Imunitní genová exprese a funkční sítě v různých třídách lupusové nefritidy Ⅰ

ABSTRAKTNÍ

Cíl Prozkoumat užitečnost platformy NanoString vobjasňující ledvinaimunitních transkriptů pro lupusovou nefritidu (LN) třídy III, IV a V pomocí retrospektivní kohortyformalínem fixovaný parafín zalitý(FFPE) biopsie ledvinové tkáně.

Metody: Analýza imunitního genového transkriptu byla provedena pomocí platformy NanoString nCounter na RNA z LN (n=55), onemocnění tenké bazální membrány (TBM) (n=14) a membranózní nefropatii (MN) (n{ {2}}) FFPEbiopsie ledvintkáň. Vzorky LN sestávaly z jednotlivých biopsií třídy III (n=11), IV (n=23) a V (n=21) bez smíšených lézí. Diferenciální genová exprese byla provedena pomocí NanoString nSolver, s vizualizacemi sopečných grafů a teplotních map vytvořených v R. Významné transkripty byly zkoumány k identifikaci funkčních sítí pomocí STRING a termínů genové ontogeneze.

KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE BYLINNOU FORMULACI CISTANCHE PRO LEDVINY

Výsledky Ve srovnání s TBM jsme identifikovali 52 významně odlišně exprimovaných genů společných všem třem třídám LN. Analýza dráhy ukázala obohacení o signalizaci interferonu typu I (IFN), komplement a dráhy MHC II, přičemž většina vykazovala nejvyšší expresi ve třídě IV LN. Naše biopsie LN třídy IV také vykazovaly významnou upregulaci signalizace NF-κB a imunologické obohacení ve srovnání s biopsiemi LN třídy V. Transkripty z dráhy IFN typu I odlišily třídu V LN od MN.

Závěr Naše transkriptomická analýza celého úseku ledviny poskytla pohled na molekulární profil třídy III, IV a V LN. Data zdůraznila důležité cesty společné pro všechny tři třídy a cesty obohacené v našich biopsiích LN třídy IV. Schopnost odhalit molekulární dráhy v LN pomocí FFPE celých bioptických řezů by mohla mít klinickou užitečnost při výběru léčby pro LN.

ÚVOD

Lupusová nefritida(LN) je důležitým projevem systémovéholupus erythematodes(SLE) a rozvíjí se přibližně u 40 % pacientů.1 Jeho prevalence je ovlivněna věkem (vyšší u SLE se začátkem v dětství) a etnickým původem (vyšší u nebělošských pacientů) a je nepřímo spojena se socioekonomickým statusem.2biopsie ledvinje důležitou součástí léčby LN3 4 a bylo vynaloženo značné úsilí, aby se změny pozorované v biopsii spojily s patogenezí, výběrem léčby a prognózou.1 Rozhodující pro to byl vývoj klasifikačního systému LN, který zahrnoval standardizované definice bioptických lézí ke snížení variability mezi hlášeními.

Konsenzuální klasifikace LN5 Mezinárodní společnosti nefrologie/Společnosti pro renální patologii (ISN/RPS) z roku 2003 popsala šest tříd: minimální mezangiální LN (třída I); mesangiální proliferativní LN (třída II); ohnisková LN (třída III); difuzní LN, které lze dále rozdělit na difuzní segmentální (třída IV-S) a difuzní globální (třída IV-G) proliferativní LN; membranózní LN (třída V) a pokročilá sklerotizující LN (třída VI). Aktivní (A, např. endokapilární hypercelularita, fibrinoidní nekróza, buněčné a mikrocelulární srpky) a chronické (C, např. glomerulární skleróza, vláknité srpky) glomerulární léze byly také definovány a označeny při popisu tříd III a IV. Například třída IV-G (A) popsala difuzní globální proliferativní LN s aktivními lézemi. Byla navržena aktualizace této klasifikace.6 Doporučení zahrnovala odstranění pododdělení třídy IV-S a IV-G, protože tyto neovlivňují výsledek. V metaanalýze výskyt oboukonečné stadium onemocnění ledvinnebozdvojnásobení sérového kreatininuse nelišily mezi třídami IV-S a IV-G.7 Bylo také navrženo nahradit aktivní a chronické deskriptory indexy aktivity a chronicity odvozenými ze systému NIH lupus aktivity a skórovacího systému8, což umožní kvantitativní hodnocení aktivity (a skóre 0 až 24) a chronicita (skóre 0 až 12).

Třída LN je kritická pro informování managementu.3 Imunosuprese se doporučuje u aktivní třídy III a IV LN, ale ne u třídy II LN. Rozhodnutí zahájit imunosupresi u třídy V LN je ovlivněno stupněm proteinurie a její odpovědí na blokádu renin-angiotenzin-aldosteron. Selhání kontroly proteinurie 12 měsíců po léčbě je spojeno s progresí do chronického onemocnění ledvin9–11, takže cílem léčby je snížit proteinurii s cílem dosáhnout kompletní klinické odpovědi (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Samotná třída LN je méně robustní v informování výsledků, protožerizikové faktory pro rozvoj chronického onemocnění ledvinzahrnoutklinické příznakya protože obsahují histologické rysy, které nejsou zachyceny definicemi třídy LN. Patří mezi ně stupeň intersticiální fibrózy a tubulární atrofie (IFTA) a specifické glomerulární léze, jako je fibrinoidní nekróza a fibrózní půlměsíčky.12 Kvantifikace vybraných a dobře definovaných jednotlivých lézí ledvin může poskytnout prognózu. To je evidentní u IgA nefropatie, kde bylo prokázáno, že skórování mezangiální celulárnosti, endokapilární hypercelulárnosti, segmentální sklerózy, tubulární atrofie, intersticiální fibrózy a srpků tvořících skóre MEST-C pomáhá předpovídat riziko.13–15 Navrhované revize ISN /RPS 2003 konsensuální klasifikace LN by mohla tyto nedostatky řešit6, ale stále je založena na použití morfologie. V důsledku toho je potřeba studovat molekulární dráhy v biopsiích LN a porozumět tomu, jak souvisí s třídami LN16 17 a výsledky léčby.18 19 Z hlediska klinické užitečnosti je transkriptomická analýza biopsií ledvin nejlepší pokročilý v diagnostice protilátkami zprostředkované rejekce ledvin, kdy zvýšení exprese genových transkriptů v bioptické tkáni bylo, až do ověření, přidáno k validovaným morfologickým kritériím.20 K určení užitečnosti použití transkriptomických dat ke zlepšení klinické užitečnosti ledvin biopsii u SLE jsme použili technologii NanoString ke studiu exprese 750 imunitních a zánětem souvisejících transkriptů v řezech zalitých v parafínu (FFPE) z 55 biopsií LN, 14 biopsií s onemocněním tenké bazální membrány (TBM) a 9 biopsií s membranózní nefropatie (MN).

METODY

Vzorky: Tkáň biopsie ledviny FFPE byla získána z archivovaných vzorků LN, TBM a MN, které byly přebytečné pro klinické použití a kde byla k dispozici vhodná tkáň pro analýzu. Biopsie lupusu se smíšenými lézemi nebo významnými jizvami byly vyloučeny. TBM byla použita jako kontrola onemocnění kvůli nedostatku dostupnosti normálních biopsií ledvin. Klinické parametry byly shromážděny ze zdravotních záznamů retrospektivně. Skórová matrice interferonu (IFN) byla získána, jak bylo uvedeno dříve.21 Kompletní odpověď byla definována jako poměr protein/kreatinin v moči (uPCR)<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20 % do 1 roku po biopsii. Částečná odpověď byla definována jako uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

Extrakce RNA

Šest 10 μm tlustých řezů celé tkáně bylo získáno mikrotomem z každého bloku FFPE, po odstranění dvou 4 μm řezů. Aby se zabránilo křížové kontaminaci, bylo zařízení mezi vzorky vyčištěno pomocí RNase Away a pro každý vzorek byla použita čerstvá čepel. Izolace RNA celé tkáně byla provedena ve stejný den pomocí soupravy RNeasy FFPE Kit (Qiagen, #73504) a koncentrace RNA byla hodnocena spektrofotometrem NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; online doplňková data S1).

Analýza transkriptomu

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >dvojnásobek (průměr+2 SD) negativních kontrolních sond. Počty byly normalizovány na geometrický průměr 10 provozních genů (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB a ZC3H14), vybraných tak, jak byly exprimovány ve všech typech vzorků. Normalizované počty pro všechny vzorky jsou uvedeny v online doplňkových datech S2.

Statistická analýza

Diferenciální genová exprese (DGE) byla provedena pomocí řešiče pokročilé analýzy (V.4) Fast/Approxi mate algoritmu, který používá zjednodušený negativní binomický model pro všechny sondy kromě případů, kdy algoritmus nekonverguje a je použita metoda lineární regrese. LN, MN nebo třída LN (III, IV a V) byly použity jako nezávislé proměnné a TBM jako naše referenční skupina. Prahový počet byl nastaven na 100 a frekvence pozorování ve vzorcích byla nastavena na 8 %; Hodnota P byla upravena pomocí Benjamini-Hochbergovy metody s prahem falešného zjištění pro nastavenou na 0,05. Grafy sopek byly vytvořeny pomocí balíčku Enhanced Volcano (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) v R.22. Vizualizace funkční proteinové asociační sítě byla provedena pomocí databáze STRING (https:// string-db.org/) , využívající celou síť STRING. Hrany sítě byly definovány spolehlivostí a interakce byly nastaveny na nejvyšší skóre spolehlivosti interakce (Větší nebo rovné 0,9). Odpojené uzly v sítích nebyly zobrazeny. Významné odlišně exprimované geny byly hodnoceny na obohacení termínů genové ontologie (GO) (biologické procesy, molekulární funkce, buněčná složka), reaktomové dráhy a klastrové lokální sítě STRING. Sítě vizuální interakce byly vytvořeny s funkčním obohacením v termínech GO (biologické procesy) a analýze STRING. Plošně proporcionální Vennův diagram překrývajících se odlišně exprimovaných genů mezi podtřídami LN byl vygenerován pomocí BioVenn (www.biovenn. nl).23 Data z pokročilého softwaru pro řešení analýzy byla načtena do statistického prostředí R a vizualizace dat byla provedena pomocí boxplotů, analýzy hlavních komponent, sopečné grafy a tepelné mapy. Teplotní mapy byly vytvořeny pomocí Z skóre normalizovaných počtů a teplotní mapa v R. Shluky byly analyzovány pomocí Fisherova exaktního testu. Pro srovnání více skupin byla použita analýza rozptylu se Sidakovým testem vícenásobného porovnávání. Data byla analyzována pomocí GraphPad Prism (V.8.0).

Prohlášení o zapojení pacienta a veřejnosti (PPI).

Tato studie byla součástí konsorcia MASTERPLANS a spolupracovníci pacientů se účastnili všech pracovních oblastí včetně této studie. Glosář pojmů byl vytvořen společností PPI, aby umožnil další zapojení širší komunity pacientů a výsledky výzkumu byly zahrnuty do laických kontrolních dnů. Laické recenze publikací jsou sdíleny na webových stránkách MASTERPLANS (https://sites. manchester.ac.uk/masterplans).

Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ZÍSKEJTE PŘÍRODNÍ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOSIDU A 9 % AKTEOSIDU NA LEDVINY