In vitro hodnocení nejaktivnějších probiotických kmenů schopných zlepšit funkce střevní bariéry a zabránit zánětlivým onemocněním gastrointestinálního systémuⅡ

2. Materiály a metody

2.1. Buněčné kultury

Buňky Caco{0}} lidského adenokarcinomu tlustého střeva Caco (ATCC® HTB-37™) a buňky HT29-MTX vylučující epiteliální hlen lidského tlustého střeva (Sigma Aldrich) byly nejprve kultivovány odděleně, obě za použití Médium DMEM (Gibco) doplněné 10% fetálním hovězím sérem (Gibco), 100 IU/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu (Gibco) a 2 mM glutaminu (Gibco), při 37 °C v atmosféře 5% CO2. Poté byly společné kultury naneseny na 12-wellTranswell® destičky (s 12 mm polykarbonátovou vložkou a 0,4 µm póry) nanesením buněk do basolaterálního kompartmentu v poměru 75:25 Caco-2:HT 29-MTX a provádí se po dobu 21 dnů, přičemž médium se mění každé 2 dny.

Kliknutím rychle zmírníte zácpu

2.2. Bakteriální kmeny

Kmeny Lactobacillus, včetně Limosilactobacillus fermentum izolovaného z buvolího mléka [32], Levilactobacillus brevis SP-48, Lacticaseibacillus rhamnosus IMC501, Limosilactobacillus reuteri LR92 a Lacticaseibacillus paracasei – projekt IMCSA502, byly poskytnuty projektem IMCIBSA502, D kultivován v bioreaktorové fermentaci procesy a lyofilizací za získání prášků použitých jako výchozí materiál. Před experimentem byly prášky resuspendovány a pěstovány v Man, Rogosa a Sharpe bujónu (MRS-Oxoid) při 37 ◦C v mikroaerofilních podmínkách po dobu 24 hodin.

2.3. Buněčná léčba

Kokultivované buňky byly ošetřeny různými kmeny Lactobacillus spp. (108 CFU/ml) při multiplicitě infekce (MOI) 100, samostatně nebo v kombinaci s 20 µg/ml lipopolysacharidu (LPS) S. Typhimurium, po dobu 24 hodin při 37 ◦C při 5 % CO2 v DMEM bez antibiotik.

2.4. PCR v reálném čase

K vyhodnocení exprese prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů, HBD-2 a TJs, byly buňky na konci ošetření třikrát promyty sterilním PBS a celková RNA byla extrahována pomocí sady High Pure RNA Isolation Kit ( Roche Diagnostics). Celkem 2{{2{29}}}}}0 ng buněčné RNA bylo reverzně transkribováno (Expand Reverse Transcriptase, Roche) do komplementární DNA (cDNA) pomocí náhodných hexamerových primerů (randomhexamers, Roche) při 42 ◦C po dobu 45 min, podle pokynů výrobce. PCR v reálném čase pro IL-6, IL-8, TNF-, IL-1, TGF-, HBD-2, Ocludin, Zonulin-1 a Claudin{{ 14}} bylo provedeno pomocí sady LC Fast Start DNA Master SYBR Green (Roche Diagnostics) s použitím 2 µl cDNA, což odpovídá 10 ng celkové RNA v konečném objemu 20 µl, 3 mMMgCl2 a 0,5 µM sense a antisense primerů ( Stůl 1). Po amplifikaci byla analýza křivky tání provedena zahříváním na 95 ◦C po dobu 15 s při rychlosti přechodu teploty 20 ◦C/s, ochlazením na 60 ◦C po dobu 15 s s rychlostí přechodu teploty 20 ◦C/s, a poté zahřívání vzorku rychlostí 0,1 ◦C/s až 95 ◦C. Výsledky byly poté analyzovány pomocí softwaru LightCycler (Roche Diagnostics). Standardní křivka každého páru primerů byla vytvořena sériovým ředěním cDNA. Všechny PCR byly provedeny v triplikátech. Specifičnostamplifikačních produktů bylo ověřeno pomocí elektroforézy na 2% agarózovém gelu a vizualizací barvením ethidium bromidem [6].

2.5. Test ELISA

Přítomnost IL-6, IL-8, IL-1, TNF-, TGF-, HBD-2, Zonulin-1, Occludin a Claudin{{7 }} v buněčných lyzátech kokultur Caco-2/HT29-MTX infikovaných různými kmeny laktobacilů s nebo bez LPS byl analyzován pomocí enzymatického imunosorbentního testu (ELISA; Invitrogen, IL{{12 }}, IL-8, IL-1 alfa, TNF alfa a TGF beta{15}} HumanELISA Kit; Phoenix Pharmaceuticals, Inc. Defensin 2, beta (Human)—ELISA Kit; Elabscience Biotechnology Inc. Souprava ELISA pro lidský Zonulin, lidský OCLN (Occludin) a lidský CLDN1 (Claudin 1).

2.6. Test adheze a invazivity

Schopnost L. brevis, L. reuteri a L. rhamnosus snižovat adhezivní a invazivní schopnost S. Typhimurium a EIEC ve střevních kokulturách byla zkoumána ve třech různých experimentálních typech: (i) kompetitivní test, ve kterém byly inkubovány střevní epiteliální buňky současně s laktobacily (108 CFU/ml) a S. Typhimuriumor EIEC (108 CFU/ml) po dobu 2 hodin. (ii) Inhibiční test, ve kterém byly buňky preinkubovány s laktobacily (108 CFU/ml) po dobu 2 hodin a poté byly přidány S. Typhimurium nebo EIEC (108 CFU/ml) a inkubovány další 2 hodiny. (iii) Test vytěsnění, ve kterém byly buňky předem inkubovány s S. Typhimurium nebo EIEC (108 CFU/ml) po dobu 2 hodin a poté byly přidány laktobacily (108 CFU/ml) a dále inkubovány po dobu 2 hodin. Na konci této doby byly infikované monovrstvy důkladně promyty v PBS a poté lyžovány roztokem 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) v PBS po dobu 10 minut při pokojové teplotě. teplota k počítání internalizovaných bakterií. Alikvoty buněčných lyzátů byly sériově zředěny a naneseny na Hektoen agar (OXOID) a inkubovány při 37 °C přes noc, aby se kvantifikovaly celkem životaschopné bakterie asociované s buňkami (CFU/ml). Pro testy invazivity byly po inkubaci s bakteriemi infikované monovrstvy důkladně promyty sterilním PBS a dále inkubovány další 2 hodiny v médiu DMEM, doplněném gentamicinsulfátem (250 µg ml–1) (Sigma-Aldrich), aby se zabily extracelulární bakterie, poté byly buňky lyžovány a naneseny na plotny, jak bylo popsáno dříve, aby se kvantifikoval celkový počet internalizovaných bakterií (CFU/ml).

2.7. Statistická analýza

Významné rozdíly mezi skupinami byly vyhodnoceny pomocí dvoucestné ANOVA s použitím GraphPad Prism 8.0 a srovnání mezi průměry bylo vypočteno pomocí aStudentova t-testu. Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD) ze tří nezávislých experimentů.

Přírodní bylinná medicína pro zmírnění zácpy-Cistanche

Cistanche je rod parazitických rostlin, který patří do čeledi Orobanchaceae. Tyto rostliny jsou známé pro své léčivé vlastnosti a po staletí se používají v tradiční čínské medicíně (TCM). Druhy Cistanche se vyskytují převážně v suchých a pouštních oblastech Číny, Mongolska a dalších částí Střední Asie. Rostliny cistanche jsou charakteristické svými masitými, nažloutlými stonky a jsou vysoce ceněny pro své potenciální zdravotní přínosy. V TCM se věří, že Cistanche má tonizující vlastnosti a běžně se používá k výživě ledvin, zvýšení vitality a podpoře sexuálních funkcí. Používá se také k řešení problémů souvisejících se stárnutím, únavou a celkovou pohodou. Zatímco Cistanche má dlouhou historii používání v tradiční medicíně, vědecký výzkum jeho účinnosti a bezpečnosti stále probíhá a je omezený. Je však známo, že obsahuje různé bioaktivní sloučeniny, jako jsou fenylethanoidní glykosidy, iridoidy, lignany a polysacharidy, které mohou přispívat k jeho léčivým účinkům.

Wecistanche'scistanche prášek, cistanche tablety, cistanche kapslea další produkty jsou vyvíjeny pomocípoušťcistanchejako suroviny, z nichž všechny mají dobrý vliv na zmírnění zácpy. Specifický mechanismus je následující: Předpokládá se, že Cistanche má potenciální přínos pro zmírnění zácpy na základě jeho tradičního použití a určitých sloučenin, které obsahuje. Zatímco vědecký výzkum konkrétně o účinku Cistanche na zácpu je omezený, předpokládá se, že má více mechanismů, které mohou přispět k jeho potenciálu zmírnit zácpu. Laxativní účinek:Cistanchese již dlouho používá v tradiční čínské medicíně jako lék na zácpu. Předpokládá se, že má mírný projímavý účinek, který může pomoci podpořit pohyby střev a vyvolat zácpu. Tento účinek lze přičíst různým sloučeninám nacházejícím se v Cistanche, jako jsou fenylethanoidové glykosidy a polysacharidy. Zvlhčení střev: Na základě tradičního použití se má za to, že Cistanche má zvlhčující vlastnosti, konkrétně zaměřené na střeva. Podpora hydratace a lubrikace střev může pomoci změkčit nástroje a usnadnit průchod, a tím zmírnit zácpu. Protizánětlivý účinek: Zácpa může být někdy spojena se zánětem v trávicím traktu. Cistanche obsahuje určité sloučeniny, včetně fenylethanoidních glykosidů a lignanů, o kterých se předpokládá, že mají protizánětlivé vlastnosti. Snížením zánětu ve střevech může pomoci zlepšit pravidelnost stolice a zmírnit zácpu.