In vitro a in Silico nahlédnutí do inhibitorů tyrosinázy
Mar 28, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Abstraktní
Tyrosináza je klíčový enzym zodpovědný za biosyntézu melaninu a je účinná při ochraně před poškozením kůže způsobeným ultrafialovým zářením. V rámci pokračujícího úsilí o objevení účinných inhibitorů tyrosinázy jsme systematicky navrhli a syntetizovali třináct (E)-benzyliden-1-indanonových derivátů (BID1–13) a určili jejich inhibiční aktivity proti tyrosináze. Mezi hodnocenými sloučeninami byl BID3 nejúčinnějším inhibitorem houbové tyrosinázy (IC50=0,034 mM, mykofenolátová aktivita; IC50=1,39 mM, difenolová aktivita). Kinetické studie odhalily, že BID3 prokázal smíšený typ inhibice tyrosinázy s hodnotou Ki 2,4 mM za použití L-DOPA jako substrátu. Simulace molekulového dokování in silico prokázaly, že BID3 se může vázat na katalytická a alosterická místa tyrosinázy a inhibovat aktivitu enzymu, což potvrdilo experimentální studie in vitro mezi BID3 a tyrosinázou. Kromě toho se po léčbě BID3 snížil obsah melaninu a aktivita buněčné tyrosinázy byla inhibována. Tato pozorování odhalila, že BID3 je silný inhibitor tyrosinázy a potenciálně by mohl být použit jako bělící činidlo pro léčbu poruch souvisejících s pigmentací.
Cistanche: bělící prostředek na kůži
1. Úvod
Melanin je syntetizován melanocyty ve vazální vrstvě epidermis obecně patří do skupiny pigmentů běžně známých pro ochranu savčí kůže před poškozením způsobeným škodlivým UV zářením vychytáváním volných radikálů nebo rozptylováním přicházejícího UV záření [1]. Nadměrná tvorba melaninu však může způsobit viditelnou hyperpigmentaci epidermis, která může být zřejmá jako melasma, pihy, stařecké skvrny nebo senilní lentiginy[2].
Tyrosináza (EC 1.14.18.1), metaloenzym obsahující měď, je klíčovým enzymem zapojeným do melanogenních procesů. Tyrosináza katalyzuje dva kroky omezující rychlost v melanogenezi; hydroxylace tyrosinu (aktivita kresolázy nebo mykofenolátu) za vzniku 3,4-dihydroxyfenylalaninu (L-DOPA) a následná oxidace L-DOPA (aktivita katecholázy nebo difenolů) na odpovídající DOPA-chinon. Pokud je substrátem L-tyrosin, produktem reakce katalyzované tyrosinázou je DOPA-chinon, který se poté přemění na melanin [3]. Tyto kroky jsou klíčové pro ochranu pokožky před poškozením UV zářením. Houba Agaricus se používá pro svou komerčně dostupnou a vysokou homologii s enzymem savčí tyrosinázou, což ji činí vhodnou jako model pro studie melanogeneze [4]. U lidí melanin pomáhá chránit kůži před poškozením způsobeným UV zářením [5]. Nadměrná hladina melaninu však může způsobit různé dermatologické poruchy včetně hyperpigmentací, melasmat, pih a stařeckých skvrn [6]. Proto jsou k inhibici nadměrné pigmentace kůže vyžadovány inhibitory newtyrosinázy vykazující vlastnosti podobné léčivu a bělení kůže.
1-Indanon s benzoyl-cyklopentanonovou kostrou je považován za rigidní bratrance chalkonů, který zahrnuje nenasycený ketonový systém chalkonů tvořících cyklický 5členný kruh, což je přirozeně se vyskytující složka přítomná v různých jedlých rostlinných zdrojích [7 ]. Několik studií ukázalo, že sloučeniny obsahující 1-indanonovou skupinu mají farmakologický význam, protože vykazují různé prospěšné biologické aktivity, včetně protizánětlivých [8–10], protirakovinných [11,12], antioxidačních [13], antiparkinsonských onemocnění [14], anti-Alzheimerova choroba[15–17], antimikrobiální [18], antiimunitně supresivní [19] a antityrozinázové [20] vlastnosti.
Chalkony (1,3-diaryl-2-vlastní-1-) jsou aromatické ketony skládající se ze dvou aromatických kruhů spojených s tříuhlíkovým a,b-nenasyceným karbonylovým systémem jako centrálním jádrem [21, 22]. Jedná se o přirozeně se vyskytující složky nacházející se v různých jedlých přírodních rostlinách a považované za prekurzorové sloučeniny pro syntetickou cestu flavonoidů a isoflavonoidů, jako jsou pyrazoliny, pyrimidin, flavanol, flavony, flavanony, isoflavony, aurony, anthokyanidin, dihydroflavanol a [2-3-dihydrochalkon] Nenasycený karbonylový systém a,b je rozhodující pro typ biologické aktivity, protože tyto systémy jsou distribuovány v mnoha přírodních produktech, jako jsou chalkony a indanon, kde jsou molekuly relativně rovinnější a přenos elektronických efektů arylových substituentů je řízen. ke karbonylové skupině [7]. Mnoho dřívějších výzkumníků uvádělo, že chalkony byly zdůrazněny jako nová třída inhibitorů tyrosinázy v několika publikacích [26–29]. Nedávno Kim a spolupracovníci [30,31] navrhli a syntetizovali řadu derivátů chalkonů a hodnotili je z hlediska jejich in vitro anti- tyrosinázy a anti-melanogenní aktivity proti myším melanocytům.
Podle našich dříve publikovaných údajů vykazovaly deriváty s (E)-b-fenyl-a,b-nenasyceným karbonylovým skeletem inhibici potenctyrozinázy [32–34]. (E)-Benzyliden-1-indanony mohou být atraktivním antimelanogenním činidlem, protože sloučeniny mají ve své chemické struktuře (E)-b-fenyl-a,b-nenasycený karbonylový skelet. Zejména Radhakrishnan et al. (2015) [20]navrhli a syntetizovali řadu benzyliden-1-indanonederivátů nesoucích (Z)-konfiguraci a vyhodnotili je na antityrosinázovou aktivitu. Ačkoli tyto (Z)-benzyliden-1-indanonové deriváty byly zkoumány, anti-tyrosinázové a antimelanogenní aktivity (E)-benzyliden-1-indanonových derivátů musí být ještě prozkoumány.
Proto jsme navrhli a syntetizovali třináct sloučenin (BID1–13) 1-indanonového skeletu nesoucího (E)-formu benzylidenu. Mezi těmito syntetickými sloučeninami vykazovala 2,4-dihydroxyskupina na kruhu B 1-indanonu největší inhibici tyrosinázy (přibližně 400-krát účinnější než kyselina kojová, pozitivní kontrola). Kromě toho dále hodnotíme inhibiční aktivitu tyrosinázy BID3 a také charakterizujeme její regulační roli v syntéze melaninu pomocí buněk melanomu B16F10. V rozšířených experimentech jsme hodnotili antimelanogenní potenciál BID3 a snažili jsme se identifikovat enzymovou kinetiku a molekulární dokovací studie. V následných experimentech byl také zkoumán potenciál BID3 buněčné tyrosinázy a produkce melaninu v buňkách melanomu B16F10 indukovaných a-MSH a IBMX.
ANTIOXIDAČNÍ A VYTVÁNĚNÍ KŮŽE: EXTARKT CISTANCHE
2. Materiály a metody
2.1. Reagencie
Houbová tyrosináza (EC 1.14.18.1), hormon stimulující alfa-melanocyty (a-MSH), 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), L-tyrosin, L-3, {{ 11}} dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), dimethylsulfoxid (DMSO), kyselina kojová, kyselina ftalová a kyselina trans-skořicová byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetální bovinní sérum (FBS), streptomycin a amfotericin byly zakoupeny od WELGENE Inc. (Gyeongsan-si, Jižní Korea). Všechna ostatní činidla byla zakoupena od Sigma-Aldrich.
2.2. Chemie
2.2.1. Obecné metody
Všechna činidla byla získána komerčně a použita bez dalšího čištění. Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) a sloupcová chromatografie byly prováděny na deskách 60F245 předem potažených Merck a MP Silica 40–63, 60 Á, v daném pořadí. Data hmotnostní spektroskopie s vysokým rozlišením (HR) byla získána na Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) kapalinové chromatografii (LC) hmotnostním spektrometru (Agilent, Santa Clara, CA, USA) v ESI pozitivním módu. Spektra nukleární magnetické rezonance (NMR) byla zaznamenána na spektrometru Varian Unity INOVA 400 nebo spektrometru Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) pro 1H NMR (400 a 500 MHz) a pro 13C NMR (100 MHz), resp. . DMSO d6, CD3OD a CDC13 byly použity jako NMR rozpouštědla pro NMR vzorky. Vazební konstanta (J) a hodnoty chemického posunu byly měřeny v hertzech (Hz) a částech na milion (ppm). Zkratky používané při analýze dat 1H NMR jsou následující: s (singlet), bs (široký singlet), d (dublet), dd (dublet dubletů), t (triplet), TD (triplet dubletů), q ( kvartet), andm (více).
2.2.2. Postup syntézy BID1–13
Roztok benzaldehydu (1,1–1,2 ekv.) a 1-indanonu (100 mg, 0,76 mmol) v 1 M v kyselině octové HCl (0,4 ml) byl míchán při teplotě místnosti po dobu 4-48 hodin. Po přidání vody byly sraženiny odfiltrovány a promyty vodou a směsí hexan:ethylacetát (1:1), hexan:dichlormethan (4:1–1:1) nebo směsí dichlormethanu a methanolu, v závislosti na vlastnostech zbývajících benzaldehydů. za vzniku (E)-benzyliden-1-indanonů (BID1–13) ve výtěžcích 32,8–99,1 procenta. Strukturní charakterizace (1H a 13C NMR a hmotnostní data všech BID) syntetizovaných sloučenin je uvedena v doplňkových informacích.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID1).
Žlutá pevná látka; výtěžek 93,4 procent; reakční doba, 6 h; molekulový vzorec, C16H12O2; t.t. 224,7-225,9 °C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinylová H), 7,39 (t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8,0 Hz, 30-H, {{46} }}H), 3,99 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 160,1, 150,4, 138,3, 135,1, 134,0, 133,6, 132,2, 128,2, 127,2, 127,2, 12312,6, 126,13,6,6 H) plus vypočteno 237,0910, pozorováno 237,0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-dihydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID2).
Žlutá pevná látka; výnos, {{0}}.6 procent ; reakční doba, 5 h; molekulový vzorec, C16H12O3; t.t. 251,2 až 252,4 °C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }},2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinylová H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 7{89}}8 (d,1H , J=8,0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H, CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,8, 150,4, 148,7, 146,3, 138,3, 135,1, 134,5, 132,0, 128,2, 128,2, 127,3, 1217,1, 1217,12,127,42,1217,1 HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus vypočteno 253,0859, pozorováno 253,0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-dihydroxybenzyliden)-2,3-dihydro-1H-inden-1-on (BID3).
Žlutá pevná látka; výnos, 5{{20}}},9 procenta; reakční doba, 10 h; molekulový vzorec, C16H12O3; t.t. 198,5-199,9 °C (rozklad); 'H NMR (500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinylová H), 7,82 (d, 1H, J=8,0 Hz, 60-H), 7,67–7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7,0 Hz, 6-H), 6,45 (d 1H, J=8,5 Hz, 50-H), 6,39 (s, 1H, 30-H), 4,01 (s, 2H, CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 161,6, 160,4, 150,3, 138,6, 134,8, 131,7, 130,3, 128,7, 128,1, 3123,46, 311391, 12318,2. HRMS (ESI plus) m/z C16H13O3 (M plus H) plus vypočteno 253,0859, pozorováno 253,0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hydroxy-3-methoxybenzyliden)-2,3-dihydro-1Hinden-1-on (BID4).
Žlutá pevná látka; výnos, 52.0 procent ; reakční doba, 4 h; molekulární vzorec, C17H14O3; t.t. 186,9-187,4 °C; 1H NMR (400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7,6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7,2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinylová H), 7,24 (dd, 1H, J=8,0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8,0 Hz, 50-H), 4,05 (s, 2H, CH2 3,84 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193,9, 150,5, 149,7, 148,5, 138,3, 135,2, 134,4, 132,3, 128,2, 127,3, 12517,1, 1,5,4,3,3,127,1, 12517,1 HRMS (ESI plus) m/z C17H15O3 (M plus H) plus vypočteno 267,1016, pozorováno 267,1016.
2.3. Biologické hodnocení
2.3.1. Test inhibice houbové tyrosinázy
Test inhibiční aktivity tyrosinázy byl proveden s použitím houbové tyrosinázy, jak bylo popsáno dříve, s menší modifikací [35,36]. Stručně řečeno, 10 ml specifické koncentrace každé sloučeniny (0,0005–50 mM) a 20 ml houbové tyrosinázy (1000 jednotek/ml) v 50 mM fosfátovém pufru (pH 6,5) bylo přidáno do 170 ml reakce Poměr 1 mM roztoku L-tyrosinu nebo L-DOPA, 50 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 6,5) a destilované vody byl 10:10:9. Reakční směsi byly inkubovány při 37 °C po dobu 30 minut. Poté bylo množství dopacromu produkovaného v každé jamce měřeno spektrofotometrickou analýzou při 492 nm (OD492) za použití čtečky mikrodestiček. Míra inhibice tyrosinázy (v procentech) byla vypočtena jako (1 Absample/Abscontrol) 100 procent. Stupeň inhibice vzorku byl vyjádřen jako koncentrace požadovaná pro 50procentní inhibici (IC50).
2.3.2. Enzymová kinetická analýza s tyrosinázou
Ke stanovení kinetických mechanismů inhibice byly použity dvě komplementární kinetické metody: Lineweaver–Burk a Dixonplots [37–39]. Pomocí Lineweaver-Burkových grafů (dvojité reciproční grafy) byl určen typ inhibice BID3 pomocí různých koncentrací L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 a 1 mM), jako substráty, v nepřítomnosti a přítomnosti různých koncentrací BID3 (1, 2 a 4 uM). Dixonův graf (jediné reciproční grafy) inhibice fortyrosinázy byl získán v přítomnosti různých koncentrací L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5 a 1 mM ). Koncentrace BID3 byly 1, 2 a 4 mM. Enzymatické postupy se skládaly z dříve popsaných metod stanovení tyrosinázy. Inhibiční konstanta (Ki) byla stanovena z interpretace Dixonových grafů.
2.3.3. Simulace molekulárního dokování tyrosinázy
K určení struktury komplexu enzym-inhibitor a zajištění přesnosti, opakovatelnosti a spolehlivosti výsledků dokování jsme použili software AutoDock4.2. Pro studie dikingu byly krystalové struktury cílového proteinu houbové tyrosinázy získány ze zarovnání proteinové sekvence (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40]. Byly provedeny automatické simulace dokování mezi tyrosinázou a kyselinou kojovou, kyselinou ftalovou, kyselinou skořicovou nebo BID3. Pro postup dokování: převedení 2D na 3D struktury, vypočtené náboje a přidané atomy vodíku pomocí programu ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 LigandScout 4.1.5 byl použit pro predikci možných interakcí mezi ligandy a tyrosinázou a identifikaci farmakoforů.
2.3.4. Buněčná kultura a test buněčné životaschopnosti
Buňky myšího melanomu B16F10 byly zakoupeny od Korean Cell Line Bank (KCLB, Soul, Korea) a kultivovány v DMEM doplněném 10 procenty FBS a 1 procentem streptomycinu a poté inkubovány při 37 °C, zvlhčené 5 procenty atmosférického CO2. Analýzy životaschopnosti buněk byly provedeny, jak bylo popsáno dříve [42]. Stručně, buňky se naočkovaly v hustotě 1 104 buněk/jamku na 96-jamkovou destičku po dobu 24 hodin. Následující den byly buňky vystaveny různým koncentracím BID3 a inkubovány po dobu 24 nebo 48 hodin, v daném pořadí. Poté bylo do každé jamky přidáno 10 ml roztoku EZ-Cytox a buňky byly inkubovány po dobu 2–4 hodin. Absorbance byla stanovena pomocí ELISA při vlnové délce 450 nm. Každý test byl proveden trojmo.
2.3.5. Test obsahu melaninu
Obsah melaninu byl stanoven tak, jak bylo popsáno dříve [43]. Buňky melanomu B16F10 (2 105 buněk/jamka) byly nasazeny na 6-jamkové kultivační destičky. Pro stanovení inhibičního účinku BID3 na melanogenezi bylo čerstvé médium nahrazeno médiem obsahujícím BID3 (1, 5 a 10 lM) nebo kyselinu kojovou (10 mM) jako pozitivní kontrolu po dobu 1 hodiny a poté stimulováno a-MSH (5 lM ) a IBMX (200 mM) po dobu 48 hodin. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky odděleny inkubací v trypsinu/EDTA a pelety byly rozpuštěny ve 100 ml 1N NaOH a poté inkubovány při 60 °C po dobu 1 ručního míchání, aby došlo k solubilizaci melaninu. Obsah melaninu byl stanoven měřením absorbance při 405 nm pomocí čtečky ELISA (TECAN, Sunrise, Rakousko). Obsah melaninu byl vypočítán pomocí následující rovnice: (vzorek/kontrola) - 100 procent. Všechna stanovení byla provedena trojmo.
2.3.6. Aktivita buněčné tyrosinázy
Aktivita buněčné tyrosinázy byla hodnocena, jak bylo popsáno dříve, s mírnými modifikacemi [44,45]. Stručně řečeno, 2 105/buňky byly umístěny do 6-jamkových misek a inkubovány přes noc. Buňky byly vystaveny různým koncentracím BID3 (1, 5 a 10 mM) kyseliny orkojové (10 mM) po dobu 1 hodiny a následně stimulovány pomocí a-MSH (5 mM) a IBMX (200 mM) po dobu 48 hodin. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky lyžovány 100 ml lyzačního roztoku obsahujícího 50 mM fosfátového pufru (pH 6,5), 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF) a 1 procenta Tritonu X-100 a zmraženy při 80 °C po dobu 30 minut. Lyzáty byly rozmraženy a centrifugovány při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut při teplotě 4 C. Poté byl supernatant (80 ml) smíchán s 2 mg/ml L-DOPA (20 ml) v 96-jamkové destičce . Po inkubaci při 37 °C po dobu 30 minut byla měřena optická hustota při 492 nm pomocí čtečky ELISA (TECAN, Salzburg, Rakousko). Koncentrace proteinu byla stanovena za použití činidla pro analýzu proteinů BCA za použití BCA jako standardu (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Přínos extraktu z cistanche: inhibuje tyrosinázu.
2.3.7. Statistická analýza
Všechna data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Data byla analyzována jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA), aby se určily rozdíly mezi ošetřeními, s následným Bonferroniho posthoc testem. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">
3. Výsledky a diskuse
3.1. Chemie
(E)-benzyliden-1-indanonové deriváty (BID1–13) byly syntetizovány podle obecného schématu 1. V této studii bylo syntetizováno třináct (E)-2-benzyliden-1-indanonových derivátů a jejich byly zkoumány inhibiční vlastnosti tyrosinázy. Cílové (E)-2-benzyliden-1-indanonové deriváty byly syntetizovány za kyselých podmínek (1 M HCl v kyselině octové). Tyto reakce vytvořily cílový (E)-2-benzyliden-1- deriváty indanonu ve výtěžcích 32,8–99,1 procenta. Zdá se, že pouze E-izomery 2-benzyliden-1-indanonů byly vytvořeny díky A-kmenu známému jako 1,{21}}allylový kmen. A-kmen (sterichindance) mezi fenylovým kruhem a karbonylovou skupinou v Z-izomeru je zjevně větší než mezi fenylovým kruhem a methylenovou skupinou v E-izomeru. Struktury syntetických sloučenin byly ověřeny 1H a 13C NMR a hmotnostní spektrometrií, jak je popsáno v experimentální části (obr. S1–S38). Zejména chemický posun olefinického protonu je odstíněn v E-izomeru 2- benzyliden kvůli anizotropnímu účinku karbonylové skupiny a ve srovnání s izomerem Z (nad 7 ppm)<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Schéma 1. Syntéza (E)-2-benzyliden-1-indanonů.
3.2. Tyrosinázové inhibiční vlastnosti sloučenin
Inhibiční potenciál tyrosinázy derivátů (E)-benzyliden-1-indanonů byl zkoumán pomocí houbové tyrosinázy. Jako substráty pro tyto experimenty byly použity mykofenolát (L-tyrosin) a difenoly (L-DOPA) [35]. Enzymové reakce byly provedeny s tyrosinázou, substrátem a testovanými inhibitory. Všechny testované sloučeniny vykazovaly inhibici závislou na koncentraci. Hodnoty IC50 (E)-benzyliden-1-indanonových derivátů jsou uvedeny v tabulce 1.
V substrátech L-tyrosinu i L-DOPA vykazoval BID3 silnou inhibiční aktivitu s hodnotami IC50 0.{{10}}34 ± 0.{{{{101} 27}}224 mM a 1,39 ± 0.00004 mM, v tomto pořadí, ve srovnání s pozitivní kontrolou kyselinou kojovou, která měla hodnoty IC50 13,77 ± 0,20 mM, respektive 33,14 ± 0,93 mM (Obr. 1A). Kromě toho BID6 vykazoval silnou aktivitu vůči L-tyrosinu a L-DOPA s hodnotami IC50 5,00 ± 0,91 mM a 53,11 ± 2,79 mM, v daném pořadí. BID1 vykazoval významnou inhibici proti tyrosináze prostřednictvím L-tyrosinových a L-DOPA drah, s hodnotami IC50 39,74 ± 3,71 mM a 130,0 ± 5,39 mM, v daném pořadí. BID4 a BID11 vykazovaly mírnou inhibiční aktivitu tyrosinázy. Ostatní deriváty byly neaktivní. Podobně BID2 vykazoval významnou aktivitu vůči L-tyrosinu a L-DOPA s hodnotami IC50 41,27 ± 3,03 mM a 52,93 ± 2,62 mM. Kromě toho hlášené inhibitory smíšeného typu, kyselina ftalová a kyselina skořicová, nevykazovaly žádné inhibiční účinky. účinek při koncentraci 200 mm [47].
V souladu s výsledky studií vztahu mezi strukturou a aktivitou (SAR) deriváty obsahující (E)-benzyliden-1-indanonové substituenty na fenylovém kruhu výrazně ovlivnily inhibici potenciální tyrosinázy. BID3, který inhiboval tyrosinázu s nejvyšší účinností, nese 2-hydroxyskupinu v přítomnosti 4-hydroxyskupiny a značně inhibuje aktivitu tyrosinázy (BID1 vsBID3). Tyto výsledky naznačují, že 2,4-dihydroxy skupina (resorcinolová část) ve struktuře fenylového kruhu může být zodpovědná za zvýšenou inhibici tyrosinázy. Je zajímavé, že v předchozí studii o potenciálních syntetických inhibitorech tyrosinázy jsme ukázali, že 2,4-dihydroxy substituce silně inhibovala aktivitu tyrosinázy [48,49]. Kromě toho naše údaje o SAR také ukázaly, že zavedení 3-hydroxyskupiny v přítomnosti 4-hydroxyskupiny ovlivňuje inhibici tyrosinázy. Tyto jevy byly demonstrovány zjištěním, že 4-methoxy-3-hydroxyfenylový kruh zvýšil inhibiční aktivitu proti tyrosináze, zatímco zavedení 3,{19}}dihydroxyskupiny (katecholová část) inhibiční aktivitu tyrosinázy snížil ( BID2 vs BID6) [35]. Tyto výsledky naznačují, že 3-hydroxy-4-methoxy skupina je také zodpovědná za inhibiční aktivitu fortyrosinázy. Nicméně v naší současné studii BID9 a BID11, které obsahují 2,4-dimethoxyfenylové nebo 3,{30}}dimethoxyfenylové skupiny, vykazovaly mírnou inhibiční aktivitu vůči tyrosináze. Na základě hodnot IC50 prostřednictvím dráhy L-tyrosinu a L-DOPA vykazoval BID3 nejsilnější inhibiční aktivitu tyrosinázy, proto jsme dále studovali mechanismus, který je základem tohoto inhibičního účinku. Radhakrishnan a kol. (2015) [20] uvedli, že hydroxylovou skupinou substituované (Z)-benzyliden-1-indanonové sloučeniny jsou účinnými inhibitory tyrosinázy. Ačkoli předchozí studie ukázaly, že hydroxyl-substituovaný (Z)-benzyliden-1-indanonový derivát má antityrosinázovou aktivitu, podle našich nejlepších znalostí nebyly hlášeny žádné zprávy o inhibici tyrosinázy (E)-benzylidenem-1- deriváty indanonu za použití experimentů na bázi buněk.
Tabulka 1. Inhibiční potenciál houbové tyrosinázy substituovaného 2,3-dihydro-1H-inden-1-onu (1-indanonu) podobného chalkonu
deriváty (BID1–13).
Obr. 1. Na koncentraci závislá inhibice aktivity houbové tyrosinázy pomocí BID3 a kyseliny kojové (pozitivní kontrola) (n=3).
3.3. Enzymová kinetická analýza inhibice tyrosinázy
Protože BID3 byl nejúčinnějším inhibitorem, dále jsme studovali mechanismus, který je základem jeho inhibičního účinku. Ve snaze vysvětlit způsob inhibice enzymu byly provedeny kinetické analýzy při různých koncentracích L-DOPA a různých koncentracích BID3. Dixonovy a Lineweaver-Burkovy grafy byly nakresleny pomocí dat získaných z kinetických studií za účelem potvrzení inhibičního profilu a inhibiční konstanty (Ki) byly stanoveny interpretací Dixonových grafů (obr. 2A a B). Koncentrace L-DOPA je označena následovně: 1, 2, 4 mM. Průsečík leží na levé straně, což ukazuje na inhibici smíšeného typu proti tyrosináze s hodnotou Ki 2,4 mM (obr. 2B). Hodnota Ki představuje koncentrace potřebné k vytvoření komplexu enzym-inhibitor, takže inhibitor s nižší hodnotou Ki indikuje větší aktivitu inhibice tyrosinázy.
Molekulární dokování přispělo během mnoha let k důležitým poznatkům o objevování léků. Nicméně dokovací postupy mají za cíl identifikovat správné polohy ligandů ve vazebné kapse aproteinu a předpovědět afinitu mezi ligandem a proteinem. Jinými slovy, dokování popisuje proces, při kterém dvě molekuly do sebe zapadají v trojrozměrném prostoru. Aby se určilo, zda se BID3 váže na aktivní místo tyrosinázy, byla provedena molekulární dokovací analýza k identifikaci možných vazebných poloh BID3 v krystalové struktuře houbové tyrosinázy (PDB ID: 2Y9X) (obr. 3A). Tyto výsledky byly vypočteny pomocí AutoDock4.2. program. Nejstabilnější vazebná poloha byla ta s nejnižším skóre [50]. Nedávno Hassani a spol. [47] uvedli, že kyselina skořicová a kyselina ftalová jsou inhibitory tyrosinázy se smíšeným režimem. K ověření výsledků dokování byly tedy použity pomocná látka, kyselina skořicová a kyselina ftalová [51]. Modely molekulového dokování BID3 a kyseliny kojové (dobře známý inhibitor konkurenčního typu) v katalytickém místě tyrosinázy jsou znázorněny na obr. 3B [52 ]. Komplex inhibitoru tyrosinázy-BID3 vykazoval vazebnou energii 6,28 kcal/mol včetně dvouvodíkových vazeb se zbytkem tyrosinázy ASN260 a MET280 a byly pozorovány hydrofobní interakce mezi BID3 a zbytky tyrosinázy VAL248, PHE264 a VAL283, což dále stabilizovalo katalytické místo pro katalytické interakce. hubtyrosináza (tabulka 2 a obr. 3E a H). Kromě toho jsou modely molekulárního dokování BID3, kyseliny ftalové (alosterický inhibitor 1) a kyseliny skořicové (alosterický inhibitor 2) ve dvou alosterických místech znázorněny na obr. 3C a 3D. Kyselina ftalová a kyselina skořicová byly brány jako referenční ligandy na alosterických místech 1 a 2 [47,51]. Jak je znázorněno na obr. 3F a I, BID3 a kyselina ftalová vykazovaly jednu vodíkovou vazbu se zbytkem TRY140 tyrosinázy a tři zbytky hydrofobních interakcí s LEU24, PHE147 a ILE148 tyrosinázy na alosterickém místě 1. Odpovídající interakce ligandu BID3 a kyseliny skořicové v alosterickém místě2 tyrosinázy zahrnoval vodíkové vazby mezi ASP312 a LYS376 tyrosinázy, zatímco THR308 interagoval hydrofobně na alosterickém místě 2 (obr. 3G a J). Dále bylo zjištěno, že vazba BID3-tyrosinázy vyvíjí vazebnou energii v obou alosterických místech tyrosinázy (4,38 a 5,68 kcal/mol, v daném pořadí), což ukazuje na vysokou vazebnou afinitu s oběma alosterickými místy. Na základě enzymokinetických studií vykazoval BID3 inhibici smíšeného typu, vazebná schopnost BID3 s katalytickým místem a dvěma alosterickými místy potvrdila jeho smíšený typ inhibice tyrosinázy.
Obr. 2. Lineweaver-Burk (A) a Dixonův graf (B) pro inhibici houbové tyrosinázy pomocí BID3 s použitím L-DOPA jako substrátu.
3.4. Biologická aktivita
Abychom využili anti-tyrosinázové účinky BID3 v modelu buněčné kultury, zkoumali jsme jeho cytotoxické účinky na buňky B16F10. Buňky byly ošetřeny různými koncentracemi BID3 (1–20 mM) po dobu 48 hodin a hodnoceny pomocí testu EZ-Cytox. Výsledky ukázaly, že BID3 neměl žádný významný cytotoxický účinek na melanomové buňky B16F10 až do 20 mM (obr. 4A a B). Proto byly provedeny následné experimenty s použitím BID3 až do 20 mM.
Tabulka 2 Vazebná místa a skóre dokování BID3 v houbové tyrosináze (PDB ID: 2Y9X), jak bylo stanoveno pomocí programu AutoDock4.2.
Melanogeneze je regulována enzymatickou kaskádou tyrosinázy. Z tohoto důvodu bylo vyvinuto několik sloučenin pro bělení kůže, které snižují aktivitu tyrosinázy. Jako pozitivní kontrola byla použita kyselina kojová, inhibitor tyrozinázy [53]. Aby se tedy prozkoumaly účinky BID3 na hyperpigmentaci vyvolanou zvýšením cAMP, buňky B16F10 byly ošetřeny a-MSH a IBMX v přítomnosti BID3 (1, 5 a 2{{20}} mM) po dobu 48 hodin a byly stanoveny obsahy melaninu a aktivity celulární tyrosinázy (obr. 4C a D). Léčba pomocí a-MSH a IBMX vyvolala významné zvýšení (P < 0,001#)="" obsahu="" melaninu="" (obr.="" 4c)="" a="" aktivity="" buněčné="" tyrosinázy="" (obr.="" 4d)="" v="" buňkách="" b16f10="" ve="" srovnání="" s="" neošetřenou="" kontrolou.="" léčba="" bid3="" však="" významně="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" a="" v="" závislosti="" na="" koncentraci="" snížily="" obsah="" melaninu="" a="" aktivitu="" buněčné="" tyrosinázy="" buněk="" b16f10="" ve="" srovnání="" s="" buňkami="" ošetřenými="" a-msh="" neboibmx,="" což="" naznačuje,="" že="" snížení="" buněčného="" melaninu="" může="" být="" způsobeno="" inhibicí="" aktivity="" tyrosinázy="" .="" tato="" zjištění="" tedy="" jasně="" ukazují,="" že="" bid3="" projevoval="" antimelanogenní="" účinky="" inhibující="" aktivitu="" tyrosinázy="" a="" syntézu="" melaninu="" v="" buňkách="" b16f10,="" aniž="" by="" indukoval="">
Indanon je jednou z privilegovaných struktur lékařské chemie a je obecně spojován s řadou farmakologicky aktivních sloučenin [54]. Indanonová skupina je přítomna v řadě fyziologicky aktivních přírodních produktů. S ohledem na to Okpekonet al., [55] uvedl, že nová 1-indanonová sloučenina je izolována z kořenů Uvaria. Tato sloučenina je prvním 1-derivátem indanonu izolovaným z rostlin. Nagle et al. [56] uvedli, že z marinecyanobacterium byl izolován nový methylovaný indan-aldehyd jako regulátor angiogeneze nádoru. Podobně, od biologického významu indanonového jádra, se v posledních několika letech výzkumníci zaměřili na vývoj farmakologicky aktivních indanonových analogů jako terapeutických činidel. Strukturální rozmanitost 1-indanonů implikuje různé biologické odezvy a tyto sloučeniny mohou být použity v zemědělství a medicíně. Byly vyvinuty různé sloučeniny na bázi indanonu jako anti-Alzheimerova nemoc [16,57–59], protirakovinná [60– 62], antimikrobiální [63,64] a antivirová činidla [65,66]. Vzhledem k širokému aplikačnímu potenciálu byly 1-indanony zajímavými objekty pro další výzkum a je žádoucí navrhnout nové třídy pro jejich syntézu.
cistanche tubolosa: proti stárnutí
4. Závěr
K identifikaci nových účinných inhibitorů tyrosinázy jsme navrhli a syntetizovali třináct (E)-benzyliden-1-indanonových derivátů. Mezi tyto sloučeniny patří (E)-2-(2,4-dihydroxy-benzyliden){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-on (BID3) silně inhiboval aktivitu tyrosinázy (IC50=0,034 a 1,39 mM, pro L-tyrosin a L-DOPA, v daném pořadí), která byla lepší než referenční sloučenina, kyselina kojová (IC50=13,77 mM a 33,14 mM, v daném pořadí). Vztah mezi strukturou a aktivitou odhalil, že přítomnost dihydroxylové skupiny v poloze 2 a 4-(E)-benzyliden-1-indanonového skeletu zlepšila aktivitu proti tyrosináze. Způsob enzymatické inhibice enzymu, stanovený pomocí grafů Lineweaver-Burk a Dixon, ukázal, že BID3 je inhibitor smíšeného typu. Molekulární dokovací studie ukazují, že vazba na aktivní místo a na alosterická místa jsou důležitými mechanismy směrem k inhibiční aktivitě tyrosinázy. Na základě těchto výsledků se zdá, že BID3 je silným inhibitorem tyrosinázy pro léčbu kožních poruch, jako je hyperpigmentace.
Výhody pouštní cistanche: inhibuje tvorbu melaninu