [56]. Nejprve byla správná množství fosforečnanu sodného a fosforečnanu sodného smíchána se získáním 100mM fosfátového pufru (pH7). ac glukosidázový enzym byl rozpuštěn ve fosfátovém pufru, aby byl získán roztok -glukosidázy (0,2U/ml). Poté bylo smícháno 170 ul fosfátového pufru, 20 μl roztoku -glukosidázy a 20 μl roztoků vzorků a inkubováno v sušárně při 37 stupních po dobu 15 minut. Poté bylo ke směsi přidáno 20 ul 2,5 mM roztoku p-nitrofenyl- -D-glukopyranosidu ve 100mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,0) a byla provedena další inkubační perioda při 37 stupních po dobu 15 minut. Poté bylo ke směsi přidáno 80 ul 0,2 M roztoku uhličitanu sodného pro ukončení reakce. Absorbance byla měřena při 405 nm. Jako referenční byl použit roztok kvercetinu v různých koncentracích. Výsledky byly odhadnuty jako procento inhibiční aktivity v 1 mg/ml a 0,5 mg/ml koncentracích ND a IN vzorků vodných extraktů druhů Cistus.

4.11.2. -Amylázová inhibiční aktivita

Inhibiční aktivita na amylázu u nestrávených a biologicky dostupných vzorků získaných z vodných extraktů druhů Cistus byla stanovena podle postupu popsaného dříve Balanem a kol.[56]. Spektrofotometrické stanovení inhibičních aktivit a-amylázy vzorků bylo provedeno za použití činidla DNS (kyselina 3,5-dinitrosalicylová). Jak je uvedeno v metodě, maltóza vzniká přeměnou škrobu a žlutá barva alkalického DNS se změní na oranžovo-červenou barvu v důsledku maltózy vyrobené ze škrobu. Takto byl připraven 96 mM roztok DNS ze směsi roztoku vinanu sodnodraselného (rozpuštěného ve 2 M NaOH) a určitého množství DNS (rozpuštěného v destilované vodě). Poté byl připraven 20mM pufr fosforečnanu sodného s 6,7mM NaCl (kofaktor enzymu a-amylázy) při 20 stupních (pH:6,9). enzym a-amyláza (1 U/ml) a škrob (10 mg/ml) byly rozpuštěny v tomto pufru. Poté bylo 50 μl pufru fosforečnanu sodného a 10 μl roztoku enzymu a-amylázy smícháno s 20 μl roztoků vzorků. Tato směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 45 minut. Po inkubační době bylo ke směsi přidáno 20 μl škrobového roztoku. Další inkubační doba byla zahájena při 37 stupních po dobu 45 minut. Stejný postup byl aplikován na vzorky bez přidání roztoku enzymu o-amylázy nazývaného "pozadí vzorku". Kontrolní skupina byla studována stejným postupem v nepřítomnosti roztoků vzorků. Absorbance byla měřena při 540 nm. Akarbóza byla použita jako referenční roztok v různých koncentracích. Výsledky byly prezentovány jako procento inhibiční aktivity v koncentracích 1 mg/ml a 0,5 mg/ml vzorků ND a IN z vodných extraktů druhů Cistus. 4.11.3. VĚK Inhibiční aktivita

AGE inhibiční aktivita neštěpených a biologicky dostupných vzorků z vodných extraktů druhů Cistus byla stanovena podle metody popsané Starow-icz et al. [57]. Před jakýmkoli procesem byly čerstvě připraveny koncentrace ND a IN vzorků 1 mg/ml a 0,5 mg/ml. Poté byl 1 ml roztoku bovinního sérového albuminu (BSA) o koncentraci 10 mg/ml přidán k 1 ml roztoků vzorků ND a IN. Kontrolní vzorky byly připraveny bez přidání ND a IN vzorkových roztoků a slepé vzorky byly připraveny bez přidání 0,5 M glukózy. Poté byly všechny připravené vzorky inkubovány po dobu 40 hodin v třepané vodní lázni při 55 stupních. Po skončení inkubační doby byla pro výpočet intenzity fluorescence použita čtečka mikrodestiček Thermo ScientificTM VarioskanTMLUXmultimode v rozsahu excitace 370 nm/440 nm emise. Quercetin byl použit jako referenční roztok v různých koncentracích.

5. Závěry

V této studii byly zkoumány vodné extrakty všech druhů Cistus zaznamenaných v turecké flóře na jejich fenolické profily a in vitro antioxidační a antidiabetický potenciál. Vzhledem k tomu, že odvar nebo infuze jsou běžnou formou v tradiční medicíně, je použití vodných extraktů pro hodnocení aktivity v experimentálních studiích obzvláště důležité. Na druhé straně hydrofilní složky ve vodném extraktu podléhají řadě metabolických přeměn v gastrointestinálním systému, jakmile jsou požity. Pro správné vyhodnocení aktivity tradičních formulací by proto měly být zkoumány také aktivity biologicky dostupných metabolitů.

Toto je první studie, která zkoumá důsledky in vitro simulační metody lidského trávení na turecké druhy Cistus. Kromě toho byl v této studii poprvé studován inhibiční potenciál tureckých druhů Cistus na AGE. Dále byly salidrosidu, hyperosidu a kvercitrinu přiřazeny markerové flavonoidy a změny jejich koncentrací byly sledovány v in vitro štěpení. Zatímco obsah fenolů a antidiabetické a antioxidační aktivity extraktů byly negativně ovlivněny gastrointestinálními trávicími procedurami, stále vykazovaly významnou bioaktivitu. Podle výsledků byl extrakt C. salviifolius detekován jako nejúčinnější rostlina z hlediska obsahu fenolů a antioxidačních a antidiabetických aktivit. Závěrem lze říci, že nadzemní části z tureckých druhů Cistus mají bohatý obsah fenolů a potenciální antioxidační a antidiabetické aktivity. I když byla k hodnocení biologické dostupnosti použita metoda simulace trávení in vitro, nemusí plně napodobovat metabolické dráhy vyskytující se v organismu. Proto jsou nutné další in vivo a klinické studie, aby se podrobně vyhodnotila biologická dostupnost fenolických sloučenin a jejich podíl na uváděných farmakologických účincích.

Příspěvky autora:Konceptualizace, YI, EC, EY; metodologie, YI, SA, IK, EC formální analýza, YI, IK.-C., SA; vyšetřování, YI, IK.-C, SA; zdroje, YI, IK.SA, EC a EY; zpracování dat, YI, IK-C., SA; psaní-—YI, psaní—recenze a editace, YI, EC, EY; vizualizace, YI; dohled, ECa EYVšichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:Tento výzkum nezískal žádné externí financování. Prohlášení institucionální revizní komise: Neuplatňuje se. Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat:Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Vzorová dostupnost:Vzorky sloučenin nejsou u autorů k dispozici.

Tento článek je extrahován z Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules