Nanozymy napodobující katalázu snímající zánět zmírňují akutní poškození ledvin prostřednictvím zvrácení místního oxidačního stresu Ⅳ
Jun 19, 2024
Závěr
Organické byliny pro onemocnění ledvin
Materiály a metody
Materiály
Syntéza a charakterizace nanočástic dMn3O4
Syntéza TK linkeru, TK linker-konjugovaného polyethylenglykolu (PEG-TK) a (PEG)-stearin (C18) konjugátu (PTC) byla provedena podle naší předchozí publikace [15]. Jako kontrolu jsme také připravili ROS-necitlivý polymer (PC) konjugací kyseliny stearové k PEG-AM. Stručně řečeno, 200 mg m-PEG aminu reagovalo se 160 mg kyseliny stearové se 160 ul TEA, 480 mg EDC a 290 mg NHS ve 20 ml DMF při 37 stupních přes noc za míchání a profukování N2. Vzorek byl poté purifikován dialýzou (MWCO=12–14 KDa) proti DW po dobu jednoho dne a následně lyofilizací. Chemické struktury syntetizovaného PTC a PC byly potvrzeny pomocí protonové nukleární magnetické rezonance (1H NMR) spektroskopie (400 Hz, Bruker: Billerica, MA, USA) v chloroformu (CHCI3). Prázdné micely PTC citlivé na ROS a prázdné micely PC bez citlivosti na ROS byly připraveny samosestavením PTC a PC za použití ultrazvuku a dialýzy.
Příprava a charakterizace enzymu citlivého na ROS (PTC‑M)
PTC-M byl připraven dialyzační metodou. Ve stručnosti, 2 mg dMn304 a 10 mg PTC byly rozpuštěny v 1 ml bezvodého dimethylsulfoxidu (DMSO). Směs byla poté přidána po kapkách do 20 ml DW za sonikace sondou (30% amplituda, 5 s ON/OFF, 5 min). Roztok byl poté dialyzován (MWCO=12–14 KDa) proti DW po dobu jednoho dne, poté následovalo lyofilizace. Podobně byly jako kontrolní skupina připraveny také dMn3O4 NP-naplněné ROS-necitlivé nano micely (PC-M). Hydrodynamické průměry a zeta potenciál připravených prázdných nanomicel (PTC a PC) a dMn3O4 NP naložených nanomicel (PTC-M a PC-M) byly hodnoceny dynamickým rozptylem světla (přístroj Zetasizer Nano Z, Malvern, UK). Morfologie připravených PTC a PTC-M byla vizualizována pomocí FE−TEM. Destabilizace citlivá na Te ROS prostřednictvím degradace TK linkeru PTC-M byla pozorována analýzou DLS a FE-TEM po ošetření vzorků 1 mM H202. Obsah dMn3O4 v konečném PTC-M byl analyzován pomocí termogravimetrického analyzátoru (TGA N-1000, Scinco, Soul, Korea) a analýzy ICP-MS (820 ICPMS Varian Bruker, Billerica, MA, USA). .
Rozklad H2O2 na vodu a kyslík byl také potvrzen použitím Ru(DDP) jako sondy pro tvorbu kyslíku. Stručně, ke vzorkům byla přidána 1 mM H202 a následněpřidáním 1 uM Ru(dDDP(DMF). Vzorkybyly důkladně promíchány a intenzita fluorescencepři excitaci 440 nm a emisi 530 – 730 nm bylzaznamenané. Později byla potvrzena i produkce kyslíkustanovením koncentrace rozpuštěného kyslíku pomocísenzor rozpuštěného kyslíku (RDO Optical Dissolved Sensor, Thermo Scientific).
Buněčná kultura a činidla
Studie in vitro byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [37]. Stručně řečeno, lidské renální proximální tubulární epiteliální buňky (HK-2 buňky, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) byly použity pro i vitro studie. Buňky HK-2 byly kultivovány a pasážovány každé 3–4 dny v 100-mm miskách obsahujících kombinaci Dulbeccova modifikovaného Eagle's (DMEM) a Hams F-12 média (Welgene, Daegu, Korea) doplněno 10% fetálním bovinním sérem (FBS; Welgene), 100 U/ml penicilinua 100 mg/ml streptomycinu (Sigma-Aldrich). TeBuňky HK-2 byly poté inkubovány ve zvlhčené atmosféře5% CO2a 95 % vzduchu při 37 stupních po dobu 24 hodin a podkultivováno do 70 – 80 % konfluence. Byly to buňky HK-2naneseno na 60-mm misky v médiu obsahujícím 10 %FBS a inkubovány po dobu 24 hodin. Buňky byly poté inkubovány
Životaschopnost buněk
Buněčný příjem
Průtoková cytometrie
Analýza průtokovou cytometrií byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [38]. K měření úrovně vazby annexinu V podle pokynů výrobce byla použita souprava pro barvení annexin V FLUOS (SigmaAldrich). Stručně řečeno, po ošetření 0 nebo 1 mM H2O2 po dobu 24 hodin s nebo bez 2 ug předběžného ošetření PTC-M byly buňky HK-2 sklizeny a dvakrát promyty předem vychlazeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a resuspendovány ve vazebném pufru obsahujícím annexin V. Po inkubaci ve tmě po dobu 15 minut byly buňky analyzovány průtokovou cytometrií (Becton–Dickinson, San Jose, CA, USA). K optimalizaci nastavení přístroje a určení hradlování pro platformu Windows bylo použito několik ovládacích prvků. Apoptotické buňky byly definovány jako PI-negativní a Annexin V-FITC pozitivní.
Stanovení intracelulární tvorby ROS
Ke stanovení tvorby ROS jsme použili fluorofor DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), jak bylo popsáno dříve [38]. HK-2 buňky byly inkubovány s 0 nebo 1 mM H2O2 po dobu 24 hodin s nebo bez 2 ug PTC-M předběžné úpravy a dvakrát promyty Hankovým vyváženým solným roztokem, poté inkubovány s Hankovou vyváženou solí roztok (bez fenolové červeně) obsahující DCF-DA po dobu 30 minut při 37 stupních ve tmě. Snímky byly získány fluorescenčním mikroskopem (Nikon, Tokio, Japonsko).
Experimentální zvířata a protokoly
Biodistribuce in vivo
Pro kontrolu terapeutického účinku PTC-M in vivo byla léčené skupině po operaci podána jedna dávka 0,5 mg/kg PTC-M injekcí do ocasní žíly. Myšibyli usmrceni po 48 hodinách reperfuze. Vzorky krvebyly shromážděny ze srdce alevá ledvinabylrychle odstranit a zpracovat pro Western blotting nebofixován ve 4% roztoku paraformaldehydu pro imunohistochemie (IHC). Thepravá ledvinabyl zamrzlý na−80 stupňůpro analýzu polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase.
Měření plazmy NGAL
Semikvantitativní imunoblotování
Analýza Western blot byla provedena, jak bylo popsáno dříve [37]. Tkáně ledvin byly homogenizovány v ledově chladném izolačním roztoku obsahujícím 0,3 M sacharózu, 25 mM imidazol, 1 mM kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA), 8,5 mM leupeptin a 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid (pH 7,2). Homogenáty byly centrifugovány při 4000×g po dobu 15 minut při 4 stupních, aby se odstranily celé buňky, jádra a mitochondrie. Celková koncentrace proteinu byla měřena testovací soupravou bicinchoninové kyseliny (BCA) (Pierce; Rockford, IL, USA). Všechny vzorky byly upraveny tak, aby bylo dosaženo stejných konečných koncentrací proteinu. Poté byly rozpuštěny při 65 stupních po dobu 15 minut ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecylsulfát sodný (SDS) a skladovány při -20 stupních. Pro potvrzení rovnoměrného naplnění proteinů byl počáteční gel obarven Coomassie modří. SDS–polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) byla provedena na 9 nebo 12% polyakrylamidových gelech. Proteiny byly elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózové membrány (Hybond ECL RPN3032D; Amersham Pharmacia Biotech; Little Chalfont, UK) za použití přístroje Bio-Rad Mini Protean II (Bio-Rad; Hercules, CA, USA). Bloty byly blokovány 5% mlékem v PBS-T (80 mM Na2HP04, 20 mM NaH2P04, 100 mM NaCl a 0,1 % Tween -20 při pH 7,5) po dobu 1 hodiny; inkubováno přes noc při 4 stupních s primárními protilátkami; a poté inkubovány se sekundárními protilátkami konjugovanými s anti-králičí, anti-myší nebo anti-kozí křenovou peroxidázou. Imunobloty byly poté vizualizovány pomocí zesíleného chemiluminiscenčního systému. Hladiny proteinů byly kvantifikovány pomocí denzitometrie. Relativní intenzity signálů imunoblotu byly měřeny denzitometrií pomocí softwaru Scion Image for Windows (Scion Corporation, 2000–2001. verze Alpha 4.0.3.2. MD, USA) a vyjádřeny jako násobky změn vzhledem ke kontrolám. Primární a sekundární protilátky používané při imunoblotování jsou uvedeny v tabulce S1.
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (PCR v reálném čase)
Analýza polymerázové řetězové reakce byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [37]. Renální kůra byla homogenizována v činidle Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). RNA byla extrahována chloroformem, vysrážena isopropanolem, promyta 75% ethanolem a poté rozpuštěna v DW. Koncentrace RNA byla stanovena pomocí absorbance při 260 nm (Ultraspec 2000; PharMacia Biotech, Cambridge, UK). Exprese mRNA zánětlivých cytokinů a adhezních molekul byla stanovena pomocí PCR v reálném čase. cDNA byla vyrobena reverzní transkripcí 5 ug celkové RNA s použitím oligo (dT) primeru a reverzní transkriptázy II (InvitRogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA byla kvantifikována pomocí systému Smart Cycler II (Cepheid, Sunnyvale, CA, USA) a pro detekci byl použit SYBR Green. Každá PCR reakce byla provedena v 10 pM dopředném primeru, 10 pM reverzním primeru, 2X SYBR Green Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC, Seta 3-4-1, Japonsko), 0,5 ul cDNA a H2O, aby byl konečný objem 20 ul. Relativní hladiny mRNA byly stanoveny pomocí PCR v reálném čase za použití detektorového systému Rotor-GeneTM 3000 (Corbette research, Mortlake, NSW, Austrálie). Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkovém souboru 1: Tabulka S2. PCR byla provedena podle následujících kroků: 1) 95 stupňů po dobu 5 minut; 2) 95 stupňů po dobu 20 s; 3) 58 až 60 stupňů po dobu 20 s (optimalizováno pro každý pár primerů) a 4) 72 stupňů po dobu 30 s pro detekci SYBR Green. Kroky 2 – 4 byly opakovány po dalších 40 cyklů, zatímco na konci posledního cyklu byla teplota zvýšena z 60 na 95 stupňů, aby se vytvořila křivka tání. Data z reakce byla shromážděna a analyzována pomocí Corbett Research Software. Srovnávací kritické prahové hodnoty ze čtyřnásobných měření byly použity k výpočtu genové exprese, s normalizací na GAPDH jako vnitřní kontrolou. Pro zvýšení specificity amplifikační reakce byla provedena analýza křivky tání.
Histologie
Příprava ledvinové tkáně probíhala tak, jak bylo popsáno dříve [37]. Tkáně ledvin byly fixovány 4% paraformaldehydem, zalité v parafínu a nařezány na 3- μm silné řezy. Barvení kyselinou jodovou-Schif bylo provedeno podle pokynů výrobce (Abcam, Cambridge, MA, USA). Pro imunohistochemii byly deparafinizované tkáňové řezy získány antigenem zahřátím na 1{{10}}}0 stupeň po dobu 15 minut v citrátovém pufru, pH 6.0 (Sigma- Aldrich). Řezy byly inkubovány přes noc při 4 stupních s primárními protilátkami zředěnými v blokovacím pufru (1% [hmot./obj.] hovězí sérový albumin rozpuštěný v 0,3% [obj./obj.] Triton X-100 připravený v PBS [0,3% PBS- T]). Poté, co byly řezy krátce třikrát promyty 0,3% PBS-T, byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se sekundárními protilátkami zředěnými v blokovacím pufru. Skóre tubulárního poranění bylo vypočteno dříve popsanou metodou [39, 40]. Skóre tubulárního poranění bylo měřeno vyšetřením kortikomedulární junkce větší nebo rovné 10 HPF (zvětšení × 200) v řezech barvených PAS (n=5–7). Primární a sekundární protilátky použité v imunohistochemických analýzách jsou uvedeny v tabulce S3. Apoptóza tubulárních epiteliálních buněk byla detekována barvením TUNEL s ApopTag Plus Peroxidase In situ Apoptosis Kit (Sigma-Aldrich), podle pokynů výrobce. Tkáňové řezy všech hlavních orgánů byly odebrány zalité v parafínu a obarveny hematoxylinem/eosinem (H&E) pro porovnání histologických změn.
Statistická analýza
Výsledky jsou vyjádřeny jako střední standardní chyba průměru (SEM). Vícenásobná srovnání mezi třemi skupinami byla provedena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) a post hoc Tukeyho poctivě signifikantního rozdílového testu. Rozdíly s p-hodnotami menšími než 0,05 byly považovány za významné.
