Jak extrakt Cistanche snižuje zánětlivou hyperplazii

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Snížení zánětlivé hyperplazie ve střevě u myší se sklonem k rakovině tlustého střeva pomocí vodního extraktu z Cistanche deserticola

Yamin Jia,1,2 a kol

Cistanchedeserticola se běžně používá v tradiční čínské medicíně k léčbě mnoha zdravotních problémů včetně syndromu dráždivého tračníku nebo zácpy. Tato studie byla navržena k testování účinnosti vodního extraktu C. deserticola v prevenci kolorektálního karcinomu na myším modelu. Vodní extrakt C. deserticola bohatý na polysacharidy byl připraven vařením jeho stonkového prášku v destilované vodě. Jako experimentální model byly použity myši Tgfb1Rag2 null. Zde jsme ukázali, že podávání vodního extraktu C. deserticola významně snížilo počet sliznichyperplaziea střevní infekce Helicobacter u myší. Tento příznivý účinek koreloval s významnou stimulací imunitního systému, o čemž svědčí zvětšení slezin se zvýšeným počtem slezinných makrofágů a přirozených zabíječských buněk a se silnější cytotoxicitou splenocytů. Vodní extrakt C. deserticola in vitro zvýšil cytotoxicitu naivních splenocytů proti buněčné linii lidské rakoviny tlustého střeva a v makrofágových kulturách zvýšil expresi syntázy II oxidu dusnatého a stimuloval fagocytózu. Závěrem, naše data naznačují, že orální podávání extraktu C. deserticola se snižujezánětlivéhyperplastickýpolypy a infekce helicobacterem u myší svou imunostimulační aktivitou, což naznačuje, že extrakt z C. deserticola může mít potenciál v prevenci střevních zánětlivých poruch včetně kolorektálního karcinomu. Copyright © 2011 John Wiley & Sons, Ltd.

Klíčová slova: bylinná imunomodulace;Cistanchevýpis; polysacharidy; helicobacter;zánětlivéhyperplazie; kolorektální rakovina.

Cistanchevýpismůže snížitZánětlivéhyperplazie

ÚVOD

Kolorektální karcinom je celosvětově třetím nejčastějším zhoubným nádorem u mužů a druhým u žen a je čtvrtou nejčastější příčinou úmrtí na rakovinu (8 procent všech úmrtí na rakovinu; Ferlay et al., 2010). Epidemiologické studie naznačují, že mnoho rizikových faktorů spojených s tímto onemocněním, včetně genetických (např. rodinná anamnéza rakoviny tlustého střeva) (Strate a Syngal, 2005) a dietních faktorů (např. červené maso a nízký obsah vlákniny; Chao a kol., 2005; Park a kol. al., 2005) azánětlivéonemocnění střev (IBD; Eaden et al., 2001; von Roon et al., 2007; Lukas, 2010). K dnešnímu dni, navzdory mnoha novým cytotoxickým lékům a zlepšeným chirurgickým a radioterapeutickým technikám, které se používají k léčbě tohoto onemocnění (Cunningham et al., 2010), zůstává velká část pacientů s kolorektálním karcinomem stále nevyléčitelná; v roce 2008 se celosvětově odhaduje asi 608 000 úmrtí na toto onemocnění (Ferlay et al., 2010). Proto jsou zapotřebí nové terapie a jedním kandidátem je imunoterapie. Pro léčbu kolorektálního karcinomu byly hodnoceny různé imunoterapeutické přístupy a dosavadní výsledky jsou povzbudivé (Burgdorf et al., 2009). Bylo prokázáno, že rostlinné polysacharidy mají specifické imunoregulační aktivity (Jiang et al., 2010), což naznačuje, že tyto rostlinné produkty by mohly být použity jako specifické imunostimulační adjuvans proti kolorektálnímu karcinomu.

Cistanchedeserticola Ma, známá jako Rou Cong Rong v čínské bylinné medicíně, byla zahrnuta do bylinných receptur pro mnoho zdravotních problémů, včetně impotence, chorobné leukorey a syndromu dráždivého tračníku/zácpy (Jiang a Tu, 2009). Experimentální studie odhalily různé biologické aktivity různých extraktů C. deserticola; extrakt fenylethanoidových glykosidů z této byliny má u myší účinek proti únavě (Cai et al., 2010) a analgetický a anti-zánětlivéúčinky u hlodavců (Lin et al., 2002), zatímco jeho polysacharidy stimulují proliferaci T- a B-lymfocytů v kulturách lymfocytů (Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Účinnost polysacharidového extraktu C. deserticola při stimulaci imunitní odpovědi in vivo však dosud nebyla zkoumána.

Hadr2^-/-myši postrádají zralé T- a B-lymfocyty a na smíšeném pozadí (~97 procent 129 S6 a ~3 procenta CF-1) se spontánně vyvine související se zánětemhyperplazieve střevě (Engle et al., 1999). Genetické zavedení nulové alely Tgfb1 (gen transformujícího růstového faktoru b1 (TGF-b1)) do tohoto kmene myší vede k další progresihyperplaziek adenomu a karcinomu (Engle et al., 2002) a patogenní kolitida závislá na mikroflóře je nezbytná pro rozvoj rakoviny tlustého střeva (Engle et al., 2002), což naznačuje, že tento kmen myší poskytuje ideální model pro vyšetření potenciální terapie při léčbě zánětu/IBD-indukovaného kolorektálního karcinomu. V této studii poprvé prokazujeme účinnost vodního extraktu C. deserticola bohatého na polysacharidy při snižovánízánětlivéhyperplaziev tomto modelu.

MATERIÁLY A METODY

Vodný extrakt z přípravku C. deserticola bohatý na polysacharidy.

Bylinnou C. deserticola sklidil Dr. Y. Guo (China Agricultural University) v autonomní oblasti Vnitřní Mongolsko v Číně. Prášek celých sušených stonků (300 g) byl dvakrát vařen v dvakrát destilované vodě: nejprve 1 hodinu v 500 ml vody, následoval sběr supernatantu a poté 45 minut ve 400 ml vody. Supernatanty byly přefiltrovány přes filtrační papír Whatman (středně rychlý) po každém varu a spojeny dohromady. Roztok extraktu byl sušen lyofilizací a byl udržován při 80 °C. Konečný produkt byl asi 10 g (výtěžek: -3 procenta).

Myši a buněčné kultury. Myši s deficitem TGF-b1 (Tgfb1 plus /- Rag2^-/-) na smíšeném pozadí (~97 procent 129 S6 a ~3 procenta CF-1) byly získány z chovné kolonie udržované v podmínkách bez patogenů ve zvířecím zařízení ve Výzkumném centru Jacka Bella (Vancouver, BC). Tyto myši pocházejí z úložiště Mouse Models of Human Cancers Consortium (MMHCC) (National Cancer Institute at Frederick, MD, USA). Myši C57BL/6 J (B6) (samci, 8–10 týdnů staří) byly zakoupeny od Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Všechna zvířata pro experimenty byla po odstavení ve věku 4 týdnů chována v konvenčním ustájení a dietě (5001 Rodent Diet, LabDiet) a léčba bylinami a odběr vzorků byly prováděny v souladu s pokyny Kanadské rady pro péči o zvířata podle
protokoly schválené Podvýborem pro použití zvířat na University of British Columbia.

Jak buněčná linie lidského adenokarcinomu tlustého střeva SW480, tak linie myších leukemických makrofágů RAW 246.7 byly pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle's Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) obsahujícím 1{{13} procent fetálního skotu sérum (FBS) (kompletní médium DMEM) při 37-C ve zvlhčeném 5% CO2/95% vzduchovém inkubátoru. Splenocyty byly izolovány jemným rozdrcením fragmentů sleziny ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS), následovaným odstraněním erytrocytů pomocí lyzačního pufru (0,15 M NH4CI, 1,0 mM KHC03, 0,1 mM EDTA, pH 6,8). Po opětovném promytí PBS byly splenocyty suspendovány v médiu RPMI 1640 doplněném 10 procenty FBS (kompletní médium RPMI).

Cistanchevýpismůže snížitZánětlivéhyperplazie

Léčba extraktem.

Bylinný extrakt, tzvCistanchevýpisv této studii byl nakonec připraven rekonstitucí sušeného prášku sterilizovanou dvakrát destilovanou vodou a obsahoval 2–3 procenta (hmot.) fenylethanoidů, 65–70 procent (hmot.) polysacharidů a 0,6–1 procento (w/w) proteinu na základě následujících testů: počet fenylethanoidů byl stanoven absorbancí při 332 nm pomocí dříve popsané spektrofotometrie (Ouyang et al., 2005); obsah polysacharidů byl měřen pomocí standardní metody fenolsírové kyseliny (Dubois et al., 1956) po srážení ethanolem; a protein byl stanoven proteinovým testem Bio-Rad podle protokolu výrobce (Bio-Rad Lab, Hercules, CA, USA). Dávka extraktu Cistanche byla 0,4 g/kg/den na základě naší pilotní studie. Průměrný příjem vody na dospělou myš za den byl přibližně 4 ml, a pokud 1 ml pitné vody obsahoval 3 mgCistanchevýpiskaždé myši bylo orálně podáváno 12 mg extraktu denně. Na základě skutečnosti, že průměrná tělesná hmotnost dospělé myši byla 30 g, pitná voda obsahující 3 mg/mlCistanchevýpispodávali myším dávku 0,4 g/kg/den. Myši byly léčeny podáváním pitné vody ad labium obsahující 3 mg/mlCistanchevýpiskterá byla doplňována alespoň jednou za dva dny, od věku dvou měsíců po dobu tří měsíců v klasické místnosti zařízení péče o zvířata.

Histologický grading kolorektálního karcinomu.

Na konci tříměsíční léčby byly odebrány tkáně tenkého i tlustého střeva a byly podélně otevřeny, poté následovalo jemné propláchnutí obsahu PBS. Od každé myši bylo odebráno celkem šest kusů (každý o délce 2 cm) střevní tkáně: tři z tenkého střeva v proximální, střední a distální poloze; dva z tlustého střeva v proximálních a distálních místech a jeden ze slepého střeva. Všechny tkáně byly fixovány v 10% formalínu a zalité v parafínu. Každý řez byl obarven hematoxylinem a eosinem (HE) pro histologické hodnocení kolorektálního karcinomu. Klasifikace onemocnění byla provedena podle patologických znakůhyperplazieadenom nebo karcinom v každém vzorku, jak bylo popsáno dříve (Engle et al., 1999) způsobem slepého testu. Celkový počet každé patologické změny (hyperplazie, adenom a karcinom) byl počítán ve dvou řezech střevní tkáně pro každou myš.

Cistanchevýpismůže snížitZánětlivéhyperplazie

Detekce Helicobacter hepaticus (H. hepaticus) v myším trusu.

Prozkoumat účinekCistanchevýpisna růstu patologické mikroflóry ve střevě byl H. hepaticus ve stolici stanoven polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) s druhově specifickými primery 16S rDNA, jak bylo popsáno dříve (Shames et al., 1995). Přibližně 200 mg čerstvé stolice byly rozpuštěny v 1 μl PBS a inkubovány při 50 stupních po dobu 30 minut, poté následovala centrifugace při 8000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut. Supernatant (200 ml) byl sebrán a smíchán se stejným množstvím roztoku proteinázy K obsahující 5 procent (obj./obj.) 18,7 mg/ml roztoku proteinázy K (Fermentas Canada, Burlington, ON, Kanada) v štěpícím pufru (50 ul. μM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5 procenta dodecylsulfátu sodného) a inkubujte při 70 °C po dobu 30 minut. DNA ve výsledném roztoku byla extrahována pomocí sady QIAprep Miniprep podle protokolu výrobce (QIAGEN, Mississauga, ON, Kanada).
Amplifikace bakteriální DNA pomocí polymerázové řetězové reakce byla provedena ve směsi obsahující {{0}},75 μl 10 PCR pufru, 0,5μL 50 mM MgCl2, 0,5 μl každého primeru (sense: 5'-GCA TTT GAA ACT GTT ACT CTG; anti-sense: 5'-GGG GAGCUUGAAAACAG, 100 mM každý), 0,5 μl Taq polymerázy, 18,75 μl H2 a bez nukleázy 1 μl nekvantifikovaného roztoku DNA ze stolice. PCR směs byla zahřívána na 94 stupňů po dobu 5 minut, následovalo 40 cyklů denaturace při 94 stupních po dobu 1 minuty, nasedání při 55 stupních po dobu 1,25 minuty a extenze při 72 stupních po dobu 1,5 minuty. PCR byla ukončena elongačním krokem 10 minut při 72 stupních. Výsledný produkt PCR (25 ul) byl podroben elektroforéze na 1% agarózovém gelu v pufru Tris-acetát-EDTA (TAE) obsahujícím 0,5 mg/ml ethidiumbromidu a vizualizován pod UV světlem.

Stanovení makrofágů a přirozených zabíječů (NK) buněk.

Procenta makrofágů a NK buněk v suspenzi splenocytů byla stanovena analýzou fluorescenčně aktivovaného třídění buněk (FACS). Jeden milion splenocytů v pufru FACS byl inkubován s vhodnou kombinací protilátek pro různé fenotypy buněk v ledu: anti-CD3-fluorescein isothiokyanát (FITC) a anti-CD49b-fykoerythrin (PE) (BD Biosciences, Mississauga, ON, ON, Kanada) pro CD3 CD49b plus NK buňky a potkaní anti-myší F4/80 plus jako primární protilátka a anti-krysí IgG-FITC jako sekundární protilátka (eBioscience, San Diego, CA, USA) pro F4/80 plus makrofágy. Intenzita fluorescence pro každý typ buněk byla měřena pomocí průtokové cytometrie a analyzována srovnáním s kontrolami na pozadí pomocí softwaru CELLQUEST (BD Biosciences).

Test cytotoxicity kalcein-acetoxymethyl (kalcein-AM).

Lytická aktivita efektorových splenocytů proti cílovým buňkám SW480 byla hodnocena testem cytotoxicity calcein-AM za použití kokultivačního systému, jak bylo popsáno dříve (Neri et al., 2001). Stručně řečeno, buňky SW480 byly označeny fluorescenčním barvivem calcein-AM následovně: 1 x 10⁶buňky/ml buněk SW480 v kompletním médiu DMEM byly inkubovány s 15 uM calcein-AM při 37 stupních za občasného protřepávání. Po 30 minutách inkubace byly buňky důkladně promyty kompletním médiem DMEM, aby se odstranilo extracelulární barvivo. Fluorescenčním barvivem značené buňky SW480 v kompletním médiu DMEM (0,2 x 10⁶buňky/{{0}}.25 ml/jamka) byly nasazeny na 24-jamkové destičky. Na základě různých poměrů (12:1, 6:1, 3:1 a 1,5:1) E (efektor): T (cíl), splenocyty v 0,25 ml kompletního média RPMI na jamku byly přidány do jamek s cílovými buňkami v triplikátech. Kokultury byly inkubovány při 37 stupních v 5 procentech CO2 po dobu 24 hodin. Supernatanty byly shromážděny poté, co byla destička odstřeďována při 2000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Uvolňování kalceinu-AM do supernatantu bylo stanoveno pomocí mikrodestičkového spektrofluorimetru (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Labsystems) při emisi 527 nm při excitaci při 485 nm. Cílové buňky, inkubované se směsí 0,25 ml kompletního média DMEM a 0,25 ml kompletního média RPMI, byly použity jako kontroly pozadí nebo spontánního uvolňování a v přítomnosti 2 procent byl použit Triton X-100 jako ovládání maximálního uvolnění. Cytotoxicita splenocytů byla vypočtena následovně:

Měření oxidu dusnatého (NO). Oxid dusnatý vylučovaný z buněk byl v kultivačním médiu rychle oxidován na dusitany. Proto byly koncentrace dusičnanů v médiu stanoveny pomocí Griessovy metody jako měření produkce NO. RAW264.7 buněk (0,25 x 10⁶

buňky/jamka v 0,5 ml kompletního média DMEM) v 24-jamkových destičkách byly stimulovány pomocíCistanchevýpis(50–200 mg/ml) a lipopolysacharid (LPS) (10 ng/ml) jako pozitivní kontrola. Po 24 hodinách působení bylo 50 ml kultivačního supernatantu nejprve smícháno s 50 ml 1%
sulfanilamid v 5% kyselině fosforečné v 96-jamkových destičkách v triplikátech a byly inkubovány 10 min, poté bylo přidáno 50 ml 0,1% naftylethylendiamindihydrochloridu v destilované vodě do každé jamky. Absorbance byla odečtena při 550 nm po inkubaci po dobu 10 minut a hladina NO/dusitan byla vypočtena pomocí standardní křivky se známými koncentracemi dusitanu sodného.

Cistanchevýpismůže snížitZánětlivéhyperplazie

Western blot.

Buněčné hladiny syntázy oxidu dusnatého II (NOS 2 nebo iNOS) byly zkoumány metodou Western blot, jak bylo popsáno dříve (Du et al., 2006). Stručně, vzorky proteinů (přibližně 100 mg/vzorek) byly frakcionovány 7% SDS-PAGE a byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Proužky proteinu NOS II byly identifikovány primární králičí polyklonální anti-NOS II protilátkou (N-20) (ředění 1:500; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, USA) a sekundární kozí anti-králičí IgG protilátkou ( ředění 1:10000, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). Komplex NOS II protein-protilátka byl vizualizován pomocí zesíleného chemiluminiscenčního testu (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Anglie). Bloty byly znovu testovány s použitím anti-b-aktinu IgG (Sigma-Aldrich Canada, Oakville, ON, Kanada) pro potvrzení naneseného proteinu v každém vzorku.

Test fagocytózy. Fagocytóza byla měřena množstvím fluorescenčně značených latexových kuliček (SigmaAldrich Canada, L-3030, modifikované karboxylátem, průměrná velikost 2 mm) pohlcených buňkami RAW264.7, jak bylo popsáno dříve (Wu et al., 2{{ 9}}07). Stručně řečeno, buňky RAW264.7 (0,1 106 buněk/0,5 ml/jamka) v kompletním médiu DMEM byly nasazeny na 24-jamkové destičky a stimulovány 100 mg/mlCistanchevýpisnebo kompletní médium DMEM pouze jako kontrola. Po stimulaci přes noc bylo ke kulturám makrofágů přidáno 2,5 ml fluorescenčních latexových kuliček na jamku a inkubováno po dobu 2 hodin. Pro analýzu průtokovou cytometrií byly buňky po promytí v PBS odděleny pipetováním a intenzita fluorescence fagocytujících buněk byla měřena průtokovým cytometrem a analyzována srovnáním s kontrolami na pozadí (bez kuliček) pomocí softwaru CELLQUEST (BD Biosciences).

Statistická analýza.

Data byla prezentována jako průměr plus - standardní odchylka (SD). Analýza rozptylu (ANOVA) nebo Studentův t-test byly provedeny podle potřeby pro srovnání dat mezi skupinami. Hodnota p < 0,05="" byla="" považována="" za="">

VÝSLEDEK

Léčba sCistanchevýpissnižuje frekvencihyperplaziea infekce střeva H. hepaticus Během období léčby (3 měsíce) byla tělesná hmotnost a příjem pitné vody monitorovány jednou za 2 dny u myší ve skupině léčené extraktem oproti skupině léčené vehikulem, nebyl žádný významný rozdíl zaznamenáno (data nejsou uvedena). Histologická analýza však ukázala, že orální podáníCistancheextraktyvýrazně snížil početzánětlivéhyperplazieve střevě (obr. 1), o čemž svědčí fakt, že myši přijímající vodu s extraktem jich měly méněhyperplazie(5.00 plus -2,83/myš, n=15), než ti, kteří pijí obyčejnou vodu nebo vozidlo (7,53 plus -3,09/myš, n {{9 }}) (extrakt vs. vehikulum: p=0.0133, t-test). Rozdíl v počtu adenomů a karcinomů mezi myšmi ošetřenými extraktem a vehikulem nebyl statisticky významný, protože pouze několik myší mělo tato stádia patologických změn (data nejsou uvedena).

Obrázek 1. Snížení výskytu hyperplazie ošetřením vodním extraktem C. deserticola (Cistanchevýpis). Tgfb1 plus /-Rag2-/- myši byly krmenyCistanchevýpisv pitné vodě (skupina extrakt) ve srovnání s těmi, které mají pouze čistou pitnou vodu (skupina vozidel). Rakovinné léze ve střevě byly vyšetřeny histologicky pomocí barvení H&E. (A) Typický obraz řezu zdravé tkáně. (B) Typický obraz hyperplazie v řezu, označený šipkou. (C) Počet hyperplazií ve střevě každého zvířete byl spočítán histologicky (p=0,0133, extrakt versus vehikulum, n=15). Tento obrázek je k dispozici v barevném provedení online na adrese wileyonlinelibrary.com/journal/ptr

Bylo prokázáno, že obsah střevních mikrobů, zejména infekce H. hepaticus, je nezbytný pro rozvoj všech stádií rakoviny tlustého střeva včetně hyperplazie u Rag2^-/- myši (Engle a kol., 2002; Erdman a kol., 2003). Chcete-li zjistit, zda léčba sCistancheextraktysnížená patologická mikroflóra ve střevě, přítomnost H. hepaticus ve výkalech myší léčenýchCistanchevýpisbyla stanovena pomocí PCR ve srovnání s kontrolami s vehikulem. V každém experimentu byly tři myši na klec ošetřeny extraktem Cistanche nebo vehikulem. Vzorky stolice byly odebrány na konci 14-h přes noc po vyčištění klece. Jak je znázorněno na obr. 2, 16S rDNA H. hepaticus ve stolici byla účinně detekována technikou PCR. Ve třech samostatných experimentech (tabulka 1) pouze 20–40 procent vzorků zCistanche-výpis-ošetřené myši byly detekovány jako PCR pozitivní, zatímco 60–80 procent z kontrol s vehikulem bylo pozitivních (extrakt vs. vehikulum: p=0.0189, t-test, n=3), což naznačuje, že léčba Extrakt z cistanche redukoval střevní infekci H. hepaticus u myší.

Léčba extraktem z Cistanche zvyšuje počet slezinných makrofágů a NK buněk

Imunitní odpověď hraje klíčovou roli v eliminaci infekce helicobacter. Prozkoumat jestliCistanche výpisléčba ovlivnila imunitní systém u těchto myší se sklonem k rakovině tlustého střeva, na konci léčby byla stanovena velikost slezin (12 myší v každé skupině) a počet splenocytů (šest myší náhodně vybraných z každé skupiny). Sleziny 12 myší v každé skupině byly zváženy, další tři myši v počátečním experimentu nebyly zahrnuty. Jak je znázorněno v tabulce 2,Cistanche-výpis-léčené myši (0.055 plus -0,022 g/slezina) byly těžší než ve skupině s vehikulem (0,038 plus -0,01 g/slezina; extrakt vs. vozidlo: p=0.04, t-test). Tato data byla dále podpořena zvýšením počtu splenocytů u myší, kterým byl podávánCistanchevýpis, označeno 7,095 plus -1,353 (x10⁶ buňky/slezina) ve srovnání s 2,941 plus -1,492 (x10⁶buňky/slezina) kontrolní myši ve vehikulu (extrakt vs. vehikulum: p=0.002, t-test).

K dalšímu zhodnocení zdaCistanchevýpisléčba ovlivnila konkrétní podtyp splenocytů u myší, počet slezinných NK buněk (CD3^-CD49b^Plusbuňky) a makrofágy (FT/80^Plusbuňky) byl spočítán analýzou FACS. Procento CD3^-CD49b^Plusbuňky ve splenocytechCistanche-výpis-u myší (32,06 plus -2,13 procenta) se významně nelišil od myší léčených vehikulem (28,47 plus -2,74 procent; extrakt vs. vehikulum: p=0). 3741, t-test, n=6), ale celkový počet NK buněk ve sleziněCistanche-výpis-léčených myší (2,22 plus - 0,44x10⁶/slezina) byla vyšší než u kontrolní skupiny ve vozidle (0,83 plus -0,17x10⁶/slezina; extrakt vs. vozidlo: p=0.01, t-test, n=6; Obr. 3B). Podobné výsledky byly pozorovány při vyšetření slezinných buněk FT/80 plus; stejně jako v populaci slezinných NK buněk, rozdíl v procentech slezinných FT/80 plus buněk mezi myšmi ošetřenými extraktem (35,25 plus -7,28 procent) a kontrolními myšmi s vehikulem (31,74 plus -5). 07 procent) nebyl významný (extrakt vs. vehikulum: p=0.407, n=6), ale celkový počet slezinných makrofágů ve skupině léčené extraktem (2,439 plus -0 0,452 x 10⁶buněk/slezina) byla vyšší než v kontrolních skupinách (1,114 plus -0,685x10⁶buňky/slezina; extrakt vs. vozidlo: p=0.001, t-test, n=6; Obr. 3D). Dohromady tyto údaje naznačují, že léčba sCistanchevýpismůže zvýšit celkový počet, ale ne procento nebo podíl, podtypů efektorových splenocytů, NK buněk a makrofágů ve slezinách.

Obrázek 3. Zvýšení počtu slezinných NK buněk a makrofágů ošetřenímCistanchevýpis. NK buňky nebo makrofágy v suspenzi splenocytů byly stanoveny analýzou FACS s kombinovaným barvením FITC-anti-CD3e protilátky a APC-anti-CD49b/Pan-NK buněčným markerem (pro NK buňky) nebo s jediným barvením FITC-anti-CD3e FT/80 (pro makrofágy). (A) Reprezentativní graf procenta slezinných NK buněk (CD3^-CD49b^Plus) ve splenocytech myší léčenýchCistanchevýpisversus vozidlo. (B) Celkový počet NK buněk na slezinu. Data jsou prezentována jako průměr plus -SD v každé skupině (p= 0.01, n= 6). (C) Reprezentativní graf procenta slezinných makrofágů (FT/80 plus) ve splenocytech myší léčenýchCistanchevýpisversus vozidlo. (D) Celkový počet makrofágů na slezinu. Data jsou prezentována jako průměr plus -SD v každé skupině (p= 0.001, n=6).

Léčba extraktem Cistanche stimuluje cytotoxicitu splenocytů in vivo a in vitro

Imunitní odpověď závisela nejen na počtu splenocytů, ale také na jejich funkci, jako je cytotoxicita. ÚčinekCistanchevýpisléčba na funkci splenocytů (tj. cytotoxicita) byla zkoumána v kokulturách s buňkami SW480. Jak je ukázáno na obr. 4A, cytotoxicita splenocytů z myší ošetřených sCistanchevýpisbyla vyšší než u buněk z myší ošetřených vehikulem, což je indikováno 39,38 plus -2,64 procenta uvolnění kalceinu-AM ve společných kulturách splenocytů ošetřených extraktem s buňkami SW480 při 6 poměr :1, 51,11 plus -2,6 procenta při poměru 3:1 a 57,33 plus -2,53 procenta při poměru 1,5:1 ve srovnání s 27.{25}},18 procent ve společných kulturách splenocytů ošetřených vehikulem s buňkami SW480 v poměru 6:1, 40.97 =-2,85 procent v poměru 3:1 a 45,16 plus -0,18 procent v poměru poměr 1,5:1 (extrakt vs. vehikulum: p < 0,0001,="" dvoucestná="" anova).="" pro="" další="" potvrzení="" stimulačního="">Cistanchevýpisna cytotoxicitu splenocytů, cytotoxicituCistanche-výpisNaivní splenocyty z myší B6, obsahující funkční T a B buňky, byly zkoumány ve společných kulturách s buňkami SW480. Jak je znázorněno na obr. 4B, přidáníCistanchevýpis(100 mg/ml) významně zvýšilo uvolňování kalceinu-AM v kokulturách způsobem závislým na splenocytech: 57,64 plus -3,41 procenta v poměru 12:1, 52,25 plus { {11}},77 procenta při poměru 6:1 a 45,72 plus -2,43 procenta při poměru 3:1 ve srovnání s 14,36 plus -0,05 procenta při poměru 12:1 , 20,67 plus -2,03 procenta v poměru 6:1 a 23,1 plus -3,73 procenta v poměru 3:1 v nestimulovaných kokulturách (extrakt vs. vehikulum: p < 0,0001,="" dva="" -způsob="" anova).="" tyto="" výsledky="" tomu="">Cistanchevýpisstimuluje lytickou aktivitu splenocytů. Důvod, proč byla pozorována menší cytotoxicita, když bylo přidáno více efektorových splenocytů, není znám. Jednou z možností bylo, že hladina uvolňování kalceinu-AM v tomto kokultivačním systému nemusí přesně odrážet smrt cílové buňky, protože kalcein-AM by mohl být reabsorbován efektorovými splenocyty po dlouhé době inkubace.

Extrakt z cistanche aktivuje makrofágy

Aktivace makrofágů je jednou z kritických imunitních odpovědí proti infekci a rozvoji nádoru (Mantovani et al., 2002, 2008). Abychom dále odhalili vhled do mechanismů, kterýmiCistanchevýpisléčba snížená střevní hyperplazie a mikrobiální obsah, vliv naCistanchevýpisna produkci NO a fagocytózu makrofágů byly zkoumány buňky RAW264.7. Jak je znázorněno na obr. 5A, proteinová exprese NOS II byla up-regulována v kulturách po inkubaci sCistanchevýpis. Tyto výsledky byly dále podpořeny zvýšením produkce NO v rStimulováno extraktem cistanchekultur (obr. 5B), doloženo 3,88 plus -0,13 mM dusitanů v 50 mg/mlCistanchevýpisstimulované buněčné kultury RAW264.7 ve srovnání s 0.11 plus -0.12 mM dusitanů v nestimulovaných kontrolních kulturách (jednocestná ANOVA, str.<>

Fagocytóza je buněčný proces pohlcování pevných částic, jako jsou bakterie. Jak je znázorněno na obr. 5C a D, přidáníCistancheextraktystimulovaná fagocytóza makrofágů, jak naznačuje více fagocytárních buněk (9,8 plus -0,1 procenta) nalezených vCistanche-výpis-stimulované makrofágové kultury ve srovnání s těmi (5,2 plus -0,4 procenta) v kulturách stimulovaných vehikulem (extrakt vs. vehikulum: p=0.0007, t-test, n=3) po 2 hodinách inkubace. Tyto údaje tomu nasvědčujíCistanchevýpismohou přímo aktivovat makrofágy up-regulací lokální produkce NO a stimulací fagocytózy makrofágů ve střevě myší.

DISKUSE

Tato studie poprvé ukazuje, že orální podáváníCistanchevýpisvýznamně snižuje frekvenci hyperplazie a infekce H. hepaticus ve střevě myší se sklonem k rakovině tlustého střeva. Příznivý účinekCistanchevýpisléčba je spojena se zvýšením počtu a cytotoxicity slezinných NK buněk a makrofágů. Přidání in vitroCistanchevýpisstimuluje produkci NO a fagocytózu v makrofázích. TGF-b1 deficitní Rag2^-/-u myší bylo prokázáno, že se u nich ve věku 3 až 6 měsíců vyvine rakovina tlustého střeva (hyperplazie, adenom nebo adenokarcinom) a bylo prokázáno, žezánětlivéložiska jsou vždy spojena s těmito tumorigenními lézemi (Engle et al., 1999). Další studie prokázaly, že u těchto myší je pro přítomnost infekce patogenní mikrobiální flórou nutný rozvoj rakoviny tlustého střeva, protože rakovina tlustého střeva je zcela eliminována umístěním myší v bezmikrobních podmínkách (Engle et al., 2002), a H. hepaticus infekce také indukuje kolitidu a karcinom tlustého střeva u Rag2-/-myši (Erdman et al., 2003). Podobně u lidí je mikrobiální stav a imunita hostitele klíčovými faktory pro progresi IBD (Fiocchi, 1998) a bylo hlášeno, že karcinom žaludku je spojen s chronickou infekcí nebo zánětem vyvolaným H. pylori (Parsonnet et al., 1991; El-Omar a Malfertheiner, 2001). Zjištění z těchto studií naznačují, že gastrointestinální infekce může hrát klíčovou roli ve vývoji rakoviny tlustého střeva. Cílení na gastrointestinální infekci se tedy může stát terapeutickou strategií pro prevenci nebo léčbu rakoviny tlustého střeva a také IBD. Naše studie poprvé prokazuje, že orální podáníCistanchevýpissnižuje frekvencizánětlivéhyperplazieve střevě a počet H. hepaticus ve stolici u myší s deficitem TGF-b1. Příznivý účinekCistanche výpismůže být způsobeno jeho aktivací makrofágů, jak je patrné zvýšením produkce NO a fagocytózy po léčběCistanchevýpis(Obr. 5), což může omezovat střevní patogenní mikroflóru včetně helikobaktera (Mantovani et al., 2002, 2008). V důsledku toho lézezánětlivéhyperplaziebyla snížena.

V extraktech C. deserticola byla identifikována řada bioaktivních sloučenin včetně fenylethanoidových glykosidů a polysacharidů (Jiang a Tu, 2009). Fenylethanoidní glykosidy jsou cytoprotektivní, což naznačuje skutečnost, že tyto sloučeniny zabraňují buněčné smrti v kultivovaných hepatocytech a neuronech cerebelárních granulí (Xiong et al., 1998; Pu et al., 2003). Zatímco polysacharidy stimulují mitogeny indukovanou proliferaci T- a B-lymfocytů (Wu a Tu, 2005; Wu et al., 2005; Dong et al., 2007). Bylo dobře zdokumentováno, že rostlinné polysacharidy modulují imunitní odpověď (Jiang et al., 2010).Cistanchevýpisobsahuje 2–3 procenta fenylethanoidů a 65–70 procent polysacharidů, což naznačuje, že imunomodulační účinekCistanchevýpisLéčba může být způsobena imunoregulační aktivitou polysacharidů, většiny bioaktivních látek v extraktu Cistanche. Jeho cílové imunitní buňky (např. makrofágy nebo NK buňky nebo obojí) a molekulární dráhy však vyžadují další zkoumání. Nedávná studie navíc prokazuje, že podávání rostlinného fenylethanoid acetonidu, jednoho z bioaktivních fenylethanoidů v extraktu z C. deserticola (Xiong et al., 1996; Jiang a Tu, 2009), má příznivý vliv na snížení dextranu sulfát-sodíkem indukovaná kolitida u myší (Hausmann et al., 2007), což dokazuje, že fenylethanoidy (2–3 procenta) vCistanchevýpismůže alespoň částečně přispět k jeho účinnosti při snižovánízánětlivéhyperplazie, což vyžaduje i do budoucna vyhodnocení.
Závěrem lze říci, že rakovina tlustého střeva a konečníku je celosvětově jednou z nejrozšířenějších rakovin a ve většině případů se jí dá předcházet. Použití netoxických bylinných extraktů může nabídnout účinnou strategii pro prevenci rozvoje kolorektálního karcinomu a může být také aplikováno jako chemoadjuvans, které může prospívat zvýšení chemoterapeutické protirakovinné účinnosti a/nebo snížení chemoterapeutického účinku. vedlejší efekty. Údaje prezentované v této studii jasně ukazují, že ošetření vodním extraktem C. deserticola snižuje hyperplazii a infekci H. hepaticus ve střevě myší se sklonem k rakovině tlustého střeva. Infekce Helicobacter nebo střevazáněthyperplazieje rizikovým faktorem pro rozvoj kolorektálního karcinomu. Naše současná studie ukazuje, že použití této byliny může mít potenciál pro prevenci a léčbu rakoviny tlustého střeva a konečníku, zejména u jedinců, kteří mají IBD.

Potvrzení

YM byl podpořen postgraduálním studentským stipendiem od China Scholarship Council.

Konflikt zájmů

Autoři nejsou ve střetu zájmů.

Cistanchevýpismůže snížitZánětlivéhyperplazie

Od: 'SníženíZánětlivéHyperplazieve střevě u myší náchylných k rakovině tlustého střeva pomocí vodního extraktuCistanchedeserticola' od Yamin Jia,1,2 a kol

---Autorská práva © 2011 John Wiley & Sons, Ltd. Phytother. Res. 26: 812–819 (2012) DOI: 10.1002/ptr.3637

REFERENCE

Burgdorf SK, Nielsen HJ, Rosenberg J. 2009. Imunoterapie u kolorektálního karcinomu. Scand J Gastroenterol 44: 261–268.
Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. 2010. Protiúnavová aktivita extraktu bohatého na fenylethanoidy zCistanchedeserticola. Phytother Res 24: 313–315.
Chao A, Thun MJ, Connell CJ a kol. 2005. Spotřeba masa a riziko kolorektálního karcinomu. JAMA 293: 172–182.
Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ a kol. 2010. Kolorektální karcinom. Lancet 375: 1030–1047.
Dong Q, Yao J, Fang JN, Ding K. 2007. Strukturní charakterizace a imunologická aktivita dvou studenou vodou extrahovatelných polysacharidů zCistanchedeserticola YC. Ma. Carbohydr Res 342: 1343-1349.
Du C, Guan Q, Diao H, Yin Z, Jevnikar AM. 2006. Oxid dusnatý indukuje apoptózu v renálních tubulárních epiteliálních buňkách prostřednictvím aktivace kaspázy-8. Am J Physiol Renální Physiol 290: F1044–1054.
Dubois M, Gilles KAJK, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Kolorimetrické metody pro stanovení cukrů příbuzných látek. Anal Chem 28: 350-356.

Eaden JA, Abrams KR, Mayberry JF. 2001. Riziko kolorektálního karcinomu u ulcerózní kolitidy: metaanalýza. Střevo 48: 526–535.
El-Omar EM, Malfertheiner P. 2001. Helicobacter pylori a rakovina žaludku. Curr Opin Gastroenterol 17 (Suppl 1): S24-S27.
Engle SJ, Hoying JB, Boivin GP, ​​Ormsby I, Gartside PS, Doetschman T. 1999. Transformující růstový faktor beta1 potlačuje nemetastatický karcinom tlustého střeva v časném stádiu tumorigeneze. Cancer Res 59: 3379–3386.
Engle SJ, Ormsby I, Pawlowski S, a kol. 2002. Eliminace rakoviny tlustého střeva u myší s deficitem bezmikrobního transformačního růstového faktoru beta 1-. Cancer Res 62: 6362–6366.
Erdman SE, Poutahidis T, Tomczak M, et al. 2003. CD4 plus CD25 plus regulační T lymfocyty inhibují mikrobiálně indukovanou rakovinu tlustého střeva u Rag2-deficientních myší. Am J Pathol 162: 691–702.
Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C, Parkin DM. 2010. Odhady celosvětové zátěže rakovinou v roce 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127: 2893–2917.
Fiocchi C. 1998.Zánětlivéonemocnění střev: etiologie a patogeneze. Gastroenterology 115: 182–205.
Hausmann M, Obermeier F, Paper DH a kol. 2007. In vivo léčba bylinným fenylethanoidním akteosidem zmírňuje střevní zánět u kolitidy vyvolané dextransulfátem sodným. Clin Exp Immunol 148: 373-381.
Jiang MH, Zhu L, Jiang JG. 2010. Imunoregulační účinky polysacharidů z čínské bylinné medicíny. Expert Opin Ther Targets 14: 1367–1402.
Jiang Y, Tu PF. 2009. Analýza chemických složek vCistanchedruh. J Chromatogr A 1216: 1970–1979.
Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu ČR. 2002. Anti-nociceptivní a anti-zánětlivéčinnost způsobenáCistanchedeserticola u hlodavců. J Ethnopharmacol 83: 177–182.
Lukáš M. 2010.Zánětlivéstřevní onemocnění jako rizikový faktor pro kolorektální karcinom. Dig Dis 28: 619–624.
Mantovani A, Allavena P, Sica A, Balkwill F. 2008. Zánět související s rakovinou. Příroda 454: 436–444.
Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. 2002. Polarizace makrofágů: makrofágy asociované s nádorem jako paradigma pro polarizované mononukleární fagocyty M2. Trends Immunol 23: 549–555.
Neri S, Mariani E, Meneghetti A, Cattini L, Facchini A. 2001. Calcein-acetoxymethyl test cytotoxicity: standardizace metody umožňující další analýzy na získaných efektorových buňkách a supernatantech. Clin Diagn Lab Immunol 8: 1131–1135.
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Wang YC. 2005. Zlepšená produkce fenylethanoidových glykosidů oCistanchedeserticola buňky kultivované v bioreaktoru s vnitřní smyčkou airlift s prosévacím nástavcem. Enzyme Microb Technol 36: 982-988.
Park Y, Hunter DJ, Spiegelman D a kol. 2005. Příjem vlákniny a riziko kolorektálního karcinomu: souhrnná analýza prospektivních kohortových studií. JAMA 294: 2849–2857.
Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP a kol. 1991. Infekce Helicobacter pylori a riziko karcinomu žaludku. N Engl J Med 325: 1127–1131.
Pu X, Song Z, Li Y, Tu P, Li H. 2003. Akteosid zCistanchesalsa inhibuje apoptózu 1-methyl-4-fenylpyridiniovým iontem v neuronech cerebelárních granulí. Planta Med 69: 65–66.
Shames B, Fox JG, Dewhirst F, Yan L, Shen Z, Taylor NS. 1995. Identifikace rozšířené infekce Helicobacter hepaticus ve stolici v komerčních koloniích myší kultivací a PCR testem. J Clin Microbiol 33: 2968-2972.
Strate LL, Syngal S. 2005. Dědičné syndromy kolorektálního karcinomu. Cancer Causes Control 16: 201–213.
Von Roon AC, Reese G, Teare J, Constantinides V, Darzi AW, Tekkis PP. 2007. Riziko rakoviny u pacientů s Crohnovou chorobou. Dis Colon Rectum 50: 839–855.
Wu TF, Hsu CY, Huang HS, Chou SP, Wu H. 2007. Proteomická analýza účinků pycnogenolu v makrofágu RAW 264.7 odhaluje indukci exprese katepsinu D a zesílení fagocytózy. J Agric Food Chem 55: 9784-9791.
Wu XM, Gao XM, Tsim KW, Tu PF. 2005. Arabinogalaktan izolovaný ze stonkůCistanchedeserticola indukuje proliferaci kultivovaných lymfocytů. Int J Biol Macromol 37: 278-282.
Wu XM, Tu PF. 2005. Isolation and characterization of alpha-(1-->6)-glukany zCistanchedeserticola. J Asian Nat Prod Res 7: 823–828.
Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. 1998. Hepatoprotektivní aktivita fenylethanoidů zCistanchedeserticola. Planta Med 64: 120–125.
Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. 1996. Antioxidační účinky fenylethanoidů zCistanchedeserticola. Biol Pharm Bull 19: 1580–1585.