Vliv gestačního nízkoproteinového příjmu na expresi mikroRNA v embryonálních ledvinách a na progenitorové buňky nefronu mužského plodu
Mar 08, 2022
Úvod
Nedostatek živin může mít za následek signalizační změny v klíčových drahách v různých fázích vývoje plodu, což může způsobit nevratné orgánové a systémové poruchy v dospělosti [1]. Fetální programování se týká jakékoli urážky během vývoje, která způsobuje dlouhodobé účinky na strukturu nebo funkci organismu [2]. Narušení programování plodu má za následek nízkou porodní hmotnost, méně nefronů a zvýšené riziko kardiovaskulárních a kardiovaskulárních onemocněníledvinovéporuchy v dospělosti [3–6]. Studie jiných autorů a nás prokázaly nižší porodní hmotnost, snížení nefronů o 28 procentledvinovévylučování soli, chronickéselhání ledvina arteriální hypertenze v gestačním nízkoproteinovém (LP) příjmu ve srovnání se standardním (NP) příjmem bílkovin u potomků v dospělosti [3–7]. Nefrogeneze zahrnuje přísnou kontrolu genové exprese, syntézu proteinů a remodelaci tkání. Studie prokázaly, že počet nefronů je určen interakcí mezi pupenem močovodu (UB) a progenitorovými buňkami mezenchymu metanefros (MM) [8–10]. Signály z MM indukují UB-stimulovaný růst a větvení systému tubulů. Proliferace a diferenciace MM, tvořící mezenchymální čepici (CM), je zase zprostředkována UB konci [11].
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
Existuje vážný zájem o roli epigenetických změn týkajících se dlouhodobých účinků prenatálního stresu na vývoj plodu [12]. MikroRNA (miRNA) jsou genomem kódované malé nekódující RNA o délce přibližně 22 nukleotidů a hrají zásadní roli v posttranskripční regulaci exprese cílových genů [13–16]. miRNA řídí genovou expresi post-transkripčně regulací translace mRNA nebo stability v cytoplazmě [17, 18]. Funkční studie ukazují, že miRNA se účastní kritických biologických procesů během vývoje a buněčné fyziologie [13, 16]. Změny v jejich expresi byly pozorovány u několika patologií [16, 19]. Charakterizace miRNA tedy pomohla pochopit genovou regulaci a buněčnou proliferaci, diferenciaci a apoptózu a vysvětlit patofyziologické poruchy, včetněledvinaporuchy [20–22]. Studie uvádějí, že běhemledvinaontogenetické miRNA jsou pro vývoj nefronu nepostradatelné [23–26]. Navíc nedostatečná exprese některých miR NA v MM progenitorových buňkách snižuje buněčnou proliferaci, což vede k časné diferenciaci a následně ke snížení počtu nefronů [27, 28]. Tento jev je charakterizován zvýšenou apoptózou a vysokou expresí Bim v progenitorových buňkách [27]. MiRNA tedy modulují rovnováhu mezi apoptózou a proliferací těchto metanefrických primárních buněk [29].
Předpokládali jsme, že jsou spojeny neznámé epigenetické změny a profilování exprese miRNAledvinavývojové poruchy u mateřských potomků s omezeným proteinem. Zaměřili jsme se tedy na vyhodnocení vzorců miRNA a predikované genové exprese u ploduledvinav 17 dnech gestačního (17-DG) samčího potomka s omezeným přístupem k proteinu, aby se identifikovaly molekulární dráhy a poruchy zahrnuté vledvinovébuněčná proliferace a diferenciace běhemledvinarozvoj.
klíčová slova:selhání ledvin; renální tubulární; poruchy ledvin; vývoj ledvin; ledvina
Materiál a metodika
Zvířata a dietyExperimenty byly provedeny tak, jak bylo podrobně popsáno dříve [5, 6] na věkově stejných krysích samicích a samcích sourozeneckých krys Wistar HanUnib (250–300 g) pocházejících z chovu dodaného CEMIB/UNICAMP , Campinas, SP, Brazílie. Prostředí a bydlení poskytlo správné podmínky pro řízení jejich zdraví a pohody během experimentálního postupu. Ihned po odstavení ve věku tří týdnů byla zvířata udržována v kontrolované teplotě (25˚C) a světelných podmínkách (07:{11}}–19:00 h) s volným přístupem k vodě z vodovodu a standardnímu laboratornímu krmivu pro hlodavce (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Brazílie: Obsah Na plus: 135 ± 3μEq/g; Obsah K plus: 293 ± 5μEq/g), po dobu 12 týdnů před chovem. Institucionální etická komise pro používání zvířat na Státní univerzitě v São Paulu (#446-CEUA/UNESP) schválila experimentální protokol a během vyšetřování byly dodržovány obecné pokyny stanovené Brazilskou vysokou školou pro experimentování na zvířatech. Byl označen jako den 1 těhotenství jako den, kdy vaginální nátěr obsahoval spermie. Poté byly matky ad libitum po celou dobu březosti udržovány na izokalorickém laboratorním krmivu pro hlodavce buď se standardním obsahem bílkovin [NP, n=36] (17 procent bílkovin), nebo s nízkým obsahem bílkovin [LP, n=51 ] (6 procent bílkovin). Spotřeba NP a LP mateřské potravy byla stanovena denně (následně normalizována na tělesnou hmotnost) a tělesná hmotnost samic byla zaznamenávána týdně v obou skupinách. V 17 dnech březosti (17-DG) byly matky anestetizovány ketaminem (75 mg/kg) a xylazinem (10 mg/kg) a děloha byla obnažena. Plody byly odstraněny a okamžitě usmrceny dekapitací. Plody byly zváženy a byly odebrány ocas a končetiny pro určení pohlaví. Metanefros byl shromážděn pro sekvenování nové generace (NGS), RT-qPCR a imunohistochemické analýzy.
CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL
Určení pohlavíTato studie byla provedena pouze u samčích 17-DG potomků a určení pohlaví bylo stanoveno konvenční sekvenční analýzou PCR (polymerázová řetězová reakce) Sry. DNA byla extrahována enzymatickou lýzou proteinázou K a fenol-chloroformem. Pro reakci byl použit Master Mix Colorless—Promega s podmínkami cyklování výrobce. Společnost Integrated DNA Technologies (IDT) syntetizovala primer následující sekvence: Vpřed: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Zpět: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Celková extrakce RNARNA byla extrahována z NP (n=4) a LP (n=4) celáledvinypomocí činidla Trizol (Invitrogen), podle pokynů výrobce. Celkové množství RNA bylo stanoveno absorbancí při 260 nm pomocí spektrofotometru nanoVue (GE Healthcare, USA). Integrita RNA byla zajištěna získáním čísla integrity RNA — RIN > 8 pomocí bioanalyzátoru Agilent 2100 (Agilent Technologies, Německo) [30].
miRNA-Seq a analýza datSekvenování bylo provedeno na platformě MiSeq (Illumina). Protokol se řídil pokyny výrobce dostupnými vStručně řečeno, sekvenování zahrnuje konstrukci knihovny, a to byl použit 1 ug celkové RNA. V tomto kroku jsou připojeny adaptéry, 3 'a 5'. Po ligaci adaptérů byla provedena reverzní transkripční reakce za účelem vytvoření cDNA. Poté byla amplifikována standardní PCR reakcí, která používá primery obsahující sekvenční index pro identifikaci vzorku – tato knihovna cDNA, podrobená elektroforéze na agarózovém gelu pro izolaci miRNA. Po kvantifikaci byla koncentrace knihovny normalizována na 2 nM pomocí 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, a sekvenování transkriptomu bylo provedeno pomocí MiSeq Reagent Kit v2 (50 cyklů).
Analýza dat byla provedena ve spolupráci s Tao Chenem, Ph.D. z Division of Genetic and Molecular Toxicological, National Center for Toxicological Research, Jefferson, AR, USA. Data z Next Generation Sequencing (NGS) miRNA byla generována ve formátu FASTA a importována do BaseSpace.com (Illumina, USA). Kvalita dat byla hodnocena pomocí základního volacího softwaru CASAVA vyvinutého výrobcem (Illumina). Analýzy byly provedeny pomocí BaseSpace miRNA Analysis (z University of Torino, Kanada) a sekvenční mapování různých miRNA pomocí Small RNA (Illumina, USA) pro potkaní genom. Diferenciálně exprimovaná miRNA studie byla analyzována pomocí softwaru Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, USA).
validace exprese miRNAV každé skupině byli pro miRNA použiti čtyři samčí potomci z různých vrhů (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p a -199a-5p) analýzu výrazů. Stručně, 450 ng RNA bylo reverzně transkribováno, bez preamplifikace, pomocí TaqMan1 Micro RNA Reverse Transscription Kit, podle pokynů výrobce. Komplementární DNA (cDNA) byla amplifikována pomocí TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, USA) s TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) na StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM), podle pokynů výrobce. Analýza dat byla provedena pomocí relativní genové exprese hodnocené pomocí srovnávací kvantifikační metody (Pfaffl, 2001). Na základě analýzy stability byly jako referenční gen použity U6 snRNA a U87 scaRNA. Všechny relativní kvantifikace byly vyhodnoceny pomocí softwaru DataAssist, v 3.0, s použitím metody ΔACT. Údaje o miRNA byly vytvořeny podle pokynů MIQE [31].
CISTANCHE ZLEPŠÍ FUNKCI LEDVIN/RENÁL
RT-qPCR predikovaných cílových genůPro syntézu cDNA byl použit vysokokapacitní cDNA reverzní transkripční kit (Life Technologies, USA). Reakce RT-qPCR pro Bax, Bim, kaspázu-3, kolagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, cyklin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 a IGF1 gen provedl SYBR Green Master Mix (Life Technologies, USA ) poskytnutý společností IDT1 Integrated DNA Technologies (tabulka 1). Reakce byly provedeny v celkovém objemu 20 μl za použití 2 μl cDNA (zředěné 1:30), 10 μl SYBER Green Master Mix (Life Technologies, USA) a 4 μl každého specifického primeru (5 nM). Amplifikace a detekce byly provedeny pomocí systému StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM). Hodnoty Ct byly převedeny na hodnoty relativní exprese pomocí metody ΔACt s údaji o potomcích metanephros normalizovaných s GAPDH jako referenčním genem [32].
imunohistochemie,Plod (n {{0}} na skupinu) byl odebrán a okamžitě fixován ve 4% paraformaldehydu (0,1 M fosfát, pH 7,4). Materiály byly dehydratovány, diafanizovány a zahrnuty do paraplastu a bloky byly nařezány na řezy o tloušťce 5-μm. Histologické řezy byly deparafinizovány a zpracovány pro imunofluorescenci a imunoperoxidázu. Sekce byly
inkubovány s blokovacím roztokem (8 procent fetálního bovinního séra, 2,5 procenta hovězího albuminu a 2 procenta sušeného odstředěného mléka v PBS). Následně nastavte primární protilátku (anti-Six{5}}) zředěnou v PBS obsahujícím 1 procento odstředěného mléka přes noc v chladničce. Po promytí PBS byly řezy inkubovány se specifickou sekundární protilátkou, konjugovanou s fluoroforem Alexa 488, zředěným ve stejném pufru, obsahujícím 1 procento mléka, po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Po následných promytích PBS byla sklíčka připevněna krycími sklíčky s použitím fluorescenčního montážního média Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Fluorescence ve vzorku byla detekována laserovou konfokální mikroskopií. Snímky byly získány pomocí systému Focus Imagecorder Plus. Pro proteiny c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF-1, - catenin, ZEB1, ZEB2, štěpené kaspázou 3, cyklin A a WT1 byla provedena imunohistochemie. Sklíčka byla hydratována a po promytí v PBS pH 7,2 po dobu 5 minut bylo provedeno získání antigenu pomocí citrátového pufru pH 6.0 po dobu 25 minut v tlakovém hrnci. Sklíčka byla promyta v PBS. Následně byla provedena blokáda endogenní peroxidázy peroxidem vodíku a methanolem po dobu 10 minut ve tmě. Řezy byly znovu promyty v PBS. Poté následovalo blokování nespecifické vazby a sklíčka byla inkubována s blokovacím roztokem (5 procent sušeného odstředěného mléka, v PBS) po dobu 1 hodiny. Řezy byly inkubovány s primární protilátkou (tabulka 2), zředěnou v 1% BSA přes noc v lednici. Po promytí PBS byly řezy vystaveny specifické sekundární protilátce po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Sklíčka byla promyta PBS. Řezy byly odhaleny pomocí DAB (3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochlorid, Sigma-Aldrich CO1, USA). Po následném promytí v tekoucí vodě byla sklíčka kontrastně obarvena hematoxylinem, dehydratována a připevněna krycím sklíčkem pomocí Entellan1. Snímky byly získány pomocí fotomikroskopu (Olympus BX51) nebo konfokálního zařízení Zeiss LSM 780-NLO na mikroskopu Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Německo) z National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biologie (INFABIC) na State University of Campinas.
Morfologická kvantifikaceParafín 5 μmledvinařezy byly analyzovány pomocí softwaru CellSens Dimension z fotomikroskopu (Olympus BX51). Theledvinařezy byly zpřístupněny k určení nefrogenní oblasti, CM a UB proteinu a počtu buněk, hematoxylin-eozin obarvený u 17-DG LP plodu (n=5) ve srovnání s věkově odpovídajícími NP potomky (n {{4 }}) od různých matek. Kvantifikovali jsme všechny CM a UB každého analyzovaného metanefros (4NP a 4LP od různých matek) a statistická analýza byla provedena pomocí t-testu a hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Hodnota p�0.05 byla považována za významnou. Pro statistickou analýzu a konstrukci obrázku byl použit GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA.
Statistická analýzaByl použit t-test a hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). P�0.05 bylo považováno za významné. Pro statistickou analýzu a konstrukci obrázku byl použit software GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., USA).
Výsledek
Exprese miRNA pomocí miRNA-SeqPochopit změny mikroRNA spojené s mateřským nízkým obsahem bílkovinledvinovéprogramování jsme provedli expresi globální analýzy profilování miRNA. Bylo identifikováno 44 deregulovaných miRNA (p � 0.05), z nichž 19 a 25 miRNA bylo up-nebo down-regulovaných (tabulka 3). Nejvyšší exprimované miRNA a jejich funkce, dráhy a sítě byly identifikovány pomocí Ingenuity Software (tabulka 4).
Validace exprese miRNAVe zvířatech skupiny LP byly zvýšeny regulace Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p, zatímco miR-127-3p, miR-144-3p a miR-199a-5p byly oproti NP zvířatům sníženy. Výsledky neukazují žádný rozdíl v expresi miR{10}} při porovnání obou skupin (obr. 1). Tabulka 5 odhalila hodnoty získané sekvenováním miRNA s validačními daty RT-qPCR. Ačkoli byl pozorován významný rozdíl v expresi miRNA v LP vzhledem k NP potomkům, násobná změna (FC) validovaných miRNA byla podobná oběma technikám.
miRNA-genové cíle
Expresní geny předpokládaných cílů různých miRNA, jako je Six{0}}, Bcl{1}}, PRDM1, cyklin A, PCNA, GDNF, kolagen 1, kaspáza 3 a Bim v LP se významně nelišily od NP plod. Exprese genů Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 a IGF1 však byly upregulovány v {{15 }}Skupina DG LP ve srovnání s kontrolami odpovídajícího věku. Naopak, c-Myc a NOTHC1 byly downregulovány u mateřských potomků s omezeným proteinem (obr. 2).
Tělesná hmota plodu a morfometrie metanefrosTělesná hmotnost 17-DG LP se nelišila od věkově odpovídajícího potomstva NP. Mezenchym LP metanephros však vykázal o 7,6 procenta zmenšenou plochu a 29 procent zmenšení tloušťky kůry než skupina NP (obr. 3).ImunohistochemieV této studii plod LP vykazoval signifikantní snížení (asi 69 procent) fluorescence Six-2 cap než NP potomstvo (obr. 4).
Imunoperoxidázová analýza Six{0}} prokázala snížený počet buněk (14 procent) v LP CM v porovnání s 28 procenty redukovanými buňkami Six-2 plus vzhledem k oblasti čepice ve srovnání s NP potomky (obr. 4). Tato studie také ukázala významné procento snížení c-Myc CM a UB imunoznačených buněk (méně 14 procent) v LP ve srovnání s NP potomky (obr. 4). Kromě toho procento oblasti označené Ki-67 v CM bylo o 48 procent menší u LP ve srovnání s plodem NP, zatímco imunoreaktivita Bcl-2 a štěpená kaspáza-3 se u obou skupin nelišila (obr. 5 a 6). Tato studie také ukázala významné procento snížení c-Myc CM a UB imunoznačených buněk (méně 14 procent) v LP ve srovnání s NP potomky (obr. 4). Kromě toho procento oblasti označené Ki-67 v CM bylo o 48 procent menší u LP ve srovnání s NP plodem, zatímco imunoreaktivita Bcl-2 a štěpená kaspáza-3 se nelišila od obou skupin (obr. 5 a 6). Na druhé straně u LP byly oblasti značené CM a UB-cateninem zvýšeny o 154 a 85 procent, v tomto pořadí, ve srovnání s těmi, které jsou k dispozici u potomků NP (obr. 7). Současně distribuce imunoreaktivity mTOR také zabírala významně rozsáhlejší oblast u LP CM (139 procent) a UB (104 procent) než u plodu NP (obr. 7). U LP potomků se TGF -1 v barvení buněk UBS zvýšil (asi o 30 procent), zatímco v CM se imunobarvené buňky nelišily ve vztahu k NP skupině (obr. 8). Metanefros barvené ZEB1, lokalizované v buňkách CM jader, zvýšilo LP o 30 procent ve srovnání s NP plodem (obr. 8). Současně byla imunofluorescence ZEB2, i když byla přítomna v celých strukturách metanephros, podobná v obou experimentálních skupinách (obr. 8). Současná studie zohledňující expresi miRNA a mRNA a proteiny
Diskuse
Znalosti o buněčných a molekulárních mechanismech nefrogeneze se zvýšily [33–37]. Je však zapojeno mnoho regulačních faktorů a signálních drahledvinovéontogeneze zůstává nejasná [38]. miRNA hrají klíčovou roli při regulaci genové exprese běhemledvinovévývoj [25, 39–41]. Pokud je nám známo, analýzy exprese miRNA a mRNA v mateřském příjmu LP 17-DG samčích mezenchymových buňkách nebyly provedeny. Navrhujeme nový molekulární mechanismus zapojený do inhibice časné nefrogeneze, což vede ke snížení počtu nefronů. Použili jsme NGS k vyhodnocení exprese miRNA a zjistili jsme, že 19 miRNA bylo up-a 25 downregulovaných v 17-DG LP ve srovnání s NP metanefros. Mezi top 10 deregulovanými miRNA jsme vybrali 7 miRNA s biologickými cíli zapojenými do proliferace, diferenciace a buněčné apoptózy. Jak miRNA-Seq, tak TaqMan analýza dat odhalila konzistentní a specifické změny v expresi miRNA u LP zvířat ve srovnání s kontrolními NP zvířaty stejného věku.
Rodina miR-181 se skládá ze čtyř vysoce konzervovaných členů, jmenovitě miR-181a, miR-181b, miR-181c a miR-181d [ 42]. V neoplastických buňkách působí miR{6}}a jako nádorový supresor, inhibuje buněčnou proliferaci a migraci a indukuje buněčnou apoptózu [43]. Tato studie odhalila zvýšenou expresi miR-181a-5p v 17-DG LP ve srovnání s potomky NP odpovídajícího věku. Ačkoli exprese mRNA kaspázy byla nezměněna, dvojnásobné zvýšení poměru mRNA Bax/Bcl-2 v LP ve srovnání s NP potomky naznačuje zvýšenou apoptózu v CM, což naznačuje, že apoptóza je regulována post-transkripčně. Studie ukázaly, že rodina BCL podporuje uvolňování cytochromu z mitochondrií a poté inhibuje aktivaci Casp3, čímž inhibuje buněčnou apoptózu [44]. Li a kol. použili model akutního poškození plic k odhalení, že nadměrně exprimovaný miR-181a souvisí se sníženou hladinou Bcl{18}} proteinu; naopak inhibice miR-181a zvýšila hladiny Bcl{20}} [45]. Tato studie potvrdila výsledky Lv a kol., kteří prokázali, že miR-181c reguluje expresi Six-2 exprese a buněčnou proliferaci negativně, paralelně se ztrátou fenotypu mezenchymálních buněk běhemledvinavývoj v LP 17-DG potomstvo [25].
Xiang a kol. prokázali, že zvýšená exprese miR{0}} potlačujeledvinovéproliferace karcinomu, což má za následek kratší G2/M fázi. Navíc Xiang a kol. odhalili, že nadměrná exprese miR-144 inhibuje expresi genu mTOR a proteinu [46]. Nijland a kol. prokázali, že zvýšení signalizace mTOR je klíčové pro stanovení počtu nefronů u embryí, jejichž matky byly podrobeny omezení živin [47]. Savčí cíl rapamycinového komplexu 1 (mTORC1) je nezbytný pro vývoj embrya; jak však tento komplex reguluje rovnováhu mezi růstem a autofagií za fyziologických podmínek a environmentálním stresem, zůstává neznámé [48]. Signalizace mTOR se proto může podílet na buněčných odpovědích u zvířat vystavených příjmu LP během březosti; při vnímání, indukci a ukončení autofagie; a jako odpověď na intracelulární dostupnost živin [46]. Hypoteticky, během těžké restrikce proteinů může být snížená exprese miR-144-3p spojena se zvýšenou expresí mTOR, přibližně o 139 procent a 104 procent v CM buňkách a UB, v daném pořadí, aby se kompenzovala ztráta nefronů v {{ 11}}DG LP potomci Chen a kol. definoval miR-127 jako nový regulátor stárnutí buněk prostřednictvím Bcl-6 [49]. Pan a kol. uvedli, že podexprese miR-127 koreluje se zvýšenou buněčnou proliferací v jaterních buňkách [50]. Tato studie prokázala snížení buněčné proliferace a významné snížení počtu buněk pozitivně značených na Ki-67 v KM zvířat s omezeným přístupem na proteiny. Navíc byla pozorována redukce nefrogenní oblasti a proliferace u LP potomstva, což bylo v souladu s výsledky Menendez-Castra et al. u 8,4 procenta proteinově omezeného potomstva [51, 52]. Zvýšená exprese Ki-67 a Bcl-6 mRNA, doprovázená sníženou expresí miR-127-3p v čepici 17-DG LP by tedy mohla být spojena s protiregulačními mechanismy k udržení proliferace.
Sun a kol. prokázali, že nadměrná exprese miR-199a-5p kromě kontroly buněčného cyklu snižuje proliferaci cystických buněk a indukuje apoptózu [53]. V této studii je exprese miR-199a-5p snížena v 17-DG LP je doprovázena zvýšenou transkripcí Ki-67, markeru buněčné proliferace, a Map2k2 je spojena se sníženou Ki-67 reaktivitou u LP 17-DG metanephros. Gestační podvýživa tedy podporuje diferenciaci prostřednictvím post-transkripčního mechanismu. Naše výsledky odhalují represivní roli homeoboxu 1 vázajícího E box zinkovým prstem (ZEB1), induktoru EMT, který udržuje pluripotenci kmenových buněk během diferenciace embryonálních kmenových buněk. -catenin je známý tím, že aktivuje jadernou transkripci ZEB1, což vede k expresi ZEB1 [34]. Signální dráha TGF, jedna z nejlépe prostudovaných drah, může indukovat EMT během embryonálního vývoje. Pro embryonální vývoj je zapotřebí několik ligandů podobných TGF. Ne všechny TGF-zprostředkované účinky na EMT však závisí na ZEB1/2, knockoutované buňky mohou indukovat expresi mezenchymálních genů fibronektinu a N-cadherinu. E-cadherin však již není downregulován a také se tvoří aktinová vlákna [54]. Karner a kol. oznámil, že běhemledvinovévývoj, Wnt9b/ -catenin
signální dráha, exprimovaná v UB i CM, je nezbytná jak pro obnovu progenitorových buněk nefronů, tak pro diferenciaci, protože je nezbytná pro tvorbu nefronů během embryogeneze [55]. Evolučně konzervovaná Wnt9b/-catenin dráha hraje kritickou roli ve vývoji orgánů, tkání a při opravě poranění u vícebuněčných organismů. Studie ukázala, že c-Myc je transkripční cíl -cateninu, který reguluje proliferaci a diferenciaciledvinovétubulární epitel [56]. Exprese -cateninu na genové a proteinové úrovni se během studovaných období zvyšovalaledvinovévývoj u plodu 17-GŘ LP. Pan a kol. uvedli, že Myc spolupracuje s -cateninem na podpoře obnovy progenitorových buněk nefronů [10]. Zde ve srovnání s věkově odpovídajícími NP potomky, LP vykazoval nižší expresi c-Myc. Proto mohou mít tato zvířata nižší rezervu obnovitelných buněk nezbytných pro proliferaci a přežití a mohou odrážet menší počet nefronů v modelu LP. Navíc,
Signálové dráhy Wnt/-catenin a Notch mohou koordinovat regulaci exprese Six-2 a podílejí se na downregulaci exprese Six-2 v progenitorových buňkách nefronů. Studie prokázaly, že k udržení exprese Six-2 a CM progenitorových buněk v nediferencovaném stavu mohou být nutné nízké hladiny -cateninu; navíc zvýšené hladiny - cateninu určují osud progenitorových buněk nefronu [57, 58]. Předpokládáme tedy, že snížená signalizace cMyc a Notch, doprovázená zvýšenou expresí -cateninu, snížila expresi Six-2 o 28 procent u 17-DG LP potomků a korelovala s časnou diferenciací CM buněk a snížením kmenových buněk a počet nefronů v dospělosti. Naše data navíc mohou potvrdit, že u LP potomků MM buněk může zvýšená exprese Let-7a-5p a -catenin a snížený signál Notch modulovat c-Myc, Six-2, a Ki-67 exprese, což vede ke snížení samoobnovy progenitorových buněk. Deplece zbývajících progenitorových buněk CM vede ke snížení počtu nefronů a rozvoji arteriální hypertenze aledvinovéporuchy v dospělosti (obr. 10). V souladu s výsledky Boivina et al. naše výsledky naznačují, že zvýšený CM-catenin narušuje růst UB a nefrogenezi [59]. Studie ukázaly, že růstový faktor neurotrofický faktor odvozený od glií (GDNF), klíčový regulátor růstu UB, signalizuje prostřednictvím receptoru c-Ret tyrozinkinázy a koreceptoru Gfra1 [60, 61]. U 17-GŘ LP potomků významný
zvýšení mRNA kódující c-Ret receptor by teoreticky vedlo ke zvýšení růstu UB. Nicméně v této studii byla exprese GDNF nezměněna, což naznačuje, že navzdory zvýšení cRet mRNA bylo větvení UB sníženo. Dříve jsme pozorovali snížení počtu větví ureterických pupenů o 28,3 procenta po 14,5 dnech restrikce gestačního proteinu [4], což mohlo být spojeno s 28procentním snížením značení Six-2 MM buněk, navzdory žádné změně GDNF transkripce. -catenin pravděpodobně interaguje s receptorem c-ret a je transportován do jádra UB buňky, čímž podporuje expresi TGF -1 v epiteliálních buňkách, inhibuje větvení UB a způsobuje předčasnou diferenciaci CM progenitorových buněk, jak je vidět na {{11} } Potomci DG LP [62– 64]. Proto GDNF nemusí být nezbytný při zprostředkování mezenchymálních signálů do ureterického pupenu; mechanismus však zbývá objasnit. Prokázali jsme, že MM z 17-DG LP potomků vykazoval specifické zvýšení exprese Let-7 miRNA, což vedlo k výraznému zhoršeníledvinavývoj, čímž se potvrdila modulační úloha těchto genů ve vývojovém načasování nefrogeneze [65].
V počátečních studiích inzulinového růstového faktoru (IGF) byly převládající role IGF-1 a -2 v růstu plodu objasněny četnými, ale většinou nepřímými důkazy. Bylo zjištěno, že IGF působí jako proliferační a diferenciační faktory v kultivovaných fetálních buňkách a preimplantačních embryích. Navíc bylo zjištěno, že IGF jsou vylučovány kultivovanými fetálními buňkami a explantáty in vitro [66]. Růstové faktory, včetně IGF, mohou způsobit částečný nebo úplný epiteliálně-mezenchymální přechod. Aktivace IGF drah vede k upregulaci EMT indukcí exprese ZEB1 [67]. Ačkoli se na něm podílí několik kandidátních růstových faktorůledvinavývoji, zda se účastní nefrogeneze, není známo. V různých časech mohou být potřeba různé růstové faktory. Některé růstové faktory mohou být v tomto kontextu nadbytečné. Během embryonálního vývoje jsou potřebná sekvenční kola EMT a MET k odlišení specializovaných typů buněk a vytvoření trojrozměrné struktury. V této studii bylo zjištěno, že mezenchymálně-epiteliální interkonvertibilita udržuje buněčnou plasticitu, což naznačuje přítomnost vysoce indukovatelného systému v podmínkách LP pro embryo. Exprese rodiny Let-7 miRNA byla rozsáhle studována v různých fetálních tkáních. Nárůst exprese Let-7 miRNA souvisí se sníženou proliferací a časným zvýšením diferenciace MM buněk, a následně se sníženým počtem nefronů [27, 15, 68–71]. Vyšší exprese Let-7 byla prokázána u vyšších organismů během poslední fáze mozkové embryogeneze u hlodavců [72, 73]. Nagalakshmi a kol. odhalili, že exprese Let{11}} miRNA změnila osud UB epiteliálních buněk z prekurzoru na diferencovaný stav [71]. Naproti tomu Yermalovich et al. prokázali, že nadměrná exprese Lin28b, proteinu vázajícího RNA, je spojena se supresivními Let{15}} miRNA. Ačkoli lin28 a Let{17}} jsou známé regulátory ontogenního načasování u bezobratlých, jejich role ve vývoji orgánů savců není známa [65]. V této studii by zvýšení exprese Let-7a-5p miRNA u plodu LP mohlo být spojeno se sníženou proliferací buněk CM, což ohrozilo nefrogenezi ve srovnání se skupinou NP. Předpokládáme tedy, že k potlačení proliferace CM buněk a časnému zastavení nefrogeneze způsobené zvýšenou Let-7 miRNA může dojít přímo nebo nepřímo prostřednictvím přechodně snížené exprese Lin28b v 17-DG LP. Tento efekt může výrazně zhoršitledvinavývoj v 17-DG LP, což potvrzuje, že tento gen reguluje načasování vývoje během nefrogeneze. V této studii se zvýšená exprese Let-7a-5p miRNA shoduje se snížením exprese c-Myc. Myc se účastní proliferace, růstu, apoptózy a diferenciace buněk běhemledvinovéorganogeneze [74–76]. U potomků LP 17-DG byla exprese genu MM c-Myc snížena a oblast imunoreaktivity CM c-Myc byla o 14 procent menší ve srovnání s oblastí u potomků NP. Současně bylo pozorováno 14procentní snížení počtu CM buněk, které snížilo 48procentní Ki-67 imunoreaktivitu v LP vzhledem k NP potomkům. Studie konzistentně prokázaly, že c-Myc hraje důležitou roli v konečné fázi větvení UB a při stimulaci proliferace progenitorových buněk CM [74].
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL
snížená hladina v kmenových buňkách, které je udržují v nediferencovaném stavu. V této studii však silná exprese Let{0}}a{1}}p miRNA v CM snížila expresi c-Myc, čímž se snížila proliferace progenitorových buněk a časná buněčná diferenciace v LP 17-DG potomstvo (obr. 10). Studie naledvinyc-Myc transgenních myší odhalilo současný pokles c-Myc a S-ix-2 imunopozitivních CM buněk spojený se sníženou proliferací kmenových buněk [74]. Tato studie ukazuje významné (28 procent) snížení šesti-2 pozitivních buněk, což je specifickéledvinovémarker kmenových buněk, jako je pokles pozorovaný u počtu nefronů v CM potomstva 17-DG LP ve srovnání s tím u potomků NP. V roce 2009 Fogelgren a spol. prokázali, že exprese šesti{2}} genů je během fetální ontogeneze snížena, když je spojena se sníženým počtem nefronů, hypertenzí a chronickýmiselhání ledvin[77]. Snížená exprese genu Six{1}} v progenitorových buňkách CM tedy naznačuje potlačení diferenciace indukované signálem běhemledvinovévývoj v 17-DG LP potomstvo. Nicméně redundance by měla být používána s opatrností – jemné defekty v nefrogenezi se mohou projevit při podrobnější analýze nebo za jiných podmínek. Hladiny IGF1 mRNA byly nejvyšší během počátečního období metanefrického vývoje, přičemž transkripty byly detekovány v průběhu MM, zatímco jejich hladiny během dalšího vývoje klesaly. Nicméně běhemledvinaembryogeneze, křehká rovnováha mezi růstovými faktory usnadňujícími nefron (IGF1) a inhibičními růstovými faktory (TGF -1), reguluje větvení UB.
Závěr
Ačkoli několik autorů studovalo nefrogenezi [34, 37, 78], o mechanismech, které určují počet nefronů, je známo jen málo. Tato studie ukazuje, že mnoho miRNA, mRNA a proteinů MM progenitorových buněk je u 17-DG LP potomků změněno, což vede ke snížené proliferaci a časné buněčné diferenciaci (obr. 11). Tato křehká rovnováha mezi obnovou progenitorů nefronů a diferenciací je nezbytná proledvinavývoj, protože nedosažení dostatečného počtu nefronů je rizikovým faktorem pro chronickouledvinovéporucha.
