Sirovodík zeslabuje renální I/R-indukovanou aktivaci zánětlivé odpovědi a apoptózy prostřednictvím regulace inhibice signální dráhy NLRP3 zprostředkované Nrf2
Mar 14, 2022
Abstraktní. Renální ischemické/reperfuzní (I/R) poškození může vést k akutnímuselhání ledvinopožděná funkce štěpu a rejekce štěpu. Oligomerizační doména vázající nukleotidy NOD-like receptor obsahující pyrin doménu 3 (NLRP3) zprostředkovaný zánět se podílí na rozvojiledvinovézranění. Nrf2 urychluje aktivaci signální dráhy NLRP3 a dále reguluje zánětlivou odpověď. Kromě toho plní sirovodík ochrannou roli vpoškození ledvin; podrobný základní mechanismus však zůstává špatně pochopen. Tato studie zkoumala, zda se dráhy Nrf2 a NLRP3 účastní regulace sirovodíkemledvinovéI/R-indukovaná aktivace zánětlivé odpovědi a apoptózy. Myši divokého typu a Nrf2-knockout (KO) podstoupily operaci k vyvoláníledvinovéI/R přes upnutí bilaterálníholedvinovépedikly. Celkem 20 mg/kg MCC950 (inhibitor NLRP3) bylo denně injikováno intraperitoneálně po dobu 14 dnů před operací.Renálnítkáň a krev byly odebrány myším modelu I/R, aby se analyzovaly hladiny exprese mRNA NLRP3 a Nrf2, hladiny exprese proteinu NLRP3, PYD a CARD, kaspázy-1, IL-1, Nrf2 a hemové oxygenázy 1, buněčná apoptóza, sekrece tumor nekrotizujícího faktoru‑, IL‑1 a IL‑6 cytokinů aledvinovéhistopatologie a funkce.RenálníI/R aktivoval signální dráhy NLRP3 a Nrf2. Naopak léčba MCC950 inhibovala aktivaci signální dráhy NLRP3 a zabránila indukci I/Rpoškození ledvin, uvolňování cytokinů a apoptóza vledvinovéI/R modely myší. Hydrosulfid sodný (NaHS) nejen zmírnil upregulaci hladin exprese proteinu NLRP3, ale také zmírnilpoškození ledvin,uvolňování cytokinů a buněčná apoptóza indukovaná renálním I/R u myší divokého typu, ale ne u myší Nrf2‑KO. NaHS zmírnil aktivaci zánětu NLRP3,poškození ledvin,zánětlivá odpověď a buněčná apoptóza prostřednictvím signální dráhy Nrf2 u myší s renálním I/R modelem.
CISTANCHE ZLEPŠÍ SELHÁNÍ LEDVIN/RENÁL
Úvod
Renální ischemie/reperfuze (I/R) je hlavní příčinou akutníchporanění ledvin(AKI), která se obvykle vyskytuje běhemledvinovéchirurgii a predisponuje jedince k závažné dysfunkci více orgánových systémů. I/R-indukovaná buněčná smrt a zánět uvnitřledvinovétkáň je spojena se složitými patofyziologickými procesy a podporuje pokles vfunkce ledvin,což vede k hromadění odpadních produktů metabolismu (1). Kromě ischemie vyvolanéledvinovépoškození tkáně, bylo také zjištěno, že reperfuze spouští komplexní patofyziologickou kaskádu, která zahrnuje nadměrné uvolňování volných radikálů a akumulaci zánětlivých buněk, následně podporuje zánět a dále zhoršuje lokální ischemii a poškození buněk (2).
Podrodiny nukleotidové vazebné domény a rodiny obsahující repetice bohaté na leucin hrají klíčovou roli ve vývoji zánětlivé odpovědi (3). Pyrinová doména rodiny NLR obsahuje 3 (NLRP3) inflamasom (dříve známý jako NACHT, LRR a domény PYD obsahující protein 3 a kryopyrin) je dosud nejcharakterizovanějším zánětem. Stále větší počet studií uvádí souvislost mezi NLRP3 arenal I/R. V AKI je zapojen NLRP3ledvinovéPoranění I/R (4,5). Například knockdown NLRP3 a jeho adaptéru PYD a domény obsahující CARD (ASC) zmírňuje I/R indukovanéledvinovédysfunkce a nadměrný příliv neutrofilů doledvinová tkáň(6). Kromě toho, knock-down NLRP3 a/nebo kaspázy-1 chrání myši před AKI indukovanou sepsí nebo lipopolysacharidem (7,8). Tato zjištění naznačují, že inflammasom NLPR3 může hrát klíčovou roli v patogenezipoškození ledvin.
Nrf2 je endogenní antioxidační gen umístěný v cytosolu, který se kombinuje s Kelch-like ECH-asociovaným proteinem 1 (Keap). Po aktivaci se Nrf2 uvolní z Keep a přemístí se do jádra, kde se následně váže na prvky antioxidační odezvy, aby zahájil transkripci svých downstream antioxidačních a cytoprotektivních cílových genů, jako je superoxiddismutáza, kataláza, glutathionperoxidáza, glutathion-S-transferáza. isozymy, katalytické a modifikační podjednotky ‑glutamylcystein ligázy a NADP(H): Chinonoxidoreduktáza (9). Již dříve bylo hlášeno, že Nrf2 je spojen s AKI vyvolaným environmentální inzultací, ischemií nebo xenobiotiky (10). Kromě jeho uváděné ochranné role při poškození tkáně předchozí studie také prokázaly, že nadměrná exprese Nrf2 potlačuje aktivitu zánětu NLRP3 a zlepšuje poškození tkáně (11–13). Nicméně základní mechanismus signální dráhy Nrf2 a jeho účinek na aktivaci zánětu NLRP3 vledvinovéI/R zůstává neznámé.Sirovodík (H2S) získal uznání pro svou schopnost regulovat homeostázu savců a základní buněčné procesy, jako je autofagie (14). Řada studií uvádí, že H2S má ochrannou roli proti apoptóze, oxidativnímu stresu a zánětupoškození ledvin(15–20). Nicméně základní ochranný mechanismus H2S vpoškození ledvinindukovaný I/R zůstává neznámý. Proto tato studie zkoumala hladiny exprese NLRP3 a jeho adaptéru, ASC, u myší s renálním I/R modelem a následně stanovila účinek Nrf2 na expresi NLRP3. Cílem této studie bylo také zjistit, zda H2S chráníledvinová tkáňprotipoškození ledvin,zánětu a apoptózy prostřednictvím inhibice NLRP3 zprostředkované Nrf2.
klíčová slova:renální ischemické/reperfuzní poškození, Nrf2, sirovodík, apoptóza, poškození ledvin; selhání ledvin
CISTANCHE ZLEPŠÍ ONEMOCNĚNÍ LEDVIN/RENÁL
Materiály a metody
Stanovení I/R modelu ledvin a léčebných skupin.Celkem 24 samců myší divokého typu (váha 20–25 g; věk 6–8 týdnů) bylo získáno z Centra laboratorních zvířat Akademie vojenských lékařských věd (Peking, Čína). Kromě toho bylo od společnosti Junke Biological Co., Ltd. získáno devět myších samců Nrf2-knockout (KO) (hmotnost 20–25 g; věk 6–8 týdnů). Všechny protokoly pro zvířata byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a použití Všeobecná nemocnice lékařské univerzity v Tianjinu (číslo schválení IRB2020‑DW‑04; Tianjin, Čína) a bylo vynaloženo veškeré úsilí na minimalizaci utrpení zvířat a počtu použitých zvířat. Myši byly aklimatizovány na prostředí po dobu 3 dnů před experimentem při 22 °C se 40-60procentní vlhkostí, 12-hodinovým cyklem světlo/tma a volným přístupem k vodě a krmivu pro hlodavce. Poté, co byly myši anestetizovány intraperitoneálním (ip) 50 mg/kg pentobarbitalu sodného, bilaterálníledvinovépedikly byly ligovány po dobu 30 minut pomocí svorek pro mikroaneuryzma. Následně byly mikroaneuryzmatické svorky odstraněny. V kontrolní skupině byla operace provedena stejným postupem; nicméně,ledvinovépedikly nebyly podvázány. Po operaci byl použit 0,9% roztok chloridu sodného, aby se myši zotavily. Myši byly poté usmrceny po reperfuzi po dobu 24 hodin. Celkem 24 myší divokého typu bylo náhodně rozděleno do následujících šesti skupin: i) kontrolní (Con) skupina (n=9); ii) I/R skupina (n=9); iii) I/R plus skupina MCC950 (n=3); a iv) I/R plus skupina NaHS (n=3). Celkem devět myší Nrf2‑KO bylo náhodně rozděleno do následujících tří skupin: i) skupina Con (n=3); ii) I/R skupina (n=3); a iii) I/R plus skupina NaHS (n=3).
Podle předchozích výzkumů a předběžných experimentů (21,22) bylo 20 mg/kg MCC950 (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) denně injikováno (ip) po dobu 14 dnů před operací do I/R plus MCC950 skupina. Celkem 50 umol/kg hydrosulfidu sodného [NaHS; ip; zředěný v normálním (0,9 procenta) fyziologickém roztoku; Sigma-Aldrich; Merck KGaA] byl injikován před operací ve skupině I/R plus NaHS. Jakmile byly všechny experimentální postupy dokončeny, byly myši usmrceny cervikální dislokací a tkáň a krev byly odebrány pro následnou analýzu.
Western blotting. Tkáň ledvinbyla odebrána z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfuze pro analýzu hladin exprese proteinu. Stručně, celkový a nukleový protein byly extrahovány pomocí RIPA pufru (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy BCA Protein Assay kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celkem 40 µg proteinu na dráhu bylo separováno pomocí 10% SDS-PAGE a přeneseno na polyvinylidendifluoridové membrány, poté blokováno 5% mlékem po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. Membrány byly následně inkubovány s následujícími primárními protilátkami přes noc při 4 °C: Anti-NLRP3 (1:500; kat. č. ab214185; Abcam), anti-ASC (1:200; kat. č. sc-514414; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-kaspáza-1 (1:200; kat. č. sc-56036; Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-IL-1 (1:1,000; kat. . č. ab200478; Abcam), anti-Nrf2 (1:1,000; kat. č. ab137550; Abcam), anti-heme oxygenáza (HO)‑1 (1:2,000 ; kat. č. ab68477; Abcam), anti‑ ‑aktin (1:2,000; kat. č. ab8227; Abcam) a anti‑histon H3 (1:2,000; kat. č. ab176842; Abcam). Po inkubaci primární protilátky byly membrány inkubovány s odpovídajícími sekundárními protilátkami konjugovanými s HRP (1:5, 000; kat. č. ab6721 a ab6728; obě Abcam) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Proteinové pásy byly vizualizovány pomocí vylepšené chemiluminiscenční soupravy (Thermo Fisher Scientific, Inc.) pomocí systému Bio-Imaging (Bio-Rad Laboratories, Inc.) a semikvantifikovány pomocí softwaru Quantity One (V4.6) (Bio-Rad Laboratories , Inc.). Hladiny proteinové exprese byly normalizovány na ‑aktin pro cytoplazmatický protein nebo histon pro nukleový protein.
Reverzní transkripce-kvantitativní(RT-q)PCR.Tkáň ledvinbyla odebrána z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfuze pro analýzu úrovní exprese mRNA. Stručně, celková RNA byla extrahována z tkáně pomocí činidla TRIzol® (kat. č. 15596026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celková RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí soupravy RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (kat. č. K1621; Thermo Scientific™; Thermo Fisher Scientific, Inc.) podle protokolu výrobce. qPCR byla následně provedena pomocí SYBR PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Inc.) na systému 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Podmínky termocyklování byly následující: Denaturace při 95 °C po dobu 5 minut; 40 cyklů při 95 °C po dobu 15 sekund; a prodloužení při 60˚C po dobu 20 sekund. Genově specifické sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce I. Relativní úrovně exprese cílových genů byly vypočteny pomocí metody 2‑ΔACq (23) a normalizovány na úrovně exprese GAPDH.
Imunohistochemie (IHC). Tkáň ledvinbyla odebrána z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfuze pro stanovení hladin exprese NLRP3 a Nrf2. Krátce,ledvinatkáň byla fixována při teplotě místnosti po dobu 48 hodin v 10% formalínu, zalita v parafínu a nařezána na 5 um řezy. Řezy byly následně blokovány 5% mlékem při 37˚C po dobu 30 minut a inkubovány s anti-NLRP3 (1:100; kat. č. ab214185; Abcam) nebo anti-Nrf2 (1:200; kat. č. ab137550; Abcam) primární protilátky přes noc. Po inkubaci primární protilátky byly řezy inkubovány s HRP-značenou anti-králičí sekundární protilátkou (1:200; kat. č. ab214880; Abcam) při 37 °C po dobu 30 minut, vyvinutou pomocí roztoku diaminobenzidinu pro<3 min="" and="" counterstained="" with="" 0.5%="" hematoxylin="" for="" 3="" min="" at="" room="" temperature.="" a="" light="" microscope="" was="" used="" to="" visualize="" ihc="" staining="" (magnification,="" x200;="" biorevo="" bz‑9000;="" keyence="">
Test funkce ledvin. Po centrifugaci při 3,000 xg po dobu 10 minut při teplotě 4 °C bylo odebráno celkem 2-3 ml krve od myší s I/R modelem po 24hodinové reperfuzi. K analýze bylo získáno sérumfunkce ledvinprostřednictvím ELISA ke stanovení hladin kreatininu (kat. č. C011; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) a dusíku močoviny v krvi (BUN; kat. č. C013; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute), podle pokynů výrobce.Poranění ledvinhladiny molekuly-1 (KIM-1) v séru byly měřeny metodou ELISA (kat. č. EK0880; Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd.) podle pokynů výrobce.
Barvení hematoxylinem a eosinem.Tkáň ledvinbyla odebrána z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfuze k vyhodnoceníledvinovéhistopatologické změny. Tkáň byla fixována při pokojové teplotě po dobu 48 hodin v 10 procentním formalínu a poté uložena do parafínu. Řezy zalité v parafínu byly nařezány na 5 µm silné řezy a obarveny 0,5% hematoxylinem po dobu 5 minut a eosinem po dobu 3 minut při pokojové teplotě (25˚C). Přítomnost krvácení, tubulární buněčné nekrózy, tubulární dilatace a tvorba cytoplazmatických vakuol ve tkáni byla hodnocena následovně: 0, normálníledviny;1, minimální poškození; 2, střední poškození; a 3, vážné poškození (24).Poranění ledvinskóre bylo vypočítáno naslepo dvěma výzkumníky pod světelným mikroskopem (zvětšení x 200; Biorevo BZ‑9000; Keyence Corporation).
ELISA analýza hladin TNF‑, IL‑1 a IL‑6. Krev byla odebrána (1 ml) myším modelu I/R po 24 hodinách reperfuze. Sérum bylo získáno centrifugací při 3,000 xg po dobu 10 minut při 4˚C. Sérové hladiny TNF‑ (kat. č. MTA00b), IL-1 (kat. č. MLB00C) a IL-6 (kat. č. M6000B) byly analyzovány pomocí komerční soupravy ELISA (R&D Systems, Inc.), podle protokolu výrobce na čtečce mikrodestiček (kat. č. CA94089; Molecular Devices, LLC).
CISTANCHE ZLEPŠÍ INFEKCI LEDVIN/RENÁL
Barvení TUNEL.Tkáň ledvinbyla odebrána z I/R modelových myší po 24 hodinách reperfuze pro vyhodnocení buněčné apoptózy pomocí barvení TUNEL. Stručně, tkáň byla fixována při pokojové teplotě po dobu 48 hodin v 10% formalínu, zalita v parafínu a nařezána na 5 µm silné řezy. Řezy byly inkubovány s činidlem TUNEL ve zvlhčené komoře při 37 °C po dobu 60 minut ve tmě (Roche Diagnostics) a obarveny DAPI po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Poté bylo náhodně vybráno 10 polí mikroskopu s vysokým výkonem a pozorováno v každém řezu fluorescenčním mikroskopem (zvětšení x 10).Statistická analýza. Data jsou uvedena jako průměr ± SD ze tří experimentů a byla analyzována pomocí GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.). Statistické rozdíly mezi dvěma skupinami byly analyzovány pomocí párového Studentova t-testu. Statistické rozdíly mezi více než třemi skupinami byly analyzovány pomocí jednocestné ANOVA následované post hoc Tukeyho testem vícenásobného srovnání. Všechna data byla normálně distribuována a měla stejný rozptyl. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledek
Léčba MCC950 zabraňuje následné aktivaci signalizace NLRP3 indukované I/Rpoškození ledvinu myší. Inflammasomová dráha NLRP3 je aktivována a hraje klíčovou roliporanění ledvin(25,26). Předchozí studie také uvedla, že signalizace NLRP3 je aktivována v renální tkáni myší 24 hodin po reperfuzi (4). Proto bylo jako současný časový bod hodnocení vybráno 24 hodin po reperfuzi. Hladiny exprese proteinu NLRP3 byly upregulovány poškozením ledvin I/R ve skupině I/R ve srovnání s kontrolní (Con) skupinou (obr. 1A a B). Podobný trend byl pozorován u úrovní exprese mRNA NLRP3 (obr. 1C). Kromě toho se počet buněk pozitivních na NLRP3 zvýšil ve skupině I/R ve srovnání se skupinou Con, jak bylo určeno barvením IHC (obr. 1D a E).
Aby se určil základní mechanismus aktivace zánětu NLRP3 a účinek na downstream signální dráhu po poškození ledvin I/R, byly myši léčeny inhibitorem NLRP3 MCC950. Výsledky Western blottingu prokázaly, že I/R upreguloval hladiny proteinové exprese NLRP3 a jeho adaptéru ASC a podpořil zrání z pro-kaspázy-1 na kaspázu-1 a pro-IL-1 na IL-1 ve skupině I/R ve srovnání se skupinou I/R. Skupina Con (obr. 2A‑E). Tyto výsledky ukázaly, že renální I/R může indukovat aktivaci inflamasomové dráhy NLRP3 a léčba MCC950 může downregulovat hladiny exprese NLRP3, ASC, kaspázy-1 a IL-1 po poškození ledvin I/R.
Účinek zánětu NLRP3 napoškození ledvinzánětu a apoptózy u myší s renálním I/R modelem. V následujících situacích
K určení účinku NLRP3 na poškození ledvin byly I/R modelové myši léčeny inhibitorem NLRP3 MCC950. Myši s I/R modelem ledvin vykazovaly významně zvýšené hladiny BUN, sérového kreatininu a KIM‑1, což je biomarker renálního poškození (obr. 3A‑C), což ukazuje na úspěšnou indukci renálního I/R poškození. Histologické vyšetření renální tkáně z myší I/R modelu odhalilo zvýšené histologické skóre, které bylo prokázáno závažným tubulárním otokem epitelu, tubulární dilatací a intersticiálním edémem, vakuolární degenerací a ztrátou kartáčkového lemu, což naznačovalo, že renální I/R může podporovat významné poškození renální tkáně a zvýšené histologické skóre (obr. 3D a E). Inhibice NLRP3 léčbou MCC950 významně snížila I/R-indukované zvýšení hladin BUN, kreatininu a KIM-1 a snížilo histologické skóre, přičemž renální tkáň vykazovala méně vážně poraněných tubulů (obr. 3A-E).
Kromě toho byly hladiny zánětlivých faktorů a apoptotických buněk po podání MCC950 analyzovány u myší s renálním I/R modelem. Indikátory zánětu, včetně TNF‑, IL‑1 a IL‑6, byly významně upregulovány ve skupině I/R ve srovnání se skupinou Con (obr. 3F‑H). Navíc ve srovnání se skupinou Con bylo procento apoptotických buněk významně zvýšeno 24 hodin po reperfuzi ve skupině I/R (obr. 3I a J). Ve srovnání se skupinou I/R byly sekreční hladiny cytokinů, TNF‑, IL‑1 a IL‑6 a procento apoptotických buněk sníženy léčbou MCC950 ve skupině I/R plus MCC950 (obr. 3F‑J ). Tyto výsledky ukázaly, že inhibice zánětu NLRP3 může zabránit uvolňování zánětlivých faktorů a apoptóze renální tkáně indukované I/R.
Nrf2 je nezbytný pro renální I/R-indukovanou regulaci aktivity zánětu NLRP3.Předchozí studie odhalila, že Nrf2 je aktivován a hladiny exprese cílových genů Nrf2 jsou upreguloványledvinová tkáňpo I/R poranění ledvin (27). Podobná zjištění byla získána i v tomto výzkumu. Hladiny exprese nukleových kyselin, celkového proteinu a mRNA Nrf2 byly analyzovány 24 hodin po poškození ledvin I/R. Výsledky ukázaly, že ve srovnání se skupinou Con byly hladiny exprese nukleových kyselin, celkového proteinu a mRNA Nrf2 upregulovány ve skupině I/R (obr. 4A-D). Kromě toho analýza IHC zjistila, že hladiny exprese Nrf2 v renální tkáni byly zvýšeny, což bylo prokázáno zvýšeným počtem Nrf2-pozitivních
buňky pozorované ve skupině I/R (obr. 4E a F). Tato data naznačují, že aktivace signální dráhy Nrf2 může iniciovat ochrannou reakci u myší s modelem ledvinového I/R. Aby bylo možné ověřit účinek Nrf2 na dráhu zánětu NLRP3 v renálním I/R, byly v následujících experimentech použity myši Nrf2‑KO. Hladiny proteinové exprese Nrf2 a jeho cílového genu, HO‑1, byly významně sníženy po renálním I/R u KO myší ve srovnání s myší divokého typu (obr. 5A‑C). Naopak ve srovnání se skupinou I/R divokého typu byly hladiny exprese NLRP3 a jeho adaptéru, ASC, kaspázy-1 a IL-1 upregulovány ve skupině I/R KO (obr. 5A a D-G). Tato data naznačovala, že renální I/R může indukovat aktivaci zánětu NLRP3 u myší Nrf2‑KO.
NaHS zmírňuje I/R-indukovanou upregulaci hladin exprese proteinu NLRP3 u myší divokého typu, ale ne u myší Nrf2‑KO. Bylo prokázáno, že NaHS má vliv na expresi Nrf2 a aktivaci zánětu NLRP3 u různých modelů onemocnění (28–30). Tato studie zkoumala, zda se účinek NaHS na aktivaci dráhy NLRP3 vyskytuje prostřednictvím signální dráhy Nrf2 analýzou úrovní expreseproteinů spojených s zánětem Nrf2 a NLRP3 u myší divokého typu a myší KO.U myší divokého typu ve srovnání se skupinou Con byly hladiny exprese Nrf2, NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 upregulovány poškozením I/R ledvin. Kromě toho léčba NaHS dále zvýšila expresi Nrf2 a snížila hladiny exprese NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 ve skupině I/R plus NaHS ve srovnání se skupinou I/R (obr. 6A-E). U myší Nrf2‑KO nebyly pozorovány žádné statisticky významné rozdíly v hladinách exprese Nrf2, NLRP3, kaspázy‑1 a IL‑1 mezi skupinami I/R a I/R plus NaHS (obr. 6A‑E). Ve skupině I/R plus NaHS byly hladiny exprese Nrf2 významně sníženy, zatímco hladiny exprese NLRP3, kaspázy-1 a IL-1 byly významně zvýšeny u myší Nrf2-KO ve srovnání s myšmi divokého typu. Tyto výsledky naznačují, že NaHS může snížit aktivaci zánětu NLRP3 prostřednictvím signální dráhy Nrf2 při poškození ledvin I/R
NaHS zmírňuje poškození ledvin, zánět a apoptózu prostřednictvím signální dráhy Nrf2 u myší s renálním I/R modelem. NaHS hraje důležitou roli při poškození ledvin u AKI, I/R a dalších modelů onemocnění (31). NaHS zmírnil renální I/R-indukované histopatologické poškození, které bylo prokázáno sníženým otokem tubulárního epitelu, tubulární dilatací a intersticiálním edémem aledvinahistologické skóre ve skupině I/R plus NaHS ve srovnání se skupinou I/R u myší divokého typu (obr. 7A a B). Indikátory renálních funkcí, včetně kreatininu, BUN a KIM-1, byly také sníženy léčbou NaHS ve skupině I/R plus NaHS ve srovnání se skupinou I/R u divokého typu
myši (obr. 7C‑E). U myší Nrf2‑KO však NaHS nebyl schopen zvýšení snížitledvinahistologické skóre a hladiny ukazatelů renálních funkcí indukovaných I/R ledvin. Kromě toho procento apoptotických buněk a uvolňování cytokinů, TNF-, IL-1 a IL-6, byly všechny sníženy po léčbě NaHS v I/R plus NaHSskupina ve srovnání se skupinou I/R u myší divokého typu (obr. 7F‑J). NaHS však nebyl schopen uplatnit ochranný účinek proti apoptóze a nadměrnému uvolňování zánětlivých faktorů po reperfuzi renální tkáně ve skupině I/R plus NaHS myší Nrf2‑KO ve srovnání s myšmi divokého typu I/R plus NaHS (obr. 7F-J). Tyto výsledky naznačují, že NaHS může zmírnit poškození ledvin, zánět a apoptózu u myší divokého typu I/R ledvin, ale ne u myší Nrf2‑KO.
Diskuse
Zánět je klíčovým patogenním procesem AKI indukovaným I/R (4). Inflammasom NLRP3 a signální dráha Nrf2 se účastní regulace zánětu vporanění ledvin(32). Tato studie zjistila, že AKI indukovaný I/R aktivoval zánět NLRP3 a jeho adaptér, ASC, podpořil zrání pro-kaspázy-1 a pro-IL-1 a urychlil nadměrné uvolňování cytokinů a apoptózu, která vyvrcholila těžkým renální dysfunkce. Inhibice zánětu NLRP3 léčbou MCC950 zlepšila renální funkci, hladiny zánětu a apoptózy v renální tkáni. Renální I/R kromě aktivace NLRP3 aktivovala také signální dráhu Nrf2. Absence Nrf2 u myší Nrf2‑KO však vedla k další upregulaci inflammasomu NLRP3 a jeho adaptéru. Bylo zjištěno, že léčba NaHS zmírňuje aktivitu zánětu NLRP3 prostřednictvím signální dráhy Nrf2. Navíc poškození ledvin, zánět a apoptóza byly sníženy léčbou NaHS prostřednictvím inhibice aktivace zánětu NLRP3 zprostředkované Nrf2.
Renální I/R poškození je důležitým klinickým problémem a primární příčinou AKI, což vede ke zvýšenému riziku rozvoje chronickénemoc ledvin(33). Zánět je důležitým patologickým rysem ischemického poškození a vyskytuje se jako důsledek aktivace imunitních buněk prostřednictvím rozpoznání molekulárních vzorců souvisejících s patogenem a poškozením (34). Kromě toho bylo dříve hlášeno, že inflammasom NLRP3 hraje roli v řaděonemocnění ledvinregulací zánětu, pyroptózy, apoptózy a fibrózy (35). Inflammasom NLRP3 je proteinový komplex obsahující NLRP3, jeho adaptorový protein, ASC a kaspázu-1. Kaspáza-1 štěpí pro-IL-1 a pro-IL-18 na zralé, aktivované sekreční formy. Renální poškození vyvolané různými patologickými stavy, včetně ischemie (33), aktivuje inflammasomový komplex, upreguluje expresi NLRP3 a podporuje následné zrání pro-IL-1 (36). NLRP3 KO využívající malou interferující RNA u myší nebo renálních tubulárních epiteliálních buněk má ochranný účinek proti poškození ledvinové tkáně vyvolanému ischemií nebo poškozením buněk v nepřítomnosti glukózy (37). Současné výsledky ukázaly, že renální I/R indukovala aktivaci zánětu NLRP3, zatímco inhibice NLRP3 pomocí MCC950 významně snížila hladiny exprese NLRP3 a ASC a zrání pro-kaspázy-1 a pro-IL-1 v renálním I/R model zranění. Kromě toho inhibice NLRP3 pomocí MCC950 zlepšila renální dysfunkci a snížila histopatologické poškození a skóre, nadměrné uvolňování cytokinů a počet apoptotických buněk. Tato data naznačují, že aktivace NLRP3 může hrát klíčovou roli při poškození ledvin a inhibice NLRP3 může mít ochranný účinek proti poškození tkáně a dysfunkci vyvolané I/R ledvin.
Předchozí studie uváděly, že Nrf2 se účastní zánětlivé odpovědi (10‑12). Kromě toho hraje Nrf2 klíčovou protizánětlivou, antioxidační nebo antiapoptotickou roli u ischemických stavů. Aktivace signální dráhy Nrf2/antioxidant response element zmírňuje zánět a apoptózu v renální tkáni myší indukovaných cyklofosfamidem (38). Další studie prokázala, že aktivace Nrf2 sulforafanem inhibuje aktivitu signální dráhy NF‑κB, a tím zmírňuje zánět v dystrofické svalové tkáni (39). Kromě toho knockdown Nrf2 podporuje aktivaci zánětu NLRP3 a vede k aktivaci IL‑1 v modelu ischemie (11). Tato data podpořila zjištění, že renální I/R může indukovat signální dráhu Nrf2 a expresi jejích downstream cílových genů, jako je HO‑1. Myši Nrf2‑KO dále podporovaly aktivaci zánětu NLRP3, což naznačovalo, že hladiny exprese NLRP3, ASC, kaspázy-1 a IL-1 byly v renálním I/R modelu zvýšeny. Tyto výsledky naznačují, že Nrf2 má inhibiční účinek na aktivaci zánětu NLRP3 při poškození ledvin I/R.
Předchozí výzkum uvedl, želedvinaprodukuje H2S (40). Kromě toho H2S zvyšuje průtok krve ledvinami a podporuje funkci clearanceledvina, jak bylo prokázáno zvýšenou rychlostí glomerulární filtrace (41). Navíc H2S nejen zmírňuje zánět a oxidační stres, ale také hraje klíčovou roli při regulaci endoteliální dysfunkce a hypertenze (28). H2S se podílí na regulaci onemocnění souvisejících s ledvinami, jako je poranění I/R a obstrukční a diabetická nefropatie [42], avšak základní mechanismy zůstávají nedostatečně pochopeny. NHS byl ve výzkumu použit jako exogenní dárce H2S (43). V této studii byla dodávka H2S ve formě NaHS. Současné výsledky ukázaly, že NaHS zlepšilo poškození tkáně,ledvinadysfunkce, nadměrné uvolňování cytokinů a apoptóza vyvolaná I/R ledvinami. Již dříve bylo uvedeno, že NaHS zabraňuje mikrogliální aktivaci a zánětu vyvolanému poraněním nervů prostřednictvím regulace signální dráhy Nrf2 (44). V souladu s hypotézou, že NaHS reguluje zánět prostřednictvím signální dráhy Nrf2, tyto výsledky prokázaly, že NaHS upreguloval hladiny exprese Nrf2 a inhiboval hladiny exprese NLRP3 u myší s renálním I/R modelem. Kromě toho Nrf2 KO zrušil regulační účinky NaHS na Nrf2 a NLRP3 inflammasom. Tato studie také zkoumala roli Nrf2 na poškození a funkci ledvin po léčbě NaHS; inhibice Nrf2 nejen částečně zvrátila ochranný účinek NaHS naporanění ledvina dysfunkce, ale také zvrátily inhibiční účinek NaHS na zánětlivou odpověď a apoptózu po I/R ledvin. Tyto výsledky naznačují, že Nrf2 může být vyžadován pro ochranný účinek NaHS na AKI indukovaný I/R a NaHS může uplatňovat svou ochrannou roli proti poškození tkáně prostřednictvím inhibice zánětu NLPR3 zprostředkované Nrf2. Závěrem lze říci, že I/R-indukované poškození ledvin aktivovalo NLRP3 inflammasom a signální dráhu Nrf2 a inhibice NLRP3 inflamasomu chránila před poškozením ledvin. Nrf2 negativně reguloval aktivaci zánětu NLRP3 a zmírnil NaHSporanění ledvina dysfunkce, apoptóza a zánětlivá odpověď prostřednictvím inhibice zánětu NLRP3 zprostředkované Nrf2. Tyto výsledky poskytují nový pohled na potenciální budoucí cíl pro léčbu renálního ischemického poškození.