Imunomodulační faktory v Cistanche Salsa

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Shinjiro MARUYAMA," Koji YAMADA, Hirofumi TACHIBANA

Cistanche salsa(CAMever) G.Beck, Orobanchaceae je parazitická rostlina, která se v Japonsku používá jako orientální léčivé tonikum. V naší předchozí studii jsme zjistili, že extrakt C, salsa zvýšil produkci IgM i IgG v lidských lymfocytech Ivmph uzlin. Dále C, salsa dialyzát (CSD) připravený pomocí dialyzační membrány s a3.500-Mezní hodnota molekulové hmotnosti Da zvýšila produkci IgM v linii lidských B-buněk BALL-1; navíc vyvolal mírnou buněčnou proliferaci. Na rozdíl od toho však CSD indukoval inhibici růstu doprovázenou apoptózou v buněčné linii Namalwa lidského Burkittova lymfomu. Tyto výsledky naznačují možnou přítomnost aktivních složek v CSD, které jsou specifické pro lymfocyty. Dosud nebyly objasněny chemické vlastnosti těchto složek. V této studii jsme zkoumali chemické vlastnosti aktivních složek v CSD. Obě výše uvedené aktivity v B-buněčných liniích nebyly inaktivovány ošetřením CSD v autoklávu. Pomocí gelové filtrační kolonové chromatografie jsme zjistili, že píky aktivních frakcí byly koncentrovány v různých frakcích. Naše výsledky naznačují, že v CSD jsou alespoň 2 typy aktivních složek a mohou to být polysacharidy, protože jsou ve vodě rozpustnými složkami s vysokou molekulovou hmotností a jsou termostabilní.

Klíčová slova: Cistanche salsa, vysoká molekulová hmotnost, IgM, inhibice růstu.

Úvod

Cistanche salsa(CA Meyer) G.Beck, Orobanchaceae je parazitická rostlina, která se v Japonsku používá jako orientální léčivé tonikum. V Číně je tato rostlina důležitým tradičním lékem používaným k léčbě nedostatku ledvin a neurastenie. Prostřednictvím studií in vitro jsme již uvedli účinky C. salsa na imunitní systém. První. prokázali jsme, že extrakt z C. salsa zvýšil produkci IgM a IgG v lymfocytech lidských lymfatických uzlin. Za druhé, ukázali jsme, že dialyzát C. salsa (CSD) připravený pomocí dialyzační membrány s mezní hodnotou molekulové hmotnosti 3,{1}D zvýšila produkci IgM v linii lidských B-buněk BALL-1; navíc v malé míře indukoval buněčnou proliferaci.2 Kromě toho má CSD opačný účinek, kdy indukuje inhibici růstu doprovázenou apoptózou v buněčné linii lidského Burkittova lymfomu, Namalwa.3) Tato zjištění naznačují, že tento účinek CSD souvisí s aktivace B lymfocytů, zatímco apoptóza je výsledkem nedostatku jiných signálů, které jsou nutné pro diferenciaci B lymfocytů, jako jsou cytokiny a kontakt buňka-buňka; chemické vlastnosti CSD však nebyly objasněny v žádné z předchozích studií. Proto jsme v této studii zkoumali chemické vlastnosti aktivních složek v CSD.

Materiály a metody

CSD byl připraven stejnou metodou v naší předchozí studii. CSD byl rozpuštěn ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) v koncentraci 20 mg/ml. Připravený roztok (0,8 ml) se před aplikací nechal projít filtrem (0,22 um) a poté se stejným roztokem eluoval přes kolony obsahující TOYOPEARL HW-40F (1.0×96,5 cm; Tosoh Corp, Japonsko),TOYOPEARL HW-55F(1.0 × 98.0 cm; Tosoh Corp., Japonsko) a Sephacryl S-400HR(1.0×98,0 cm; GE Healthcare UK Ltd.,.Anglie); a poté byly shromážděny 1 ml (30 kapek) frakce. Pro stanovení prázdného objemu gelů a přibližné molekulové hmotnosti (MW) frakcionovaných složek byl použit modrý dextran (BD) (Sigma-Aldrich Japan KK, Japonsko); a dextrany o známé MW získané z Leuconostoc spp. (Sigma-Aldrich Japan KK, Japonsko), tj. MW2, 000 kDa(Dl), 500 kDa(D2), 70 kDa (D3) a 6 kDa (D4); a kyanokobalamin (VB12, MW:1355,4) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japonsko). Celkový obsah cukru a proteinu v každé frakci byl stanoven pomocí metody fenol-kyselina sírová a Lowryho metody se soupravou pro stanovení proteinů PIERCETM bicinchoninové kyseliny (BCA) (Thermo Fisher Scientific Inc., USA). Jako příslušné standardy byly použity glukóza a hovězí sérový albumin. Dále byla měřena absorbance při 320 nm (A:2o) každé frakce. Eluční píky modrého dextranu a kyanokobalaminu byly stanoveny jejich absorbanční hodnotou při 260 nm a píky dextranů o známé MW byly stanoveny pomocí metody fenol-kyselina sírová. CSD byl autoklávován při 120 stupních po dobu 20 minut, aby se vyhodnotila jeho tepelná stabilita. V biologických testech byly buněčné kultury a měření IgM prováděny stejnou metodou v naší předchozí studii.

Extrakt z cistanche salsy

Výsledky a diskuse

Obrázek 1 ukazuje sloupcové chromatogramy CSD pro gelovou filtraci na HW-40F. Z obrázku la byla molekulová hmotnost aktivních složek odhadnuta na více než 6 kDa na základě dextranového markeru D4. Kromě toho obě aktivity CSD, tj. zvýšení produkce IgM a indukce inhibice růstu, nebyly inaktivovány ošetřením v autoklávu (obrázek 2), ačkoli některé složky se agregovaly a ztratily se poté, co CSD prošel 0.{{6} }hm filtr. Eluční vzorce CSD a autoklávovaného CSD byly téměř totožné, nicméně relativní aktivita zvýšení produkce IgM v autoklávovaném CSD byla nižší než u neošetřeného CSD. Některé z důvodů se zdá, že agregáty obsahovaly aktivní složky nebo některé z aktivních složek byly inaktivovány. Výsledky chromatografie na HW-55F ukázaly možnou přítomnost 2 typů imunomodulačních faktorů: prvního, koncentrovaného ve fr. č.32. byla vysokomolekulární aktivní složka (HCS), která by mohla zvýšit produkci IgM, zatímco druhá, koncentrovaná ve fr. č. 50, byla aktivní složka se střední molekulovou hmotností (MCS), která mohla inhibovat buněčnou proliferaci (obrázek 3). Avšak píky získané jak pro HCS, tak pro MCS (fr. č. 32 a 50) nebyly tak ostré jako píky dextranů se známou MW (data nejsou uvedena). Tato pozorování naznačují možnost výskytu vedlejších produktů uměle generovaných během přípravy CSD, polymerů aktivních složek, které se snadno ničí a obsahují více jednotek, nebo různých aktivních složek, které mají různé původní MW. Eluční vzory na chromatogramech ukazují, že není snadné získat čisté složky z HCS a MCS, protože se zdá, že existují různé složky, které mají mírně odlišné MW, jak je uvedeno výše. Ačkoli jsou obě směsi aktivních složek, zdá se, že HCS obsahuje složky s MW přesahující 70 kDa, zatímco MCS obsahuje složky s MW přesahující 6 kDa. HCS byl eluován na HW-55F ve frakci, která byla mimo rozsah separace. Na Sephacrylu-S400. byla část HCS (fr.č. 36) eluována ve stejné frakci jako D1 marker, který má MW 2,000 kDa (obrázek 4). Obecně se polysacharidy a proteiny berou v úvahu jako ve vodě rozpustné složky s vysokou MW v rostlinných extraktech. Protože téměř všechny funkční proteiny jsou tepelným zpracováním inaktivovány, zdá se, že jde o polysacharidy. Nicméně, Park et. al. popsali termostabilní cytotoxický malý protein zvaný viscotoxin, který se připravuje z extraktu jmelí (Viscum album L., Viscaceae).4 Dále bylo prokázáno, že viskotoxiny zvyšují imunomodulační aktivitu lidských přirozených zabíječských buněk.5 Na obrázku 3 je MCS, který má nižší MW, vykazuje vyšší obsah bílkovin. Vzhledem k těmto skutečnostem může být MCS polysacharidem vázaným na protein8 nebo může být termostabilním proteinem, jako jsou viskotoxiny. Tyto výsledky ukazují, že 2 aktivními složkami mohou být polysacharidy. Jinak by MCS mohly být termostabilní proteiny.

Reference

1) Deng, M., Zhao, JY, Ju, XD, Tu, PF, Jiang, Y., Li, ZB: Ochranný účinek tubulosidu B na apoptózu v neuronových buňkách indukovanou TNF alfa. Acta Pharmacol. Sin., 25, 1276-1284, 2004.

2) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H.:Extrakt z cistanche salsyzvýšená produkce IgM v linii lidských B buněk, BALL-1.J. Trad. Med., 24, 209-211, 2007.

3) Maruyama, S., Yamada, K., Tachibana, H:Cistanche salsaextrakt indukoval apoptózu v buněčné linii lidského Burkittova lymfomu Namalwa. J.Trad. Med., 25, 24-27, 2008.

4) Zaparkujte. JH,Hyun, CK,Shin HK: Cytotoxické účinky složek tepelně upraveného jmelí (Viscum album).Cancer Let, 139, 207-213,1999.

5) Tabasco, J., Pont, F, Fournic, JJ, Vercellone, A.: Viskotoxiny ze jmelí zvyšují cytotoxicitu zprostředkovanou přirozenými zabijáckými buňkami. Eur.J. Biochem., 269, 2591-2600, 2002.

6) Fisher, M., Yang, LX: Protirakovinné účinky a mechanismy polysacharidu-K (PSK): důsledky imunoterapie rakoviny. Anticancer Res.,22,1737-1754,2002.

cistanche doplňky