HPLC stanovení echinakosidu ve vodném extraktu z Cistanche Herba

Abstraktní: Cíl: Byla zavedena metoda HPLC pro stanovení Echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche deserticola. Metody: Echinakosid byl stanoven pomocí HPLC. Separace byla provedena na koloně Inertsil ODSSP C18 s mobilní fází sestávající z acetonitrilu (A) a 0,4% roztoku kyseliny fosforečné (B), gradientovou elucí. Detekční vlnová délka byla nastavena na 333 nm a teplota kolony byla 30 stupňů. Průtok byl 1,0 ml·min-1 a objem nástřiku byl 10 μl. Výsledky: Lineární vztah echinakosidu v rozmezí koncentrací 44,93977-539,2764 ug ·m byl dobrý (r=0.9998). Výtěžnosti byly 94,59 %–105,31 % (RSD= 2.93 %, n=9). Obsah echinakosidu ve vodních extraktech Cistanche herba byl 15,527,7,347,12,267 mg·g-1

Závěr: Zavedená metoda HPLC s dobrou opakovatelností je přesná, jednoduchá a proveditelná. Je vhodný pro stanovení echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche deserticola.

Klíčová slova: HPLC; vodní extrakt z Cistanche deserticola; echinakosid; určení obsahu

Cistanche deserticola is a commonly used tonic in traditional Chinese medicine in clinical practice, and has the reputation of "desert ginseng". Cistanche deserticola zahrnutá do vydání čínského lékopisu z roku 2015 je sušená, šupinatá, masitá nať rostliny Orobaceae Cistanche deserticola YC Ma nebo Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. It has a warm nature, a sweet and salty taste, and belongs to the kidney and large intestine meridians. It has the effects of tonifying kidney yang, benefiting essence and blood, moistening the intestines, and relieving constipation [2].

Pouštní ženšen

"Shennong Materia Medica Classic" uvádí, že dokáže "vyživovat střed, vyživovat pět vnitřních orgánů a posilovat jin a vyživovat podstatu.". Cistanche deserticola obsahuje především fenylethanoidní glykosidy, iridoidy a glykosidy, lignany a glykosidy, polysacharidy, estery a alkaloidy [3]. Fenylethanolové glykosidy jsou hlavními aktivními složkami Cistanche deserticola, mezi nimiž jsou echinacea a bazénové indikační složky pro identifikaci a stanovení obsahu Cistanche deserticola v čínském lékopisu.

Fenylethanolglykosid je hlavní aktivní složkou Cistanche deserticola

Pharmacological studies [4] indicate that Cistanche deserticola has various pharmacological effects, such as moistening the intestines and relieving constipation, protecting the liver, resisting osteoporosis, antioxidation, anti-aging, and anti-fatigue. The aqueous extract of Cistanche deserticola can promote the bone morphogenetic protein 2 genes of osteoblasts in rats, as well as the tartrate-resistant acid phosphatase and osteocalcin in the serum of ovariectomized mice, as well as the Smad1 and Smad5 genes and transforming growth factors in the bone marrow- - - - . The expression of, etc., has an anti-osteoporosis effect [5-6]. Echinoside can promote the proliferation of osteoblasts and promote the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts in vitro [7-9].

Echinosid, hlavní chemická složka Cistanche deserticola

Kliknutím sem zobrazíte produkty Natural Cistanche Echinacoside

【Požádejte o více】 E-mail: xue122522@foxmail.com /WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

V posledních letech se objevilo mnoho zpráv o stanovení obsahu echinakosidu a polysidu v lihovém extraktu Cistanche deserticola a jeho složených přípravcích [10-12], ale málo zpráv o stanovení obsahu indikátorových složek ve vodním extraktu Cistanche deserticola. V této studii byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ke stanovení obsahu echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche deserticola.

1. Materiál

1.1 Zařízení

LC-20AT vysokoúčinná kapalinová chromatografie, SPD-20A detektor, SIL-20A automatický vzorkovač, teplotní box kolony CTO-10ASvp, pracovní stanice kapalinové chromatografie LCsolution, Shimadzu Corporation of Japan; MES125P-OCE-DU elektronické analytické váhy, Sartorius, Německo; SHZ-D (III) cirkulační vodní víceúčelová vakuová pumpa, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.

1.2RC2BSO25 rotační výparník chladicí cirkulační systém, RV10DS96 rotační výparník, IKA, Německo; DK-S26 Elektrická termostatická vodní lázeň, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; Stroj na ultra čistou vodu řady UPR, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Léčivé materiály a činidla

Meat Rong léčivý materiál, zakoupený od Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., číslo šarže: 18010011806001, 181001. Sušené, šupinaté, masité stonky rostliny Leobaceae Cistanche deserticola, které identifikoval hlavní čínský bylinkář třetí nemocnice tradiční čínské medicíny Tu A-Guzhinging v nemocnici Guangzhou. drogová inspekční místnost Třetí přidružené nemocnice Guangzhou University of Tradiční čínské medicíny; Echinoside referenční látka, obsah 89,7 %, Čínský institut pro kontrolu potravin a léčiv, číslo šarže: 111670-201706; Acetonitril je chromatograficky čistý (Merck, Německo); Methanol a kyselina fosforečná jsou analyticky čisté (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Voda je ultra čistá voda.

2. Metody a výsledky

2.1 Příprava vodního extraktu z Cistanche deserticola

Vezměte prášek cistanche, přidejte 10násobné množství destilované vody, zahřejte a pod zpětným chladičem dvakrát extrahujte, pokaždé po dobu 1 hodiny. Filtruje se, filtrát se spojí a pomocí rotační odparky se filtrát koncentruje na obsah surového léčiva 0,100 g. ml-1. Skladujte při 4 stupních pro pohotovostní režim. 2.2 Chromatografické podmínky a vhodnost systému Chromatografická kolona: kolona InertsilODS SPC18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm); Mobilní fáze: acetonitril (A) - 0.4% roztok kyseliny fosforečné (B), gradientová eluce: 0~5 min, 17% A; 5~25 min, 20 % A; 25-30 min, 17%A; Detekční vlnová délka: 333nm; Teplota kolony: 30 stupňů; Průtok: 1,0 ml · min-1; Nástřikový objem: 10 μl. Za těchto chromatografických podmínek je rozlišení mezi píky echinacey a sousedních složek větší než 1,5 a teoretický počet kolon by neměl být menší než 4000 pro píky echinacey. Chromatogram je na obrázku 1.

Obrázek 1 HPLC chromatogramy echinakosidu(A) a vodního extraktu z Cistanche herba(B)

2.3 Příprava roztoku

2.3.1 Referenční roztok

Odvažte vhodné množství referenční látky Echinacetin, přesně ji zvažte, vložte do odměrné baňky o objemu 10 ml, přidejte methanol, aby se rozpustil, a připravte, aby obsahovala 898,794 echinacetinu na mililitr μG referenčního roztoku, skladovaného při 4 stupních pro pohotovostní režim.

Echinoside z Cistanche deserticola

2.3.2 Zkušební roztok

Přesně odměřte 2,0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte ve vodní lázni, rozpusťte v methanolu, doplňte do konstantního objemu v odměrné baňce o objemu 10 ml a dobře protřepejte . 0.22 μm mikroporézní membránovou filtraci, jmenovitě.

2.4 Zkoumání lineárního vztahu

Přesně odměřte 0,25, 0,50, 1,00, 2,00, 2,50 a 3,00 ml referenčního roztoku podle 2.3.1 a vložte je do 5ml odměrné baňky, přidejte methanol do konstantního objemu a dobře protřepejte, abyste získali gradientové koncentrace 44,9397, 89,187. 359,5176, 449,3970 a 539,2764 μG · ml-1 referenčního roztoku, 0,22 μM Mikroporézní membránová filtrace. Proveďte stanovení podle chromatografických podmínek v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Použitím hmotnostní koncentrace referenční látky jako úsečky (X, μG · ml-1) je plocha píku ordináta (Y) a získá se rovnice lineární regrese: Y=13185.0X-32273.0, r=0.9998. Výsledky ukázaly, že echinacea se pohybovala od 44,9397 do 576439,2μ2. Lineární vztah v rozmezí koncentrací g · ml-1 je dobrý.

2.5 Zkouška přesnosti

Vezměte 539,2764 μG · mL-1 referenčního roztoku, kontinuálně 6x vstřikujte vzorek podle chromatografických podmínek v 2.2 a zaznamenejte plochu píku. Výsledky: RSD oblasti píku echinacey bylo 1,81 %, což ukazuje na dobrou přesnost přístroje.

2.6 Test stability

Přesně odměřte 2,0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, odpařte do sucha ve vodní lázni, rozpusťte v methanolu, doplňte do konstantního objemu v 10 ml odměrné baňce, dobře protřepejte, 0,22 μ Filtrujte s mikroporézní membránou, vstříkněte vzorky pro stanovení při 0, 2, 4, 8, 12 a 24 hodinách podle podmínek chromatičnosti a zaznamenejte oblast píku 24 hodin. Výsledky: RSD oblasti píku echinacey bylo 1,16 %, což ukazuje, že testovaný roztok měl dobrou stabilitu během 24 hodin.

2.7 Zkouška opakovatelnosti

Přesně se odměří 6 porcí 2,0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, připraví se 6 porcí zkušebního roztoku paralelně podle metody popsané v 2.3.2, nastříknou se vzorky pro stanovení podle chromatografických podmínek popsaných v 2.2 a zaznamená se plocha píku. Výsledky: RSD hmotnostní koncentrace echinacey byla 1,28 %, což ukazuje, že metoda měla dobrou opakovatelnost.

Experiment Cistanche deserticola

2.8 Test obnovy přidání vzorku

Přesně odměřte 9 porcí 1,0 ml vodného extraktu Cistanche deserticola, přidejte 0,8, 1,0 a 1,2 ml referenčního roztoku (101,552 mg · ml - 1), odpařte na vodní lázni, rozpusťte v methanolu a doplňte na objem v ml odměrné baňce; Dobře protřepejte, 0,22 μ Filtr s mikroporézní filtrační membránou pro přípravu testovacího roztoku s vysokou, střední a nízkou koncentrací. Připravte paralelně 3 díly každé koncentrace, změřte podle chromatografických podmínek v 2.2, zaznamenejte plochu píku a vypočítejte výtěžnost přidání vzorku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

2.9 Stanovení obsahu vzorku

Přesně odměřte 3 porce 2,0 ml vodního extraktu z Cistanche deserticola, odpařte do sucha ve vodní lázni, rozpusťte v methanolu, doplňte do konstantního objemu v 10 ml odměrné baňce, dobře protřepejte, 0,22 μ Filtrujte s mikroporézní membránou, změřte podle chromatografických podmínek v 2.2, zaznamenejte obsah plochy píku a vypočítejte plochu píku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 1: Výsledky testů výtěžnosti echinakosidu

Tabulka 2 Výsledky stanovení obsahu echinakosidu ve vodním extraktu Cistanche herba

3. Diskuse

3.1 Způsob přípravy zkušebního předmětu

Vodný extrakt Cistanche deserticola obsahuje různé chemické složky, jako jsou fenylethanolglykosidy a polysacharidy, které způsobují určitou interferenci s testovanými složkami. Tato studie zkoumala dvě různé koncentrace rozpouštědel, 50% methanol a methanol. Výsledky ukázaly, že separační efekt píku v chromatogramu testovaného produktu za použití 50% methanolu jako rozpouštědla byl špatný mezi echinaceou a sousedními složkami. Při použití methanolu jako rozpouštědla je rozlišení píku glykosidu echinacey dobré a nedochází k interferenci s jinými píky nečistot. Proto byl jako rozpouštědlo pro testovací roztok zvolen methanol. Za použití methanolu jako rozpouštědla byl vodní extrakt z Cistanche deserticola odpařen do sucha ve vodní lázni. Byly použity dvě metody zpracování: rozpouštění methanolu, třepání s konstantním objemem a rozpouštění methanolu ultrazvukem (10 minut). Výsledky ukázaly, že mezi oběma metodami nebyl žádný významný rozdíl. Tato metoda byla zvolena pro přípravu testovacího roztoku z důvodu jednoduché operace rozpouštění methanolu a konstantního objemového třepání.

Čínská bylina cistanche

3.2 Výběr mobilní fáze

V této studii se odkazovalo na mobilní fázi (methanol-0,1% kyselina mravenčí) používanou pro stanovení obsahu Cistanche deserticola v Čínském lékopisu (svazek I) (2015). Výsledky ukázaly, že se pík echinaceového glykosidu rozšířil a došlo k fenoménu náběžné hrany, který může souviset se slabou eluční schopností mobilní fáze; S odkazem na příslušnou literaturu [12-13] byl jako mobilní fáze použit acetonitril-0,5% kyselina octová, ale tvar píku echinacey byl špatný a docházelo k jevu chvostování. Vzhledem k hodnotě pH mobilní fáze byl nakonec jako mobilní fáze použit acetonitril-0,4% kyselina fosforečná. V důsledku toho byl teoretický počet píků echinacey vyšší než 4000 a rozlišení mezi píky echinacey a sousedních složek bylo vyšší než 1,5. Tvar píku byl symetrický, bez interference s píky nečistot a základní linie byla stabilní. Proto byl v této studii jako chromatografická mobilní fáze pro stanovení obsahu echinacey použit acetonitril-0,4% - 0.4% kyselina fosforečná. V této studii byla ke stanovení Echinacea ve vodném extraktu Cistanche deserticola použita metoda HPLC.

Prášek z extraktu cistanche

Metoda je jednoduchá, přesná a reprodukovatelná. Je vhodný pro stanovení echinacey ve vodném extraktu cistanche deserticola a může být použit jako metoda kontroly kvality vodného extraktu cistanche deserticola. Tato studie pouze stanovila obsah echinacey ve vodním extraktu z Cistanche deserticola. V budoucnu se plánuje stanovení obsahu echinacey ve složeném odvaru z Cistanche deserticola za účelem prozkoumání vlivu různých faktorů na obsah echinacey, což poskytne referenci pro kontrolu kvality odvaru obsahujícího Cistanche deserticola.