Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zlepšení produkce fenylethanoidových glykosidů houbovým elicitorem v buněčné suspenzní kultuře Cistanche deserticola

Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-guo Mei²

Klíčová slova Cistanche deserticola, houbový elicitor,fenylethanoidní glykosid, kultura rostlinných buněk

Abstraktní
Když 15. den růstu elicitor zFusarium solanibylo přidáno 40 mg/l^-1 naCistanche deserticolabuněčné suspenzní kultury, obsah echinakosidu, akteosidu a celkfenylethanoidové glykosidy(PeG) v kultivovaných buňkách se všechny zvýšily během následujících 27 dnů o více než 100 procent na 15 mg g^-1sušina, 9 mg g-1 sušina a 57 mg g^-1 sušina, resp. Konečná biomasa (1,3 mg suché hm. ml^-1) nebyl ovlivněn.

Cistanche deserticola

Úvod

Cistanche deserticolaMa. (Orobanchaceae), původní bylina z Číny, je široce používána v tradiční medicíně pro různé způsoby léčby, včetně použití jako sedativum nebo zesilovač imunitní reakce (Hsu et al. 1995, Chang et al. 1995).Fenylethanoidové glykosidy(PeG) jsou hlavní bioaktivní metabolity vCistanche deserticola(Xiong et al. 2000) a jsou složeny z mnoha složek, jako je echinakosid, akteosid, cisakteosid, isoakteosid, 2-acetylakteosid, cistanosid A a osmanthusid B (Wang et al. 2000). S rostoucí poptávkou po těchto produktech a rychlým poklesemCistanche deserticolabuněčná kultura by byla atraktivním alternativním způsobem produkce. Mnoho elicitorů (zejména houbových elicitorů) může zvýšit produkci metabolitů v kultuře rostlinných buněk (Wang et al. 2001). Li a kol. (1998) zjistili, že houbový elicitor Fusarium solani izolovaný z kořenových systémů obouCistanche deserticolaa jeho hostitel, Halaxylon ammodendron, by mohl zlepšit obsah aminokyselin v kalusuCistanche deserticolaAle změny obsahu PeGs v této kalusové linii nebyly v jejich studii zmíněny. V tomto článku byly studovány účinky elicitoru z F. solani na biosyntézu celkových PeG a dvou hlavních bioaktivních PeG (echinakosid a akteosid) a na změny buněčného růstu v suspenzní kultuřeCistanche deserticola.

Materiály a metody

Kultury rostlinných buněk
Kalus byl vyvolán ze šupinCistanche deserticolaa udržována na Gamborgově médiu B5 (1968) doplněném 0,5 mg indol-3-kyseliny octové l^-1, 2 mg kinetinu l^-1,a 1 g hydrolyzátu kaseinu l^-1. Před sterilizací bylo pH upraveno na 6. Všechny experimenty byly prováděny ve 250 ml třepacích baňkách, z nichž každá obsahovala 100 ml média na rotační třepačce (120 otáček za minutu a 25 stupňů) ve tmě. Inokulum bylo asi 100 g čerstvé hm^-1.

účinný obsah cistanche deserticola--fenylethanoidní glykosid

Příprava houbového elicitoru

Separace kmene houby, Fusarium solani a příprava houbového elicitoru byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve (Li et al. 1998, Yu et al. 2001). Různá množství (sacharidové ekvivalenty) houbového elicitoru byla přidána ke kulturám v třepaných baňkách 15. den (celková doba kultivace byla 42 dní).

Akumulace biomasy a test životaschopnosti
Buňky z třepané baňky byly promyty destilovanou vodou a lyofilizovány do konstantní hmotnosti. Takto byla stanovena suchá hmotnost. Životaschopnost buněk (procento životaschopných buněk v buněčné populaci) byla stanovena redukcí 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloridu (Towill & Mazur 1975).

fenylethanoidní glykosidzcistanche deserticola

Stanovení obsahu echinakosidu, akteosidu a celkového obsahufenylethanoidové glykosidy(Peg)
Extrakce PeG byla provedena podle metody Du & Liu (1993). Sušené mrazemCistanche deserticolabuňky byly extrahovány 70% (v/v) ethanolem. Ethanolová frakce byla zakoncentrována, odmaštěna vodou nasyceným ethylacetátem a poté vyluhována vodou nasyceným n-butanolem. Frakce n-butanolu byla zakoncentrována, rozpuštěna ve vodě, vložena do kolony s makroporézní pryskyřicí (AB-8, chemický produkt Nankai University, Tianjin, Čína) a eluována postupně vodou a methanolem. Methanolová frakce byla shromážděna a celkový obsah PeGs byl stanoven za použití echinakosidu jako standardu při 334 nm. Echinakosid a akteosid byly stanoveny pomocí kolony Nova Pak C18 (250 x 4,6 mm) v systému HPLC (vody) s UV detektorem (334 nm).

Výsledek

Vliv houbového elicitoru na akumulaci biomasy a celkovou biosyntézu PeGs Účinky houbového elicitoru na buněčnou biomasu a celkovou akumulaci PeGs závisely na přidané dávce (ekvivalenty sacharidů). Jak je znázorněno na obrázku 1, nižší dávky elicitoru byly příznivé pro suchou hmotnostCistanche deserticolabuňky. Vrchol byl s elicitorem 20 mg/l^-1(dává 1,76 mg suché hmotnosti ml^-1).
Celková akumulace PeGs byla významně zvýšena houbovým elicitorem v dávce mezi 20 mg/l^-1a 80 mg/l^-1. Nejvyšší výtěžek dosáhl elicitor v množství 40 mg l-1 (57 mg g^-1), což bylo více než dvojnásobek hodnoty získané v neelicitorové kontrolní kultuře. V dalším experimentu byl použit houbový elicitor v množství 40 mg1^-1.

Obr. 1. Hmotnost suchých buněk a celková akumulace PeGs v suspenzní buněčné kultuřeCistanche deserticolav reakci na různé dávky houbového elicitoru. 15. dne byl do média přidán plísňový elicitor. Vzorky byly odebrány po dalších 27 dnech. ▲, konečná hmotnost suchých buněk; ◆, celkový obsah PeG. Hodnoty jsou průměry trojitých výsledků a chybové úsečky představují standardní odchylky.

Časový průběh buněčného růstu a biosyntézy PeGs
Obrázek 2 ukazuje časový průběh buněčné životaschopnosti a biosyntézy PeG (echinakosid a akteosid) suspenzních buněk poté, co byly kultury vystaveny 40 mg l^-1houbový elicitor 15. d. V následujících 27 dnech kultivace, echinakosid a akteosid, dva hlavní bioaktivní PeG vCistanche deserticola, obojí značně vzrostlo. 39. d bylo dosaženo obou maximálních akumulací, které dosáhly 14,7 mg g^-1sušina a 8,9 mg g^-1 sušina, resp. Nebyl pozorován významný rozdíl v životaschopnosti buněk mezi kulturami ošetřenými elicitorem a kontrolou.

Obr. 2. Životaschopnost buněk a biosyntéza echinakosidu a akteosidů v suspenzní buněčné kultuřeCistanche deserticolapo ošetření 40 mg l^-1houbový elicitor. Plísňový elicitor byl do média přidán 15. d.◆, Echinacoside ošetřeno elicitorem; ◇, echinacoside-kontrola; ●, akteosidy ošetřené elicitorem;○,

kontrola akteosidů; ▲, buněčná životaschopnost – ošetřená elicitorem;△, buněčná viabilita – kontrola. Hodnoty jsou průměry trojitých výsledků a chybové úsečky představují standardní odchylky.

Diskuse

Mnoho složek odvozených z hub (fragmenty buněčných stěn, polysacharidy, oligosacharidy, glykoproteiny atd.) bylo použito jako různé houbové elicitory při produkci sekundárních metabolitů u mnoha druhů rostlinných buněk. V tomto článku je homogenát (složený převážně z polysacharidů) z kmene houby Fusarium solani izolovaný z kořenových systémůCistanche deserticolaa Halaxylon ammodendron byl prokázán jako účinný elicitor pro biosyntézu PeGs v buněčné kultuřeCistanche deserticola. Použití tohoto elicitoru ke stimulaci syntézy PeGs v buňkách bylo nejen významné, ale projevilo se brzy po elicitaci. Tento závěr souhlasil s některými předchozími studiemi o kultivaci rostlinných buněk (Wang et al. 2001).

V předchozí studii Li et al. (1998), kdy byl do kultivačního média přidán houbový elicitor z F. solani, kalus indukovaný ze semenCistanche deserticolamohly zůstat naživu v následné dlouhodobé subkultuře a produkce iridoidů by mohla být zvýšena. Ukázalo se, že kultivované buňky by mohly syntetizovat sekundární metabolity odolnosti vůči chorobám, když jsou napadeny mikroorganismy. Ačkoli iridoidy nebyly v našem experimentu stanoveny, ukázali jsme, že polysacharidy z F. solani by mohly být použity jako účinné houbové elicitory při produkci PeG sCistanche deserticolabuňky.

účinný obsah cistanche deserticola--fenylethanoidní glykosid

Od: ' Zlepšenífenylethanoidové glykosidyprodukce houbovým elicitorem v buněčné suspenzní kultuřeCistanche deserticola“ od Cui-tao Lu¹,∗ & Xing-Guo Mei²

----Biotechnology Letters 25: 1437–1439, 2003. © 2003 Kluwer Academic Publishers. Vytištěno v Nizozemsku.

Reference

Chang Y, Wu H, Wang SN, Cheng HC (1995) Studie silných účinkůCistanche deserticolaMa., Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. a Cistanche tubulosa (Schenk) R Wight. Čína J. Chin. Mater. Med. 26: 143–146.
Du NS, Liu JL (1993) Stanovenífenylethanoidové glykosidyvCistanche deserticolamakrovezikulární pryskyřicovou spektrofotometrií. Nat. Prod. Res. Rozvíjet. 5: 30–33.

Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968) Požadavky na živiny suspenzních kultur kořenových buněk sóji. Exp. Cell Res. 50: 151–158.

Hsu WH, Chu SH, Sheng LC, Yuan KW, Mao CN (1995) Studium chemických složek a farmakologických účinkůCistanche deserticolaMa. a Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Brada. Tradice. Bylina. Drogy 26: 143–146.

Li S, Wu X, Dong XC, Zheng X, Zheng JH, Lou ZC (1998) Účinek elicitoru Fusarium solani na obsah aminokyselinCistanche deserticolamozol. China J. Northwest Pharm. 13: 247–248.
Towill LE, Mazur P (1975) Studie redukce 2,3,5-trifenyltrazoliumchloridu jako test životaschopnosti rostlinných tkáňových kultur. Umět. J. Bot. 53: 1097–1102.
Wang CG, Wu JY, Mei XG (2001) Zvýšení produkce a vylučování taxolu v buněčné kultuře Taxus Chinensis elicitací plísní a obnovou média. Appl. Microbiol. Biotechnol. 55: 404–410.
Wang YM, Zhang SJ, Luo GA, Hu YN, Hu JP, Liu L, Zhu Y, Wang HJ (2000) Analýzafenylethanoidní glykosidv extraktu z bylin Cistanchis pomocí LC/ESI-MS/MS. Acta Pharm. Hřích. 35: 839-842.
Xiong QB, Yasuhiro Tezukay, Takuji Kaneko, Li HY, Le Quan Tran, Koji Hase, Tsuneo Namba, Shigetoshi Kadota (2000) Inhibice oxidu dusnatého fenylethanoidy v aktivovaných makrofázích. Eur. J. Pharm. 400: 137–144.
Yu LJ, Lan WZ, Qin WM, Xu HB (2001) Účinky kyseliny salicylové na fungální elicitorem indukovanou membránovou peroxidaci lipidů a produkci taxolu v buněčných suspenzních kulturách Taxus Chinensis. Proč. Biochem. 37: 477–482.