Hypotermie vyvolaná oxkarbazepinem po přechodné ischemii předního mozku působí terapeutickou neuroprotekci prostřednictvím přechodného potenciálu receptorů Vaniloid typu 1 a 4 u pískomilů, část 3

4. Materiály a metody

4.1. Pokusná zvířata

Samci pískomilů (celkový počet=252) byli použiti ve věku 6 měsíců (tělesná hmotnost 63–78 g). Pískomilové byli chováni v Experimental Animal Center of Kangwon NationalUniversity (Chuncheon, Korea).

Pískomilové jsou velmi roztomilá zvířátka. Žijí v pouštních oblastech, jsou dobří v kopání jeskyní a mají silné instinkty pro ukládání a vyhledávání potravy. Mezi těmito malými kluky mají pískomilové samci obzvláště dobrou paměť, díky čemuž lidé chtějí znát jejich tajemství.

Za prvé, když samci pískomilů hledají potravu, používají k určení směru řadu signálů, jako jsou orientační body a terén. Dlouhodobým pozorováním a praxí si vybudovali vlastní „geografický informační systém“. Naproti tomu samice pískomilů mají na tyto signály horší paměť, zejména v neustále se měnícím prostředí.

Za druhé, samci pískomilů také vykazují silnou paměť při boji s přirozenými nepřáteli. Podle vědců, když jsou pískomilové ohroženi, rychle vniknou do nory a pokusí se uniknout. Ale když čelí stejné hrozbě, samci pískomilů si zapamatují způsob útoku přirozených nepřátel a vyhnou se jim, čímž zvýší své šance na přežití.

A konečně, paměť samců pískomilů spočívá také v jejich vzájemném sociálním chování. Každý pískomil má svůj jedinečný zápach. Když se setkají s jinými pískomily, použijí svůj čich k identifikaci identity a postavení toho druhého. Tato paměťová schopnost umožňuje pískomilům nejen vytvořit relativně stabilní sociální spojení, ale je také důležitou zárukou pro jejich reprodukci.

Stručně řečeno, vztah mezi samci pískomila a pamětí je neoddělitelný. V procesu hledání přežití a rozmnožování v přírodě spoléhají na svou silnou paměť, aby se neustále přizpůsobovali prostředí a zdokonalovali se. Jako lidé bychom se měli od těchto malých kluků učit a neustále zdokonalovat svou paměť, abychom se lépe přizpůsobili tomuto neustále se měnícímu světu. Je vidět, že potřebujeme zlepšit naši paměť a Cistanche dokáže výrazně zlepšit paměť, protože dokáže také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů, které jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může Cistanche také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek získá dostatečnou výživu a energii, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klepnutím na možnost Know zvýšíte výkon paměti

Pro tuto studii byl experimentální protokol schválen (číslo schválení. KW-200113-1; datum schválení 18. února 2020) výborem Institutional AnimalCare and Use Committee.

Výzkumný protokol se držel pokynů navržených v „Aktuálních mezinárodních zákonech a politikách“ Příručky pro péči a použití laboratorních zvířat, kterou vydalo The National Academies Press (8. vydání, 2011).

4.2. Experimentální skupiny, indukce tFI a ošetření HyT a OXC

Aby se prokázaly ochranné účinky OXC proti ischemickému poranění po tFI u pískomilů, byli pískomilové rozděleni do šesti skupin: (1) skupina simulace+vehikulum (n=24);(2) skupina tFI+vehikulum (n {{5 }}); (3) skupina sham+HyT (n=24); (4) skupina tFI+HyT (n=60); (5) skupina simulovaná + OXC (200 mg/kg) (n=24); a (6) skupina tFI+OXC (n=60).

Sedm a pět pískomilů ve třech skupinách tFI bylo použito pro analýzu Western blot a histologické vyšetření 30 minut, 12 hodin, 1 den, 2 dny a 4 dny po operaci tFI a ve třech simulovaných skupinách sedm a pět pískomily byly použity 30 minut a 4 dny po simulované operaci, aby se minimalizoval počet. V tomto experimentu byl tFI vyvinut, jak bylo popsáno dříve [34].

Stručně řečeno, pískomilové byli anestetizováni 2,5% isofluranem (v 32% kyslíku a 68% oxidu dusného). V anestezii byly obě společné krční tepny izolovány z karotidové pochvy uzavřené svorkami na aneuryzma (Yasargil Německo FE 723K) (Aesculap ) po dobu pěti minut.

Dokonalé zastavení přísunu krve do mozku bylo potvrzeno pozorováním arteriálního průtoku krve v obou retinálních tepnách (větvech vnitřních karotidarterií) pomocí oftalmoskopu (HEINE K180®) od Heine Optotechnik (Herrsching, Německo).

Tělesná teplota před operací a během ní byla ve všech skupinách kontrolována na normotermii (37 ± 0,2 ◦C) pomocí termometrické přikrývky. Po pěti minutách okluze byly klipy odstraněny.

V této studii byla provedena falešná operace tak, že byly podrobeny stejné operaci tFI bez okluze společných karotid. HyT ve dvou skupinách sham+HyT a tFI+HyT byl kontrolován (podobně jako změna tělesné teploty u tFI+ OXC group) celotělovým chlazením pomocí ledového obkladu po dobu šesti hodin.

Tělesná teplota dvou skupin sham+OXC a tFI+OXC byla zaznamenávána po dobu šesti hodin po okamžité intraperitoneální injekci 200 mg/kg OXC (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA) po operaci tFI.

Dávkování OXC bylo zvoleno na základě předchozí studie, která uváděla, že 200 mg/kg OXC účinně chránilo před buněčnou smrtí v mozku po [36]. Pro zaznamenání změny tělesné teploty byla měřena tělesná teplota v konečníku každou hodinu po tFI. po dobu 6 hodin při pokojové teplotě (asi 22 ◦C).

Pískomilové dostali dobu zotavení čtyři dny po tFI, protože pyramidové buňky lokalizované v hipokampální oblasti CA1 začnou odumírat čtyři dny po tFI [30,34,62].

4.3. Test SMA

Test SMA byl proveden za účelem vyšetření změn hyperaktivity ve všech skupinách. Stručně řečeno, jak bylo popsáno dříve [63], test SMA byl proveden 1. den po tFI, protože lokomotorika dosahuje nejvyššího bodu 1. den po ischemickém poškození po tFI.

Pískomilové ze všech skupin byli adaptováni na prostředí po dobu dvou hodin a byli umístěni do otevřené polní klece (šířka 44 cm; délka 44 cm; výška 30) získané od Ugo Basile SRL (Gemonio, Itálie), ve které byly dvě rovnoběžné horizontální infračervené paprsky 4 × 8 nad podlahou byly instalovány po dobu jedné hodiny. SMA byl zaznamenán pomocí Photobeam Activity System-Home Cage od San Diego Instruments (San Diego, CA, USA).

Pohyb (dráha a celková ujetá vzdálenost) byl detekován přerušením pole infračervených paprsků produkovaných fotobuňkami.

SMA byl nepřetržitě monitorován po dobu jedné hodiny a data byla sbírána pomocí analyzátoru AMB od IPC Electronics (Cumbria, UK).

Sběr dat byl zahájen 15 minut po habituaci v otevřené kleci. Nakonec byly získané výsledky vyhodnoceny jako vzdálenost (metry) pohybu v testovacím období (jedna hodina).

4.4. Testy kognitivních funkcí

4.4.1. RAMT

K porovnání prostorové paměti napříč všemi skupinami byla provedena RAMT podle předchozích studií [38,44]. Pro tento test bylo použito radiální 8-ramenné bludiště od Stoelting Co (Wood Dale, IL, USA).

Bludiště nástroj sestával z centrální plošiny a osmi ramen (každé rameno šířka 5 cm; výška 9 cm; délka 35 cm). Pískomilové byli trénováni jednou denně po dobu tří dnů před.

Konkrétně, pelety získané od DBL Co (Chungbuk, Korea) byly umístěny na koncovou část každého ramene a každý pískomil byl umístěn na centrální plošinu. Poté pískomil hledal potravu.

Po simulované nebo tFI operaci byl skutečný test prováděn jednou denně po dobu čtyř dnů počínaje jedním dnem po operaci.

Pro analýzu byl vyhodnocen počet chyb, přičemž jedna chyba se vyskytla pokaždé, když pískomil vstoupil do paže, která již byla dříve navštívena. Test byl ukončen, když pískomil zkonzumoval krmivo.

4.4.2. PAT

Pro srovnání krátkodobé paměti napříč skupinami byl PAT proveden podle dříve publikovaných metod [64,65] s určitými modifikacemi. Stručně řečeno, pískomilové byli testováni pomocí systému Gemini Avoidance System (GEM 392) od San Diego Instruments (SanDiego, CA, USA), který se skládá ze dvou (tmavých a světlých) oddílů, které spolu komunikují pomocí vertikálně posuvné brány.

Experimentální sezení byla prováděna ve dvou fázích: tréninková sezení a skutečná testovací sezení prováděná jeden den před a čtyři dny po tFI nebo falešné operaci.

Skutečný test byl proveden 20 minut po tréninku měřením doby latence (v sekundách) během pobytu v temné místnosti. Konkrétně při tréninku bylo pískomilovi umožněno volně prozkoumávat dvě oddělení po dobu jedné minuty, zatímco byla brána otevřena. .

Poté, když pískomil vešel do temného prostoru, dveře se zavřely a pískomil dostal elektrický šok (0.5 mA) z ocelové mřížky na podlaze po dobu pěti sekund.

Ve skutečné testovací relaci, 4. den po tFI, byl pískomil umístěn do světlého oddělení a byla zaznamenána doba latence ve světlém oddělení před vstupem do tmavého oddělení.

4.5. Analýza Western Blot pro TRPV1 a TRPV4

Pro vyšetření hladin exprese TRPV1 a TRPV4 v gerbil hippocampal CA1 byla provedena technika Western blot podle dříve popsaných metod [66,67].

Stručně řečeno, podle určeného rozvrhu (30 minut, 12 hodin, 1 den, 2 dny a 4 dny po simulované nebo tFI operaci) byla pískomilům (n=5 pro každou skupinu) podána anestezie pro eutanazii intraperitoneální injekcí s 200 mg/kg pentobarbitalu sodného (JW Pharm.Co., Ltd., Soul, Korea).

Poté byly jejich mozky sklizeny a homogenizovány s 50 mM fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS, pH 7,4) obsahujícím 0,1 mM ethylenglykol-bis (aminoethylether)-N, N, N{{ 11}}, kyselina N0-tetraoctová (EGTA) (pH 8.0), 10 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) (pH 8,0), 0,2 % Nonidet P{{17 }}, 15 mM pyrofosfát sodný, 100 mM-glycerofosfát, 2 mM orthovanadičnan sodný, 50 mM NaF, 150 mM NaCl, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) a 1 mM dithiothreitol (DTT).

Dále byly vzorky odstředěny a supernatanty byly odebrány pro stanovení hladin proteinu pomocí testovací soupravy Micro BCA od Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA) s hovězím albuminem od Pierce Chemical Co (Rockford, IL, USA).

Alikvoty obsahující 2 0 ug celkového proteinu byly vařeny v nanášecím pufru, 150 mM Tris (pH 6,8) obsahujícím 6 % dodecylsulfát sodný (SDS), 3 mM DTT, 0,3 % bromfenolové modři a 30 % glycerolu.

Vzorky byly separovány pomocí 10% SDS-polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE). Dále byly gely přeneseny na nitrocelulózové membrány od Pall Co (East Hills, NY, USA) při 350 mA a 4 °C po dobu 90 minut.

Pro blokování nespecifického barvení byly membrány inkubovány v 5% odtučněném mléce po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Poté byly imunoreagovány s každou primární protilátkou: králičí anti-TRPV1 (zředěná 1:1000) (Abcam, Cambridge, UK), králičí anti-TRPV4 (ředěná 1:1000) (Abcam) a králičí anti- - aktin (zředěný 1:2000) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) při 4 ◦C po dobu 7 hodin.

Následně reagovaly s oslím anti-králičím IgG konjugovaným s křenovou peroxidázou (HRP) (zředěný 1:4500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny.

Nakonec byla ke zlepšení vizualizace použita chemiluminiscenční souprava na bázi aluminolu od Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA).

Jak bylo popsáno dříve [68], imunobloty TRPV1 a TRPV4 byly analyzovány pomocí softwaru Scion Image od Scion Crop (Frederick, MD, USA). Pásy byly skenovány a byla provedena denzitometrická analýza. Hladiny proteinu byly normalizovány proti odpovídající hladině -aktinu.

4.6. Příprava histologických řezů

Pro imunohistochemická a histopatologická vyšetření byli pískomilové (n=7 pro každou skupinu) utraceni podle určeného plánu (30 min, 12 h, 1 den, 2 dny a 4 dny po tFI nebo simulované operaci).

Jak bylo popsáno dříve [34], pískomilové byli hluboce anestetizováni pentobarbitalem sodným (200 mg/kg) (JW Pharmaceutical, Soul, Korea). V anestezii byli pískomilové transkardiálně opláchnuti 0,1 M fosfátovým pufrem (pH 7,4) a fixováni 4% paraformaldehydem (v 0,1 M fosfátovém pufru, pH 7,4).

Následně byly získány jejich mozky a následně fixovány stejným fixačním prostředkem po dobu šesti hodin. Poté byly mozkové tkáně nařezány (25 um tloušťka koronálních rovin) v akryostatu (Leica, Wetzlar, Německo).

4.7. Histochemické barvení pomocí CV

Ke zkoumání morfologického a neuronálního poškození v hippocampu každé skupiny bylo provedeno barvení kresylovou violeťou (CV), jak jsme popsali dříve [69]. Stručně řečeno, acetát kresylfialové (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byl rozpuštěn v koncentraci 1,5{3}} % (w/v) v destilované vodě a ledová kyselina octová (0.28 % byl přidán do tohoto roztoku. Sekce byly obarveny a namontovány kanadským balzámem (Kanto, Tokio, Japonsko).

4.8. FJ B Barvení

Barvení FJ B bylo provedeno za účelem vyšetření neuronální degenerace (smrt nebo ztráta). Podle publikovaného postupu [34] byly připravené mozkové řezy namočené v 1% hydroxidu sodném, okamžitě převedeny do 0.06% manganistanu draselného a okamžitě zreagovány s 0,0004% Fluoro-Jade B (Histochem , Jefferson, AR, USA).

Řezy byly krátce omyty a umístěny na ohřívač sklíček (asi 50 ◦C) pro reakci s FJ B. Pro posouzení terapeutického účinku OXC proti tFI byly počty FJ B+buněk spočítány v oblasti CA1 podle metody publikované v [ 70].

Stručně řečeno, digitální snímky buněk FJ B+ byly zachyceny z pěti řezů na pískomila pomocí epifluorescenčního mikroskopu (Carl Zeiss) (Oberkochen, Německo) při vlnové délce 450–490 nm. Buňky byly spočítány ve 250 um2, které zahrnovaly SP, ve středu oblasti CA1 pomocí systému pro analýzu obrazu (Optimas 6.5) (CyberMetrics, Scottsdale, AZ, USA).

4.9. Imunohistochemie

Ke zkoumání změn v imunoreaktivitě NeuN, TRPV1 a TRPV4 v oblasti CA1 byla provedena obecná imunohistochemie. Stručně řečeno, podle publikované metody [34] byly připravené řezy mozku inkubovány s primárními protilátkami-myší anti-NeuN (ředěný, 1:1100) (Chemicon, Temecula, CA, USA), myší anti-TRPV1 (ředěný, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK) a králičí anti-TRPV4 (zředěný, 1:500) (Abcam, Cambridge, UK).

Poté byly tyto inkubované řezy inkubovány v odpovídajících sekundárních protilátkách (zředěných, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) a vyvinuty s použitím Vectastain ABC (zředěno, 1:250) (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA , USA). Nakonec tyto imunoreagované řezy měly barvu po vizualizaci 3,3'-diaminobenzidinem.

Počty NeuN+ buněk byly spočítány následovně. Digitální snímky NeuN+ buněk byly zachyceny z pěti řezů na pískomila pomocí světelného mikroskopu (AxioM1) (Carl Zeiss, Německo).

Buňky byly spočítány stejným způsobem jako počet FJ B+buněk. K vyhodnocení hustoty struktur TRPV1+ a TRPV4+ byly použity odpovídající oblasti v oblasti CA1 v pěti sekcích na zvíře. Snímky struktur TRPV1+ a TRPV4+byly pořízeny pomocí světelného mikroskopu AxioM1 (Carl Zeiss) (Německo).

Hustoty TRPV{{0}} a TRPV4+struktur byly vyhodnoceny jako relativní optická hustota (ROD). Za tímto účelem byly obrázky transformovány na střední úroveň šedi. ROD byla prezentována jako procento pomocí Adobe Photoshop (verze 8.0) a softwaru NIH Image J (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

4.10. Statistická analýza

Data jsme prezentovali jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism (verze 5.0) (GraphPadSoftware, La Jolla, CA, USA). Rozdíly v průměrech mezi experimentálními skupinami byly statisticky analyzovány dvoucestnou analýzou rozptylu (ANOVA) s post hocBonferroniho vícenásobným srovnávacím testem k objasnění rozdílů souvisejících s tFI mezi všemi skupinami. Statistická významnost byla uvažována při p < 0. 05.

Autorské příspěvky: Konceptualizace: M.-HW a T.-KL; Metodologie, J.-CL a DWK; Software, H.-IK a MCS; validace, JHA, IJK a JHP; Investigation, J.-CL, H.-IK a M.CS; Data Curation, JHC, IJK a JHP; Writing-Original Draft Preparation, H.-IK a J.-CL; Psaní-recenze a editace, M.-HW; Dohled, S.-SL; Správa projektu, M.-HW; Funding Acquisition, S.-SL a T.-KL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování: Tato práce byla podpořena organizací Brain Korea 21 (BK21) Fostering Outstanding Universities for Research (FOUR, 4220200913807) financovanou Korejskou národní výzkumnou nadací (NRF) a Programem základního vědeckého výzkumu prostřednictvím Korejské národní výzkumné nadace (NRF) financované ministerstvem školství (NRF-2020R1I1A1A01070897).

Prohlášení Institutional Review Board: Pískomilové byli chováni v Experimental Animal Center of Kangwon National University (Chuncheon, Korea). Pro tuto studii byl experimentální protokol schválen (č. schválení, KW-200113-1; datum schválení 18. února 2020) výborem Institutional AnimalCare and Use Committee.

Výzkumný protokol se držel pokynů navržených v „Aktuálních mezinárodních zákonech a politikách“ Příručky pro péči o laboratorní zvířata a jejich použití, kterou vydalo The National Academies Press (8. vydání, 2011).

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Poděkování: Autoři oceňují Hyun Sook Kim a Seung Uk Lee za jejich technickou pomoc v této studii.

Střet zájmů: Autoři prohlásili, že neexistuje žádný finanční střet zájmů.

Zkratky

CA1: podpole Cornu Ammonis 1; CNS, centrální nervový systém; CV, kresylová violeť; DG, gyrus dentatus;FJ B, Fluoro-Jade B; HyT, hypotermie; NeuN, neuronová jádra; OXC, oxkarbazepin; PAT, test pasivního vyhýbání se; ROD, relativní optická hustota; SMA, spontánní motorická aktivita; SO, stratum oriens;SP, stratum pyramidal; SR, stratum radiatum; tFI, přechodná ischemie předního mozku; TRPV1, vaniloidní potenciál transientreceptorového typu 1.

Reference

1. Busto, R.; Dietrich, WD; Globus, MY; Valdes, I.; Scheinberg, P.; Ginsberg, MD Malé rozdíly v intraischemické teplotě mozku kriticky určují rozsah ischemického neuronálního poškození. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1987, 7, 729-738. [CrossRef][PubMed]

2. Maher, J.; Hachinski, V. Hypotermie jako potenciální léčba cerebrální ischemie. Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 1993, 5,277-300.

3. Nurse, S.; Corbett, D. Neuroprotekce po několika dnech mírné, léky navozené hypotermie. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1996, 16,474-480. [CrossRef]

4. Fisher, M.; Feuerstein, G.; Howells, DW; Hurn, PD; Kent, TA; Savitz, SI; Lo, EH; Group, S. Aktualizace preklinických doporučení pro kulatý stůl akademického průmyslu pro léčbu cévní mozkové příhody. Mrtvice 2009, 40, 2244–2250. [CrossRef]

5. Liu, L.; Yenari, MA Terapeutická hypotermie: Neuroprotektivní mechanismy. Přední. Biosci. 2007, 12, 816–825. [CrossRef]

6. Lyden, PD; Krieger, D.; Yenari, M.; Dietrich, WD Terapeutická hypotermie pro akutní cévní mozkovou příhodu. Int. J. Mrtvice 2006, 1, 9–19. [CrossRef][PubMed]

7. Klassman, L. Terapeutická hypotermie u akutní cévní mozkové příhody. J. Neurosci. Zdravotní sestry. 2011, 43, 94–103. [CrossRef]

8. Groysman, LI; Emanuel, BA; Kim-Tenserová, MA; Sung, GY; Mack, WJ Terapeutická hypotermie u akutní ischemické cévní mozkové příhody. Neurosurg. Focus 2011, 30, E17. [CrossRef] [PubMed]

9. Schwab, S.; Georgiadis, D.; Berrouschot, J.; Schellinger, PD; Graffagnino, C.; Mayer, SA Proveditelnost a bezpečnost středně těžké hypotermie po masivním infarktu hemisféry. Mrtvice 2001, 32, 2033–2035. [CrossRef]

10. Katz, LM; Young, AS; Frank, JE; Wang, Y.; Park, K. Regulovaná hypotermie snižuje oxidační stres mozku po hypoxické ischemii. Brain Res. 2004, 1017, 85–91. [CrossRef]

11. Liu, K.; Khan, H.; Geng, X.; Zhang, J.; Ding, Y. Farmakologická hypotermie: Potenciál pro budoucí terapii mrtvice? Neurol. Res.2016, 38, 478–490. [CrossRef]

12. Ma, J.; Wang, Y.; Wang, Z.; Li, H.; Wang, Z.; Chen, G. Neuroprotektivní účinky lékem indukované terapeutické hypotermie u onemocnění centrálního nervového systému. Curr. Drogové cíle 2017, 18, 1392–1398. [CrossRef]

13. Calabresi, P.; Cupini, LM; Centonze, D.; Pisani, F.; Bernardi, G. Antiepileptika jako možná neuroprotektivní strategie mozkové ischémie. Ann. Neurol. 2003, 53, 693–702. [CrossRef]

14. Tanaka, T.; Litofsky, NS Antiepileptika u dětského traumatického poranění mozku. Expert Rev. Neurother. 2016, 16, 1229–1234.[CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com