Jak exprimovat lidský defensin v lidských ledvinách a močových cestách 5

Další informace:{0}}

John David Spencer a kol

Abstraktní

Pozadí:Mechanismy, které udržují sterilitu v močovém traktu, nejsou zcela pochopeny. Nedávné studie ukázaly důležitost antimikrobiálních peptidů (AMP) při ochraně močového traktu před infekcí. Zde charakterizujeme expresi a význam AMP lidského alfa-defensinu 5 (HD5) u člověka.ledvinaa močového traktu u normálních a infikovaných subjektů.

Metodika/hlavní zjištění:Použití RNA izolované z člověkaledvina, močovodu a tkáně močového měchýře jsme provedli kvantitativní PCR v reálném čase, abychom ukázali, že DEFA5, gen kódující HD5, je konstitutivně exprimován v celém močovém traktu. Při pyelonefritidě se exprese DEFA5 významně zvýšila vledvina. Pomocí imunoblotové analýzy se produkce HD5 také zvýšila s pyelonefritidou. Imunobarvení lokalizovalo HD5 do urotelu močového měchýře a močovodu. V ledvinách byl HD5 primárně produkován v distálním nefronu a sběrných tubulech. Pomocí testů immunoblot a ELISA nebyl HD5 rutinně detekován ve vzorcích neinfikované lidské moči, zatímco produkce HD5 v moči se zvýšila s infekcí močových cest E.coli.

Závěry/Význam:DEFA5 je exprimován v močovém traktu u neinfikovaných subjektů. Konkrétně je HD5 exprimován v celém urotelu dolních močových cest a ve sběrných tubulechledvina. S infekcí se exprese HD5 zvyšuje vledvinaa hladiny se stanou detekovatelné v moči. Pokud je nám známo, naše zjištění představují první, kdo kvantifikuje expresi a produkci HD5 v lidských ledvinách. Navíc se jedná o první zprávu, která detekovala přítomnost HD5 v infikovaných vzorcích moči. Naše výsledky naznačují, že HD5 může mít důležitou roli při udržování sterility močových cest.

Cistanche UK pro onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Úvod

Močové cesty, kromě uretrálního meatu, jsou obvykle sterilní i přes blízkost fekální flóry. Přesné mechanismy, kterými si močové cesty udržují sterilitu, nejsou dobře známy. Mezi navrhované mechanismy přispívající k obraně močového traktu patří průtok moči, změny pH a osmolarity moči, pravidelné vyprazdňování močového měchýře, chemické obranné složky uroepitelu a epiteliální odlupování/příliv efektorových imunitních buněk s bakteriální stimulací [1]. Kromě toho se nedávno ukázalo, že antimikrobiální peptidy (AMP) hrají důležitou roli při udržování sterility močových cest [2]. AMP, která slouží jako přírodní antibiotika produkovaná téměř všemi organismy, jsou všudypřítomnou složkou přirozeného imunitního systému. AMP jsou kationtové molekuly exprimované fagocytujícími bílými krvinkami a epiteliálními buňkami. U lidí a jiných savců jsou defensiny hlavní rodinou AMP. Defensiny mají typicky širokospektrální antimikrobiální aktivitu proti grampozitivním a gramnegativním bakteriím, virům, houbám a prvokům [2,3]. Defensiny jsou zpočátku syntetizovány jako preproproteiny a procházejí zpracováním, aby se staly zralými, biologicky aktivními peptidy [4]. U lidí jsou defensiny klasifikovány do jedné ze dvou rodin v závislosti na jejich vzoru disulfidových můstků – alfa-defensiny nebo beta-defensiny [5].

V močovém traktu jsou beta-defensiny široce exprimovány v celém uroepitelu. Epiteliální buňky vystýlajícíledvinaHenleova klička, distální tubulus a sběrný kanálek ​​konstitutivně exprimují lidský beta-defensin 1 (hBD1). Přestože hladiny hBD1 v moči jsou nedostatečné k zabití napadajících bakterií, hBD1 poskytuje rychle působící antimikrobiální povlak tubulárních lumen a zabraňuje infekci tím, že inhibuje připojení bakterií k urotelu [6]. Nedávné studie ukazují, že redoxní stav hBD1 významně ovlivňuje antimikrobiální účinnost, takže redukovaný peptid je mnohem účinnější než oxidovaná forma s disulfidovou vazbou [7]. Význam tohoto na uroteliálním povrchu nebyl stanoven. Další defensin, lidský beta-defensin 2 (hBD2) není konstitutivně exprimován ve zdravé tkáni ledvin; exprese hBD2 je však indukována infekcí [8].

Na rozdíl od beta-defensinů není úloha alfa-defensinů odvozených z epitelu v močovém traktu dobře popsána. Exprese a funkce alfa-defensinů HD5 a HD6 byly většinou hlášeny v tenkém střevě, kde jsou vylučovány Panethcells do střevních krypt a přispívají k rovnováze střevní mikrobioty [9]. HD5 byl také lokalizován v mužském a ženském genitálním traktu, přičemž důkazy naznačují, že je indukovatelný a důležitý při eradikaci infekce [10,11,12]. HD5 v moči byl detekován u pacientů, kteří podstoupili rekonstrukci ileálního neoblažníku a diverzi ileálního konduitu, přičemž zdroj produkce HD5 byl primárně připsán ileálním Panethově buňkám [13,14]. HD5 má antibakteriální aktivitu proti běžným uropatogenním grampozitivním bakteriím a gramnegativním bakteriím [15]. HD5 má také antimikrobiální aktivitu proti uropatogenním virům, jako je adenovirus a virus BK [16,17,18]. V této studii poskytujeme počáteční popis a kvantifikaci exprese HD5 u člověkaledvinaa dále definovat jeho expresi v dolních močových cestách během sterility a infekce.

Výsledek

DEFA5 mRNA je konstitutivně exprimována v lidském močovém měchýři, močovodu a ledvinách

Kvantitativní PCR v reálném čase ukazuje, že všechny testované vzorky močového měchýře, močovodu a ledvin bez infekce konstitutivně exprimovaly DEFA5. Exprese DEFA5 byla významně vyšší v dolních močových cestách než v horních močových cestách (p= 0,014). V močovém měchýři (n=4) byla průměrná exprese DEFA5 4 656 637 transkriptů na 10 ng RNA a v močovodu (n=4) byla průměrná exprese DEFA5 4 1126 170 transkriptů na 10 ncRNA (obrázek 1A) . V ledvině (n=6) byla průměrná exprese DEFA5 2,9376274 transkriptů na 10 ng RNA. Exprese DEFA5 byla analyzována samostatně v kůře ledvin, dřeni a pánvi. Exprese DEFA5 se významně nelišila podle oblasti ledvin (p= 0.45).

Exprese DEFA5 a exprese peptidu HD5 se zvyšuje s pyelonefritidou

Kvantitativní analýza PCR v reálném čase prováděná na tkáních ledvin s pyelonefritidou prokázala významné zvýšení exprese DEFA5 ve srovnání s neinfikovanými tkáněmi ledvin. Při pyelonefritidě (n= 6) se průměrná exprese DEFA5 zvýšila na 7 82961 052 transkriptů na 10 ng RNA (p= 0,019) (obrázek 2A).

Abychom dále vyhodnotili toto zvýšení exprese s pyelonefritidou, provedli jsme imunoblotovou analýzu na stejné ledvinové tkáni použité pro analýzu PCR v reálném čase, abychom vyhodnotili souběžné zvýšení produkce peptidu HD5 (obrázek 2B, střední panel). Imunoblotová analýza s použitím polyklonálních antisér HD5 prokázala významně vyšší produkci peptidu HD5 v ledvinových tkáních s pyelonefritidou (n=6) ve srovnání s neinfikovanými ledvinovými tkáněmi (n=6). Neinfikované ledvinové tkáně vyjadřovaly 300625 ng HD5/gram hmotnosti vlhké tkáně, zatímco ledvinová tkáň s pyelonefritidou vyjadřovala 600621 ng HD5/gram hmotnosti vlhké tkáně (p,0,0001). Bloty byly znovu sondovány pomocí GAPDH, aby sloužily jako kontrola nanášení (obrázek 2B, střední panel) a bylo také provedeno barvení stříbrem, aby se potvrdilo stejné zatížení proteinem (obrázek 2B, horní panel).

HD5 peptid je produkován v lidských ledvinách a močových cestách

Pro lokalizaci produkce HD5 v močovém traktu bylo provedeno imunobarvení. Imunohistochemie (IHC) ukázala, že imunoreaktivita HD5 byla přítomna v celém urotelu močovodu a močového měchýře všech zkoumaných vzorků (n=4, obrázek 3). IHC také prokázala, že HD5 byl produkován v tubulech renální kůry a dřeně všech vzorků (n= 6, obrázek 4). Imunofluorescence (IF) prokázala, že exprese HD5 byla nejvyšší v distálním nefronu a sběrných tubulech (obrázek 5). Intersticium a glomeruly nevykazovaly imunoreaktivitu HD5. Imunobarvení znázorněné na obrázcích 3, 4 a 5 bylo provedeno pomocí myší monoklonální protilátky anti-HD5 (8C8), která rozpoznává propeptid HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Výsledky byly podobné při použití králičí polyklonální protilátky proti HD5, která rozpoznává propeptid HD5 a zralý peptid (data nejsou uvedena) – což naznačuje, že HD5 je uložen jako propeptid.

Při pyelonefritidě se imunobarvení HD5 výrazně zvýšilo. Imunoreaktivita HD5 se zvýšila v celém proximálním nefronu, distálním nefronu a sběrných tubulech (obrázek 4 a obrázek 5). Stejně jako u neinfikovaných vzorků nevykazovaly glomeruly a intersticium žádnou expresi HD5 s infekcí. Negativní kontroly nevykazovaly žádnou imunoreaktivitu HD5.

Infikovaná lidská moč obsahuje měřitelné

koncentrace peptidu HD5

Imunoblotová analýza s použitím králičího polyklonálního antiséra, které detekuje prekurzor proHD5, a dále zpracované formy identifikovaly měřitelné hladiny HD5 ve 13 z 15 testovaných vzorků moči infikovaných uropatogenní E. coli (obrázek 6A a B). Pokud byly přítomny, hladiny HD5, normalizované na kreatinin v moči, se pohybovaly v rozmezí 299,8–669,7630 ng HD5/mg Cr v moči (110,67 ng/ml–276,67 ng/ml), což odpovídá 11,10–27,67 nmol/l. Ve vzorcích infikované moči (n=15) byla HD5 na nebo pod detekčním limitem (,50 ng). Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA) na stejných vzorcích moči s použitím myší monoklonální protilátky (8C8), která detekuje pouze prekurzor proHD5, detekoval měřitelné hladiny proHD5 ve 13 z 15 testovaných infikovaných vzorků. Koncentrace proHD5 v moči se pohybovaly v rozmezí 122,78–490,060,03 ng HD5/mg Cr v moči (30,02 ng/ml–200,5 ng/ml), pokud byl přítomen (obrázek 7).

Diskuse

V této studii poskytujeme počáteční charakterizaci HD5 v lidské ledvině, močovodu a močovém měchýři. Ukázalo se, že HD5 je důležitý AMP, který zabraňuje invazivní infekci ve střevě a je up-regulován v genitálním traktu během infekce [11,18,19,20,21]. Ukázalo se, že AMP pocházející z epitelu, jako je HD5, jsou důležité pro udržení sterility v močovém traktu [8,22,23,24]. Nedostatky této vrozené slizniční obrany mohou vést k akutní a/nebo chronické infekci [25,26].

Naše kvantitativní výsledky PCR v reálném čase ukazují, že DEFA5 je konstitutivně exprimován v lidských ledvinách, močovodech a močovém měchýři. Exprese DEFA5 se zvyšuje z horních močových cest do dolních močových cest – v návaznosti na proudění močového proudu a rostoucí blízkost k místu invaze mikrobioty. Pokud je nám známo, jedná se o první studii, která kvantifikuje expresi DEFA5 v lidských ledvinách a močovém měchýři. Townes et al nedávno prokázali, že normální distální ureter může exprimovat DEFA5 [14]. Naše výsledky také naznačují, že DEFA5 je konstitutivně exprimován distálním močovodem. Ačkoli je exprese DEFA5 v močovém traktu téměř 100-krát nižší než v gastrointestinálních tkáních, bazální uroepiteliální exprese DEFA5 je srovnatelná s expresí dříve popsaných zesilovačů močových cest, jako je katelicidin, hBD-1, hBD -2 a ribonukleáza 7[6,8,22,24,27]. Na rozdíl od zralého gastrointestinálního traktu, kde je DEFA5 exprimován ve vysokých hladinách jak ve zdravotním stavu, tak ve stavu infekce/zánětu, naše kvantitativní údaje v reálném čase PCR data ukazují, že exprese DEFA5 v ledvinách je významně up-regulována infekcí [27,28,29]. Tento indukovatelný vzorec exprese je analogický s expresí DEFA5 v ženském reprodukčním traktu, kde se exprese DEFA5 zvyšuje se salpingitidou [30]. V močovém traktu Townes et al prokázali trend k vyšší ureterální expresi DEFA5 u pacientů s UTI, kteří podstoupili derivaci moči z ileálního konduitu [14].

Naše imunoblotová analýza doplňuje data PCR v reálném čase tím, že prokazuje, že produkce peptidu HD5 se zvyšuje s pyelonefritidou. Tento indukovatelný vzor produkce HD5 je podobný tomu, který je vidět u některých členů rodiny beta-defensinů. hBD2 vykazuje indukovatelný vzor produkce s infekcí močových cest a/nebo chronickou pyelonefritidou [8,31,32]. Bylo prokázáno, že produkce HD5peptidu se zvyšuje v horním ženském genitálním traktu a mužské močové trubici se zánětem [11,30].

Pomocí imunobarvení prokazujeme, že HD5 je rovnoměrně produkován v celém urotelu močovodu a močového měchýře. Protože převážná většina infekcí močových cest je výsledkem fekální flóry, která stoupá do močového měchýře, tyto výsledky naznačují, že exprese HD5 je přítomna v místech, kde dochází nejčastěji k mikrobiální expozici [33]. Proto je HD5 ideálně umístěn, aby zabránil vzestupné mikrobiální infekci. V ledvinách je HD5 primárně produkován v distálním nefronu a sběrném tubulu. Tato zjištění naznačují, že HD5 je produkován v místech, kde bude umístěn tak, aby měl optimální antimikrobiální aktivitu. Předchozí studie ukázaly, že antimikrobiální vlastnosti defensinů jsou závislé na koncentraci soli – přičemž vyšší koncentrace soli snižuje antimikrobiální aktivitu [23,34,35]. Předpokládáme, že nízké koncentrace soli distálního nefronu a sběrných tubulů poskytují příznivé prostředí pro antimikrobiální aktivitu HD5.

Imunoblot a analýza ELISA také ukazují, že HD5 je vylučován do moči v nízkých hladinách. Vzhledem k velikosti (8,1 kDa a 3,7 kDa) a kladnému náboji proHD5 a plně zpracovaného HD5 je možné, že některý peptid HD5 v moči pochází, alespoň částečně, z plazmatického filtrátu. Přesto existuje jen málo důkazů naznačujících, že HD5 přetrvává v plazmě [27]. Aby se HD5 objevil v moči, musel by navíc uniknout účinným mechanismům absorpce peptidů v proximálním tubulu [6,36]. Nakonec byly použité vzorky moči před provedením testů odstředěny, čímž byly odstraněny buněčné zdroje HD5. Při zjištěných koncentracích není pravděpodobné, že by močový HD5 byl přímo antimikrobiální proti uropatogenním mikroorganismům, protože plně zpracovaný HD5 má minimální inhibiční koncentraci (MIC) mezi 6–10 mg/ml proti běžným gramnegativním uropatogenním bakteriím [15]. Nicméně povrchové koncentrace na sliznicích budou pravděpodobně vyšší. Dále imunoblotová analýza ukazuje, že koncentrace HD5 jsou významně vyšší v ledvinách. Tyto výsledky naznačují, že HD5 se podílí na slizniční obraně močového traktu. Analogický vzorec je pozorován u hBD1, kde koncentrace hBD1 v moči nedostačují k tomu, aby vykazovala antimikrobiální aktivitu, ale vyšší koncentrace peptidu byly detekovány v blízkosti renálních tubulů [6,31].

Protože IHC demonstruje, že proHD5 je hlavní formou HD5 v ledvinách a protože jak zralý, tak proHD5 jsou detekovány v moči, spekulujeme, že HD5 je primárně vylučován jako prekurzorová molekula a poté prochází proteolytickým zpracováním za vzniku zralých forem – podobně jako v gastrointestinálním traktu. a genitourinární trakt [11,30,37]. V tenkém střevě Panethovy buňky produkují trypsin, který štěpí propeptid HD5, takže plně zpracovaný peptid je převládající formou ve střevním lumen [37]. V mužské močové trubici jsou klíčovými zpracovatelskými a aktivačními enzymy pro HD5 neutrofilní proteázy, které přispívají

neutrofily rekrutované do místa infekce [11]. Podíl epiteliálního trypsinogenu, močového trypsinu a/nebo neutrofilních proteáz na zpracování HD5 v močovém traktu během infekce zbývá určit. Kromě toho zbývá určit účinky změn v močovém prostředí na funkci HD5 (změny osmolarity, pH a kationtových koncentrací).

Závěrem lze říci, že se jedná o první studii, která identifikuje a kvantifikuje expresi a produkci HD5 v močovém traktu. Naše výsledky naznačují, že HD5 je AMP odvozený z epitelu, který může hrát důležitou roli ve vrozené imunitě lidského uroepitelu bránící translokaci invazních patogenů do oběhu. Objasnění faktorů, které regulují produkci HD5, může poskytnout nový pohled na patogenezi UTI u pacientů s rizikem UTI a pacientů s chronickými infekcemi.

Metody

Schválení studie

Informovaný písemný souhlas byl získán od všech pacientů účastnících se této studie. Pro subjekty mladší 18 let byl získán písemný souhlas rodičů/zákonných zástupců. Institucionální kontrolní rada NationwideChildren's Hospital (NCH) schválila tuto studii spolu s procesem souhlasu a dokumenty (IRB07-00383).

Vzorky lidské tkáně a moči

Neinfikovaná tkáň distálního ureteru a močového měchýře (n= 4) byla získána od dětí podstupujících reimplantaci ureteru z jiných důvodů, než je recidivující infekce. Vzorky neinfikovaných ledvin (n=6) byly získány od pacientů podstupujících nefrektomii pro nádory ledvin. Vzorky tkání byly bez makroskopických známek onemocnění nebo zánětu. Tkáň ledvin od pacientů s chronickou pyelonefritidou poskytla síť Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Dva nezávislí patologové potvrdili histopatologickou diagnózu pyelonefritidy. Vzorky tkání byly bleskově zmraženy nebo konzervovány jako neutrální formalínem fixované řezy zalité v parafínu. Řezy neinfikované ledvinové tkáně byly před uskladněním vyříznuty do kůry, dřeně nebo ledvinové pánvičky (n=4).

Vzorky neinfikované a infikované moči byly získány od dětí přicházejících na pohotovost NCH nebo na nefrologickou kliniku. Diagnóza UTI byla stanovena pozitivní kultivací moči podle American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Všechny infikované vzorky moči měly 106 CFU/ml E. coli. Hodnoty pH moči se pohybovaly od 5,5 do 8,5 (průměr moči 6,9). Iontové složení moči nebylo měřeno. Vzorky moči byly centrifugovány, aby se odstranil močový sediment, a byl přidán koktejl inhibitoru proteázy (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).