Jak hrají fenylethanoidní glykosidy, aktivní složka Cistanche, neuroprotektivní roli?

Xue Gong†a, Yan Xu†b, Kai Renc, Xiaorong Baid, Chunhong Zhanga

ABSTRAKTNÍV této studii jsme izolovali osmfenylethanoidglykosidyz Paraboea martini poprvé a vyhodnotili mechanismus, který je jejich základemneuroprotektivníefektyproti poškození vyvolanému H2O2- v buňkách PC12. Pro screening byla použita metoda MTSfenylethanoidglykosidypro ochranné schopnosti. Dále byly použity qRT-PCR a analýza western blotting k detekci úrovní transkripce HO-1 a GCLC, které jsou regulovány Nrf2. Inhibitor ZnPP byl použit k analýze zapojení Nrf2 do exprese HO-1. Analýzy ukázaly, že caleolariosid B, parabosid B a paraboside II také upregulovaly expresi HO-1, ale neprokázaly žádný zřejmý účinek na GCLC. Předúprava ZnPP výrazně snížilaneuroprotektivníefekty. Fenylethanoidové glykosidy izolované z P. martini tedy chránily buňky PC12 před poškozením vyvolaným H2O2- pomocí upregulace H2-1. Výsledky poskytly důkaz, že P. martini může být potenciálním terapeutickým činidlem pro léčbuneurodegenerativnínemocí.

HISTORIE ČLÁNKUPřijato 8. dubna 2019 Přijato 30. července 2019

KLÍČOVÁ SLOVAParaboea martini;fenylethanoidové glykosidy; neuroprotektivní účinky; protoporfyrin zinku; HO-1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Mechanismus neuroprotektivního účinku Cistanche deserticola, klikněte zde a dozvíte se více

Je známo, že oxidační stres hraje zásadní roli v patogenezi několika chorob. Je to spojeno s etiologiíAlzheimerova choroba(AD), Parkinsonova nemoc (PD), epilepsie a další onemocnění [1–3]. V současné době bylo dosaženo trvalého pokroku ve studiu patogeneze AD, PD a dalších onemocnění. Kvůli omezeným znalostem molekulárních mechanismů, které jsou základem AD, PD a dalších onemocnění, však nebyly realizovány účinné preventivní nebo léčebné strategie pro tato onemocnění [4]. H2O2 je důležitou složkou reaktivních forem kyslíku (ROS). V souladu s tím je poškození buněk PC12 vyvolané H2O2-nejčastěji používaným modelem oxidačního stresu a je široce používáno v experimentálních studiích neuroprotektivních účinků [5]. Hemoxygenáza 1 (HO-1) a glutamát-cysteinligáza-katalytická podjednotka (GCLC) jsou důležité buněčné antioxidační enzymy a oba geny jsou regulovány downstream od jaderného faktoru erytroidního 2 (Nrf2), který se ukazuje jako slibná terapeutika cíl pro neuroprotekci [6,7].fenylethanoidglykosidy, odvozené z jednotky C-6-C-3, obsahují mnoho fenolických hydroxylových skupin a mají významné antioxidační účinky a účinky proti stárnutí. Během několika posledních let studie ukázaly, že mnoho léčivých rostlin obsahuje fenylethanoidní glykosidy, které vykazují významnou antioxidační aktivitu. Například je známo, že fenylethanoidové glykosidy odvozené z Herba cistanche mají ochranné účinky na kognitivní deficity u AD. Tato studie zkoumala související ochranný mechanismus pomocí modelu náchylné myši 8 s akcelerovanou stárnutím AD (SAMP8). Výsledky ukázaly, že schopnost fenylethanoidových glykosidů zmírňovat kognitivní deficity u myší SAMP8 může souviset s podporou synaptické plasticity zahrnující antioxidační procesy [8]. V této studii byly dva fenylethanoidní glykosidy odděleny a purifikovány z Tectona grandis (teak) dřevěných suků; tyto sloučeniny vykazovaly pozoruhodné antioxidační účinky, které byly stanoveny pomocí amperometrické metody [9]. Dále kofeoylfenylethanoidové glykosidové sloučeniny z Lindernia ruellioides vykazují in vitro antioxidační účinky závislé na dávce a vychytávání volných radikálů bez superoxidových aniontů [10]. Mechanismy účinku fenylethanoidových glykosidů souvisí s regulací signální dráhy Nrf2/ARE, která ovlivňuje syntézu SOD, CAT, GSH-PX a dalších antioxidačních enzymů [11]. Čeleď Gesneriaceae, která obsahuje 150 rodů a přibližně 3700 druhů, je primárně rozšířena v tropických a mírných oblastech východní a jižní Asie, Oceánie, Jižní Ameriky, Afriky, jižní Evropy a Mexika [12]. V Číně existuje 54 rodů a přibližně 463 druhů patřících k Gesneriaceae. Bylo hlášeno, že přibližně 100 druhů má lékařskou účinnost a většina z nich je distribuována hlavně v provinciích Guangxi a Guizhou [13]. V posledních letech se výzkum rostlin Gesneriaceae v různých oblastech světa postupně zvýšil a byly nalezeny některé nové složky s fyziologickými aktivitami [14]. Paraboea martinii (Levl.) Burtt patří do Parabola (Gesneriaceae) a je to bylina. Na základě „The Chinese Traditional Medicine Resource Records“ bylo zaznamenáno, že celá rostlina se používá jako lék. Kromě toho může vyvíjet mnoho farmakologických aktivit na stavy, jako je hematemeze, edém, úplavice, traumatické poranění a zlomeniny [15]. Bai to dokázalfenylethanoidglykosidyjsou jednou z hlavních chemických složek rostlin Gesneriaceae [16]. Někteří výzkumníci to také zjistilifenylethanoidglykosidyhave significant antioxidant activities [17]. Li demonstrated that phenylethanoid glycosides of Cistanche deserticola have significant antioxidant activity [18]. In addition, Ju systematically studied the neuroprotective activities of phenylethanoid glycosides using PC12 cell models. The results indicated that phenylethanoid glycosides significantly attenuate the damage induced by Aβ1-42 [19]. In our studies, we isolated eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) from P. martini [20]. All compounds were isolated from the genus Parabola for the first time, and the compounds paraboside A, paraboside B, p paraboside I, paraboside II, and paraboside III were new compounds [20]. In a continuing search for molecules with antioxidant properties, phenylpropanoid glycosides were examined. However, whether these phenylpropanoid glycosides from P. martini could protect against H2O2-induced PC12 cell injury was previously unclear. In this study, we examined the protective effects of phenylpropanoid glycosides on H2O2-induced damage to PC12 cells. We also examined the effects and preliminary mechanism underlying the activity of phenylpropanoid glycosides with respect to the activation of HO-1 and GCLC in vitro. Materials and methods Materials Paraboea martini (Level.) Burtt was collected from Daxin County, Guangxi Autonomous Region in August 2014 and verified by Dr. Minhui Li (Baotou Medical College). Voucher specimens were deposited at the Laboratory of Pharmacognosy and Phytochemistry. Eight phenylpropanoid glycosides (paraboside A, paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B, isonuomioside A) were extracted and separated from P. martinii (Levl.) Burtt by prof. Xiaoqin Wang [20]. The purity (>98 procent) osmi fenylpropanoidových glykosidů bylo měřeno metodou normalizace plochy píku HPLC. Jako příklad jsou na obr. 1 uvedeny chromatografické diagramy parabosidu B a parabosidu II a jejich relativní obsah byl zjištěn jako 98,23 procent a 99,20 procent, v daném pořadí. Špatně diferencovaná buněčná linie krysího adrenálního feochromocytomu (PC12) byla zakoupena od Cell Bank při Čínské akademii věd (Shanghai, Čína). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM) a koňské sérum byly zakoupeny od Gibco (Gaithersburg, MD, USA). Fetální bovinní sérum (FBS) bylo zakoupeno od Thermo Fisher Scientific (Hyclone, Waltham, MA, USA). H202 byl získán od Tianjin Fu Yu Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Čína). Trizol byl zakoupen od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Souprava činidel PrimeScriptTM RT (Perfect Real Time) byla získána od společnosti TaKaRa Biotechnology Co. (Dalian, Čína). Primery pro HO-1, GCLC a GAPDH byly syntetizovány společností Sangon Biotech (Shanghai, Čína). Kit CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (MTS) byl získán od Promega Corp. (Madison, USA). Inhibitory HO-1 protoporfyrinu zinku (ZnPP) byly zakoupeny od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Byl také použit inkubátor Thermo311 CO2 (Thermo, USA), termocyklický blok StepOnePlusTM Real-Time PCR Instrument (Thermo), Thermo Scientific Multiskan FC (Thermo) a xCELLigence RTCA DPlus Analyzer a E-Plate 16 (ACEA Biosciences, USA). .

Buněčná kultura a léčba

Buňky PC12 byly pěstovány v DMEM obsahujícím 5 procent FBS a 5 procent koňského séra při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2. Buňky PC12 byly rozděleny do tří skupin následovně: kontrolní skupina, modelová skupina a léčebná skupina. Osm fenylpropanoidových glykosidů bylo rozpuštěno v DMSO (< 0.01%)="" and="" then="" diluted="" with="" a="" complete="" culture="" medium.="" to="" study="" the="" effects="" of="" the="" eight="" phenylpropanoid="" glycosides="" on="" h2="" o2-induced="" cell="" injury,="" pc12="" cells="" were="" cultured="" with="" the="" eight="" compounds="" at="" concentrations="" of="" 3.125,="" 6.25,="" 12.5,="" 25,="" and="" 50="" μm="" for="" 12="">

Stanovení H2O2

Stanovili jsme vhodnou koncentraci H202 pomocí buněčné analýzy v reálném čase (RTCA). Buňky PC12 byly nasazeny na mikrodestičku CIM-plate-16 v objemu 100 ul a poté inkubovány po dobu 12 hodin při 37 stupních v atmosféře 5 procent CO2. Buňky PC12 byly rozděleny do kontrolní a modelové skupiny. Dále bylo do modelových skupin přidáno 10 μl H2O2 (50, 100, 200 a 400 μM) a kontrolní skupiny byly ošetřeny 10 μl kompletního DMEM, připraveného ve třech komplexních jamkách. E-Plate 16 byla umístěna do xCELLigence RTCA, monitorována každých 15 minut a výsledky byly zaznamenávány po dobu 32 hodin. Účinek H202 na buňky PC12 byl analyzován pomocí softwaru pro analýzu dat xCELLigence RTCA. Hodnota buněčného indexu (CI) byla použita ke stanovení optimální koncentrace H2O2 a trvání účinku.

Extrakce a izolace sloučenin

Frakce byly separovány na základě jejich polarity za použití dříve popsaných metod. Na vzduchu sušená prášková P. martinii (4 kg) byla postupně třikrát extrahována 75% vodným roztokem ethanolu [20]. Získané extrakty se poté koncentrovaly na rotační odparce, aby se odstranil ethanol, a získaly se surové extrakty. Vzorky byly rozpuštěny v deionizované vodě a poté postupně extrahovány petroletherem, ethylacetátem, n-butanolem a vodou. Extrakt n-butanolu (400 g) byl frakcionován pomocí kolony s makroporézní pryskyřicí AB-8 a roztoku ethanol-H2O2 (0, 1{{47} }, 30, 50, 70 a 95 procent). Nakonec bylo získáno šest frakcí (frakce 1–6). Frakce 3 a 4 byly podrobeny separaci pomocí MCI kolony se stupňovitým gradientem MeOH-H202 (10–100 procent). Dále byly produkty izolovány za použití Sephadexu LH-20 s 50 procenty MeOH jako eluentu. Sloučeniny 1 (41,0 mg) a 6 (15,6 mg) byly izolovány z frakce 3. Sloučeniny 2 (62,0 mg), 3 (34,7 mg), 7 (11,0 mg) a 8 (26,0 mg) byly získány z frakce 4 pomocí Sephadexu LH-20 chromatografie s 50 procenty MeOH jako eluentem. Finální izolace byly provedeny semipreparativní HPLC s reverzní fází (Merck LiChrosorb, RP-18, RP-18, 250 × 10 mm) s 50% MeOH a UV detekcí při 280 nm za získání sloučenin 4 (39,0 mg) a 5 (9,0 mg) [20].

Test životaschopnosti buněk

Buňky PC12 byly nasazeny na 96-jamkové destičky v hustotě 2 × 1{{10}}4 buňky/jamka v konečném objemu 100 µL . Buňky PC12 byly inkubovány při 37 stupních s 5 procenty CO2 po dobu 12 hodin. Dále byly buňky ošetřeny různými koncentracemi surových extraktů (0,025, 0,05, 0,1, 0,2 a 0,4 mg/ml) a sloučeninami 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 v pěti koncentracích (3,125, 6,25, 12,5, 25 a 50 uM). Po předběžném ošetření po dobu 24 hodin byla buněčná životaschopnost stanovena pomocí MTS testů. Buňky PC12 byly preinkubovány s inhibitorem HO-1 nebo bez něj bez ZnPP (15 μM) po dobu 30 minut, poté inkubovány s nebo bez kaleolariosidu B, parabosidem B a parabosidem II (3,125 μM) po dobu 12 hodin a nakonec inkubovány se 400 μM H2O2 dalších 6 hodin. Po ošetření byl počet přežívajících buněk stanoven pomocí testu MTS [6].

Ochranné účinky surových extraktů a monomerních sloučenin na buňky PC12 ošetřené H2O2-

Buňky byly kultivovány v {{0}}jamkové destičce v konečném objemu 100 µL. K ošetřené skupině byla přidána sériová ředění surových extraktů (0.025, 0,05, 0,1, 0,2 a 0,4 mg/ml). Po předúpravě po dobu 12 hodin bylo do každé jamky přidáno 400 uM roztoku H2O2 (optimální koncentrace) na dobu 6 hodin. Potom byl do každé jamky přidán roztok MTS a destičky byly inkubovány po dobu 3 hodin při teplotě 37 °C. Destičky byly oscilovány nízkou rychlostí po dobu 5 minut při teplotě místnosti, dokud nebyly všechny krystaly zcela rozpuštěny. Ochrana buněk byla stanovena na základě výsledků testu MTS podle 2204 X. GONG ET AL. Staženo z https://academic.oup.com/bbb/article/83/12/2202/6044145 hostem dne 27. srpna 2021pokyny. Optická hustota byla stanovena při vlnové délce absorbance 490 nm. Dále jsme sledovali aktivitu sloučenin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 izolovaných z frakcí 3 a 4. Sériová ředění sloučenin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 (3,125, 6,25, 12,5, 25 a 50 uM) byly přidány do ošetřené skupiny, aby se určily jejich příslušné ochranné účinky na H2O2-indukované buňky PC12.

Kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR)

Buňky PC12 byly sklizeny 12 hodin po ošetření 3,125 uM kaleolariosidu B, parabosidem B a parabosidem II. Celková RNA byla extrahována pomocí TRIzol-reagent a alikvoty celkové RNA byly reverzně transkribovány pomocí Primescript RT Master Kit podle pokynů výrobce. V souladu s předchozí zprávou byly pro experimenty použity následující primery [21]. HO-1: vpřed 5′ -GC CTGCTAGCCTGGTTCAAG-3′, vzad 5′ -AGC GGTGTCTGGGATGAACTA-3′; GCLC: vpřed 5′ - GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3′, vzad 5′ -TG TTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3′; GAPDH: Vpřed 5′-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3′, vzad 5′- GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3′. Alikvoty získaných cDNA byly poté amplifikovány pomocí PCR. Reakční podmínky byly následující: počáteční denaturace při 95 stupních (30 s), následovaná 40 cykly při 95 stupních (5 s), 60 stupních (34 s) a 72 stupních (35 s). Všechny primery byly testovány a byl detekován fluorescenční signál FL; poté byla vypočtena hodnota △Ct a relativní hodnoty byly porovnány s hodnotami kontrolní skupiny pomocí následující rovnice: △Ct=Ct (vzorek) − Ct (endogenní kontrola), △△Ct {{36} } △Ct (vzorek) −△Ct (neošetřené) a změna skládání=2−△△Ct. Glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) byla použita jako vnitřní kontrola.

Extrakce bílkovin

Buňky PC12 byly nasazeny na 100-mm misky v množství 1 x 107 buněk/misku. Po připojení byly buňky ošetřeny caleolariosidem B, parabosidem B a parabosidem II (3,125 uM) po dobu 12 hodin. Glykosidy byly poté odstraněny a buňky byly inkubovány s H202 dalších 6 hodin. Po inkubaci byly buňky dvakrát promyty studeným PBS a seškrábnuty z misek 1 ml PBS. Buněčné homogenáty byly centrifugovány při 1500 rpm po dobu 10 minut. Po ošetření byly buněčné proteiny extrahovány pomocí Beyotime RIPA buněčného lyzačního pufru s 1 mM PMSF podle pokynů výrobce. Kromě toho byly izolovány cytoplazmatické a jaderné proteiny, jak je popsáno v protokolu soupravy pro jadernou a cytoplazmatickou extrakci Beyotime. Koncentrace proteinů ve vzorcích byly detekovány pomocí soupravy pro stanovení proteinů Beyotime BCA a všechny vzorky byly skladovány při teplotě -80 stupňů pro analýzu westernovým přenosem [6].

Western blot analýza

Po extrakci a následné denaturaci celkového proteinu z různých skupin byla provedena elektroforéza SDS-PAGE. Po elektroforéze byl protein přenesen na PVDF membrány, které byly poté blokovány 5% sušeným odstředěným mlékem po dobu 4 hodin. Po promytí primární protilátka (králičí polyklonální protilátka GAPDH (ředění 1:10,000), králičí polyklonální protilátka HO-1 (ředění 1:1000) nebo králičí polyklonální protilátka GCLC (ředění 1:1000) byla přidána k membránám, které byly inkubovány přes noc při 4 stupních. Následující den byly PVDF membrány promyty třikrát v TTBS. Dále byla přidána sekundární protilátka (konjugovaná afinita čistá kozí anti-králičí IgG (ředění 1:1000) značená křenem peroxidáza byla přidána k membránám, které byly poté inkubovány při pokojové teplotě po dobu 2 h. PVDF membrány byly promyty a podrobeny ECL chemiluminiscenčnímu detekčnímu činidlu pro signalizaci expozice na rentgenovém filmu, který byl poté fixován a skenován [22].

Statistická analýza

Data byla analyzována pomocí SPSS 19.0 a výsledky jsou prezentovány jako průměr se standardní odchylkou (SD) ze tří nezávislých experimentů. Hodnoty p < 0,05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="" významné="">

Výsledky Sestavení modelu H2O2

Jak je znázorněno na obrázku 2, H2O2 při 50, 100 a 200 μM nezpůsobil odpovídající úroveň buněčné smrti. 400 μM H2O2 však působilo na buňky PC12 během 2–6 hodin a oxidační poškození buněk mělo tendenci být stabilní. Proto jsme se domnívali, že indukce H2O2 v koncentraci 400 μM po dobu 6 hodin byla vhodná pro napodobení poškození buněk PC12 vyvolané oxidačním stresem.

Ochranné účinky surových extraktů na buňky PC12 ošetřené H2O2

Ve srovnání s modelovou skupinou H2O2 (obrázek 3), n-butanolový extrakt v koncentracích 0.05, 0.1, {{10} },2 a 0,4 mg/ml významně zlepšily oxidační poškození buněk PC12 vyvolané H2O2 (p < 0.05)="" v="" závislosti="" na="" koncentraci.="" tato="" data="" naznačují,="" že="" n-butanolová="" frakce="" obsahuje="" silnější="" ochrannou="" aktivitu.="" extrakty="" z="" petroletheru="" a="" ethylacetátu="" však="" vykazovaly="" ochrannou="" aktivitu="" pouze="" při="" vysokých="" koncentracích="" (petrolether:="" 0,1="" a="" 0,2="" mg/ml,="" p="">< 0.{{31}="" }5,="" ethylacetát:="" 0,2="" a="" 0,4="" mg/ml,="" p="">< 0,05).="" kromě="" toho="" různé="" koncentrace="" extraktů="" vodné="" fáze="" nevykazovaly="" žádné="" ochranné="" účinky="" (p=""> 0,05). Dále jsme do doplňkového souboru přidali data z validační studie s použitím buněčných linií lidských neuroblastomů SH-SY5Y (SH-SY5Y). Ošetření 250 uM H2O2 vedlo ke snížení životaschopnosti buněk; nicméně léčba kaleolariosidem B, parabosidem B a parabosidem II (3,125, 6,25, 12,5, 25 a 50 uM) významně zmírnila buněčnou smrt SH-SY5Y. Výsledky experimentu prokázaly, že caleolariosid B, paraboside B a paraboside II chránily buňky SHSY5Y před poškozením buněk vyvolaným H2O2-.

Struktury sloučenin izolovaných z n-butanolové frakce

Abychom potvrdili, že n-butanolový extrakt obsahuje aktivní složky, dále jsme frakcionovali osm sloučenin z extrakce. Struktury sloučenin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 a 8 byly identifikovány pomocí různých spektrálních dat (1H-NMR, 13C-NMR a ESI-MS) na základě srovnání s publikovanými daty pro parabosid A , paraboside B, paraboside I, paraboside II, paraboside III, nuomioside A, caleolarioside B a isonuomioside, v tomto pořadí [20]. Například data pro parabosid B byla následující: hnědá guma; ½ 20 D -55,7 (c 0,05, CH30H) [20]; UVMeOH max nm (loge): 220 (3,61), 291 (3,54), 330 (3,66) [20]; IRKBr max cm-1: 3392, 2943, 2885, 1699, 1683, 1606, 1521, 1361, 1282, 1163, 1114, 1039, 995, 817 cm-1 [20]; pro 'H a13C NMR spektroskopická podrobná data uvedená v odkazu 20; HR-ESI-MS (negativní) m/z 741,2231 [MH]- (vypočteno pro C33H41O19, 741,2242) [20]. Data pro parabosid II byla následující: bílé prášky amorphous; 1/2 20 D -80,5 (c 0,05, CH3OH) [20]; UVMeOH max nm (loge): 229 (3,74), 322 (3,73) [20]; IRKBr max cm-1: 3419, 1699, 1625, 1596, 1515, 1456, 1419, 1263, 1159, 1139, 1068, 1022, 808 cm-1 [20]; pro 'H a13C NMR spektroskopická podrobná data uvedená v odkazu 20; ESI-MS (negativní) m/z 637

Ochranné účinky izolovaných sloučenin proti toxicitě vyvolané H202-v buňkách PC12

Testy MTS byly použity ke zkoumání účinku izolovaných sloučenin na životaschopnost buněk PC12 vystavených toxicitě vyvolané H2O2-. Jak je znázorněno na obrázku 5, v porovnání s kontrolní skupinou byly buňky PC12 předem ošetřeny pěti různými koncentracemi kaleolariosidu B, parabosidu B, parabosidu II nebo parabosidu A (3,125, 6,25, 12,5, 25 a 50 μM) po dobu 24 hodin nevykazovaly žádné významné rozdíly v životaschopnosti buněk (p > 0,05). Předběžné ošetření buněk PC12 kaleolariosidem B, parabosidem B a parabosidem II tedy nevedlo k žádné cytotoxicitě. Jak je znázorněno na obrázku 6, 400 uM H202 významně snížilo životaschopnost buněk ve srovnání s kontrolní skupinou. Kromě toho se buněčná životaschopnost buněk PC12 ošetřených H2O2- výrazně zvýšila po předběžném ošetření buněk PC12 různými koncentracemi kaleolariosidu B, parabosidu B a parabosidu II; kromě toho byla životaschopnost buněk nejvyšší po ošetření 50 uM kaleolariosidu B, 50 uM parabosidu B a 12,5 uM parabosidu II. Dalších pět sloučenin nevykazovalo žádné významné ochranné účinky na buňky PC12 ošetřené H2O2-. Abychom ilustrovali toto zjištění, diskutujeme o jednom z nich jako o příkladu, zatímco ostatní nejsou v rukopise popsány.

Úrovně transkripce HO-1 a GCLC

Dále jsme testovali transkripční hladiny HO-1 a GCLC v buňkách PC12 ošetřených kaleolariosidem B, parabosidem B a parabosidem II. Celková mRNA byla sbírána z ošetřených a neošetřených buněk PC12 po dobu 12 hodin a poté byla podrobena expresní analýze pomocí qRT-PCR. Jak je znázorněno na obrázku 7(a,c,e), transkripční hladiny HO-1 významně vzrostly po

Buňky PC12 byly předem ošetřeny uvedenými koncentracemi kaleolariosidu B, parabosidu B a parabosidu II po dobu 12 hodin (p < 0.{{10}}5).="" jak="" je="" znázorněno="" na="" obrázku="" 7(b),="" transkripční="" hladiny="" gclc="" se="" také="" významně="" zvýšily="" v="" buňkách="" pc12="" předem="" ošetřených="" uvedenými="" koncentracemi="" kaleolariosidu="" b="" po="" dobu="" 12="" hodin.="" hladiny="" gclc="" v="" buňkách="" pc12="" předem="" ošetřených="" parabosidem="" b="" po="" dobu="" 12="" hodin="" však="" významně="" poklesly="" ve="" srovnání="" s="" hladinami="" v="" modelové="" skupině="" (p="">< 0,05;="" obrázek="" 7(d)).="" kromě="" toho="" se="" při="" léčbě="" parabosidem="" ii="" hladiny="" gclc="" v="" buňkách="" pc12="" významně="" nelišily="" ve="" srovnání="" s="" hladinami="" v="" modelové="" skupině="" (p=""> 0,05; obrázek 7(f)).

Exprese HO-1 a GCLC

HO{{0}} a GCLC jsou důležité buněčné antioxidační enzymy a oba jsou Nrf2-regulované downstream geny. Po léčbě byla také pozorována proteinová exprese HO-1 a GCLC [6]. Obrázek 8 ukazuje hladiny proteinu HO-1 a GCLC v buňkách PC12 po ošetření 400 uM H2O2; výsledky ukázaly, že fluorescenční intenzity FL HO-1 ve skupinách s kaleolariosidem B a parabosidem B byly vyšší než ve skupinách léčených H2O2- (obrázek 8(a,c)). Exprese GCLC však nebyla sloučeninami významně změněna, s výjimkou kaleolariosidu B (obrázek 8(b)). Dále byly použity chemické inhibitory HO-1 k dalšímu hodnocení rolí antioxidačních enzymů při regulaci ochranných účinků vyvolaných kaleolariosidem B, parabosidem B nebo parabosidem II proti cytotoxicitě vyvolané H2O2-. Kaleolariosid B, parabosid B a parabosid II (3,125 µM) zabránily H2O2-indukované cytotoxicitě, ale tyto ochranné účinky byly zvráceny inhibitorem HO-1 ZnPP (p < 0,01)="" při="" 15="" µm="" (obrázek="" 8="">

Diskuse

Stárnutí populace je vážný celosvětový problém. Mnoho nemocí souvisí se senilitou, jako je AD a PD, které vážně ohrožují veřejné zdraví. AD a PD se ukázaly jako třetí nejsmrtelnější onemocnění na světě, po kardiovaskulárních onemocněních a rakovině. Proto se neurodegenerace stala celosvětově naléhavým výzkumným tématem. Patogeneze AD a PD, neurodegenerativních onemocnění centrálního nervového systému, však dodnes zůstává nejasná. Kromě toho existuje jen několik léků, které mohou účinně léčit AD nebo PD kvůli jejich komplexním patogenním mechanismům [23]. Předchozí studie ukázaly, že ROS, jako je superoxidový anion (O2−) a H2O2, jsou hlavními faktory přispívajícími k neurodegenerativním onemocněním. Patologické změny během PD zahrnují neuronální degeneraci a smrt substantia nigra a striatálního dopaminu [24,25]. V souladu s tím je důležité vyvinout účinná antioxidační léčiva k léčbě PD a objev těchto léčiv se stal důležitým směrem výzkumu [26]. V současnosti se signální dráha Nrf2/ARE jeví jako nejdůležitější endogenní dráha antioxidačního stresu [27]. ARE se nacházejí v 5′- přilehlých oblastech genů, jako jsou HO-1 a GCLC [28,29]. HO-1 a GCLC jsou geny související s Nrf{15}}, které jsou regulovány downstream od tohoto proteinu [6]. ARE mohou následně ovlivnit hladiny antioxidantů a aktivovat downstream expresi HO-1 a dalších ochranných genů, což by mohlo zvýšit aktivity ochrany buněk [30,31]. Kromě toho zjištění naznačují, že k ochranným účinkům resveratrolu proti toxicitě indukované A 1-42- v buňkách PC12 dochází prostřednictvím upregulace exprese HO-1 prostřednictvím aktivace intracelulární signální dráhy Nrf2 [32].

Buňky PC12 jsou uznávaným modelem nervových buněk a jsou široce používány ve studiích neuroprotektivního účinku [33]. H2O2 může snadno procházet buněčnou membránou a spojovat se se železem za vzniku vysoce aktivních volných radikálů, které vyvolávají oxidační stres a poškození buněk [34]. H2O2 je důležitý ROS a volné radikály se snadno generují a jsou relativně stabilní, proto se obvykle používají k vytvoření modelu oxidačního stresu pomocí buněk PC12 [5]. V této studii předběžné ošetření buněk PC12 netoxickými koncentracemi rostlinného extraktu chránilo buňky před H2O2-indukovanou cytotoxicitou snížením tvorby ROS. Fenylethanoidové glykosidy obsahují mnoho fenolických hydroxylových skupin, které mají antioxidační a antiagingové aktivity. V této studii jsme zjistili, že extrakce n-butanolem poskytuje lepší ochranu než jiné frakce s polaritou (obrázek 3). Dále jsme tedy zkoumali ochranné aktivity osmi sloučenin izolovaných z n-butanolové frakce. Výsledky poprvé ukázaly, že Obrázek 8. Analýza hladin proteinu HO-1 a GCLC na buňkách PC12. (a) Analýza exprese HO-1 a GCLC a GAPDH byla použita jako kontrola nanášení. (b) Analýza Western blot Exprese proteinu GCLC. (c) Analýza Western blot exprese proteinu HO{{20}}. (d) HO-1 inhibitor ZnPP snížil neuroprotektivní účinek. Data jsou uvedena jako průměr ± SD, n=3. ***p < 0.001="" versus="" kontrolní="" skupina;="" #p="">< 0.05="" versus="" skupina="" h2o2="" (bez="" ošetření="" znpp),="" ##p="">< 0,01="" versus="" skupina="" h2o2="" (bez="" ošetření="" znpp),="" ###p="">< 0,001="" versus="" skupina="" h2o2="" (bez="" znpp="" ošetřené);="" a="" p="">< 0,01="" oproti="" skupině="" h202="" (s="" ošetřením="" znpp)="" a="" &p="">< 0,001="" proti="" skupině="" h202="" (s="" ošetřením="" znpp).="" (kontrolní="" skupina;="" modelová="" skupina:="" h2o2;="" znpp="" negativní="" skupina:="" caleolariosid="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2;="" znpp="" pozitivní="" skupina:="" znpp="" plus="" kaleolariosid="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" b="" plus="" h2o2,="" znpp="" plus="" paraboside="" ii="" plus="" h2o2).="" 2210="" x.="" gong="" a="" kol.="" staženo="" hostem="" 27.="" srpna="" 2021kaleolariosid="" b,="" paraboside="" b="" a="" paraboside="" ii="" mají="" významné="" ochranné="" účinky="" proti="" oxidativnímu="" poškození="" buněk="" pc12="" vyvolanému="" h2o2-.="" výsledky="" také="" ukázaly,="" že="" léčba="" h2o2="" vyvolala="" významné="" poškození="" buněk="" pc12="" a="" snížila="" životaschopnost="" buněk,="" zatímco="" léčba="" kaleolariosidem="" b,="" parabosidem="" b="" a="" parabosidem="" ii="" tyto="" účinky="" významně="" zmírnila="" (obrázek="" 6).="" předchozí="" studie="" uvedla,="" že="" dráha="" nrf2/are="" je="" jednou="" z="" nejdůležitějších="" endogenních="" antioxidačních="" drah="" a="" může="" zvýšit="" expresi="" downstream="" markerů,="" jako="" je="" ho-1,="" aby="" chránila="" buňky="" [7].="" výsledky="" qrt-pcr="" a="" analýzy="" western="" blotting="" ukázaly,="" že="" kaleolariosid="" b,="" parabosid="" b="" a="" parabosid="" ii="" významně="" zvýšily="" hladiny="" ho-1.="" nicméně="" transkripční="" hladiny="" gclc="" významně="" vzrostly="" u="" buněk="" pc12="" předem="" ošetřených="" kaleolariosidem="" b,="" ale="" snížily="" se="" u="" buněk="" předem="" ošetřených="" parabosidem="" b="" ve="" srovnání="" s="" těmi="" v="" modelové="" skupině.="" dále="" arabinosid="" ii="" nezměnil="" expresi="" tohoto="" markeru="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" (obrázky="" 7="" a="" 8(a–c)).="" kromě="" toho="" ochranné="" účinky="" kaleolariosidu="" b,="" parabosidu="" b="" a="" parabosidu="" ii="" proti="" poškození="" buněk="" pc12="" vyvolanému="" h2o2-="" byly="" zvráceny="" inhibitorem="" ho-1="" znpp="" (obrázek="" 8(d)).="" závěrem="" lze="" říci,="" že="" fenylethanoidní="" glykosidy="" caleo="" lariosid="" b,="" arabinosid="" b="" a="" paraboside="" ii="" účinně="" chránily="" buňky="" pc12="" před="" oxidačním="" poškozením="" vyvolaným="" h2o2-.="" v="" souladu="" s="" tím="" mohou="" tyto="" sloučeniny="" izolované="" z="" p.="" martini="" představovat="" potenciální="" lékové="" kandidáty="" pro="" léčbu="" neurodegenerativních="">

Autorské příspěvkyLM a ZC vymyslely a navrhly experimenty. GX, RK a BX provedly experimenty. GX a XY psali papír. GX, XY, RK, BX, ZC a LM diskutovali o výsledcích, komentovali rukopis. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.

Prohlášení o zveřejněníAutoři neuvedli žádný potenciální střet zájmů. Financování Tato práce byla podpořena výzkumnými fondy Baotou Medical College [číslo grantu: BYJJ-YF 201727] a speciální dotací veřejné zdravotní služby čínské medicíny v roce 2018 „čtvrtý průzkum o čínském zdroji materia medica“ [číslo grantu: Finance Society [2018 ] 43].

Reference

[1] Butterfield DA. Perspektivy oxidačního stresu u Alzheimerovy choroby a předpovědi budoucích výzkumných důrazů. J Alzheimers Dis. 2018;64:1–11.

[2] Chignon C, Tomas M, Bonnefontrousselot D, et al. Oxidační stres a amyloid-beta peptid u Alzheimerovy choroby. Redox Biol. 2018;14:450–464.

[3] Guo JD, Zhao X, Li Y a kol. Poškození dopaminergních neuronů oxidativním stresem u Parkinsonovy choroby (přehled). Int J Mol Med. 2018;41:1817–1825.

[4] Bai Y, Dong LH, Huang XH a kol. Asociace polymorfismů rs823128, rs1572931 a rs823156 se sníženým rizikem Parkinsonovy choroby. Neuroreport. 2017;27:936–941.

[5] Han XH, Zhu SL, Wang BX a kol. Antioxidační účinek 7,8-dihydroxyflflavonu chrání buňky PC12 před 6-hydroxydopaminem indukovanou cytotoxicitou. Neurochem Int. 2014;64:18–23.

[6] Li MQ, Xu T, Zhou F, a kol. Neuroprotektivní účinky čtyř fenylethanoidových glykosidů na H2O2-indukovanou apoptózu na buňkách PC12 prostřednictvím dráhy Nrf2/ARE. Int J Mol Sci. 2018;19:1135.

[7] Buendia I, Michalska P, Navarro E, et al. Dráha Nrf2-ARE: vznikající cíl proti oxidativnímu stresu a neurozánětům u neurodegenerativních onemocnění. Pharmacol Therapeut. 2016;157:84–104.

[8] Jia XJ, Yan XS, Cai ZP a kol. Účinky fenylethanoidových glykosidů pocházejících z Herba cistanche na kognitivní deficity a antioxidační aktivity u samců myší SAMP8. J Toxicol Env Heal A. 2017;80:1180–1186.

[9] Tsvetkov DE, Dmitrenok AS, Tsvetkov YE, et al. Fenylethanoidové glykosidy ze suků teakového dřeva a jejich antioxidační aktivita. J Biol Active Prod Nat. 2016;6:272–281.

[10] Zhang YQ, Gao EY, Liang CQ a kol. Antioxidační aktivita caffeoyl fenylethanoidových glykosidových sloučenin z Lindernia ruellioides in vitro. Cent South Pharm. 2017;15:1687–1690.

[11] Wu ZH, Ma YF, Zhao L, a kol. Role dráhy Nrf2-ARE při poškození oxidativním stresem a její vztah k dalším signálním drahám. Anim Husbandry Feed Sci. 2016;37:42–48.

[12] Zheng XK, Li J, Feng WS a kol. Pokroky ve studiu Gesneriaceae. Chin J New Drug. 2003;12:261–263.

[13] Wen F, Li ZD. Pokrok ve výzkumu na rostlině Gesneriaceae. Chin Wild Plant Resour. 2006;25:1–6.

[14] Yan WY, Chen L., Wang JM a kol. Průběh výzkumu triterpenoidů rostlin Gesneriaceae. Nat Prod Res Dev. 2012;24:698–701.

[15] Čínská společnost zabývající se rostlinnou medicínou. Záznamy zdrojů čínské tradiční medicíny. Čína: Science Press; 1994.

[16] Bai ZF, Wang XQ, Xiao PG a kol. Distribuce fenylethanoidních glykosidů v léčivých rostlinách Gesneriaceae. Chin J Chin Mater Med. 2013;38:4267–4270.

[17] He ZD, Lau KM, Xu HX a kol. Antioxidační aktivita fenylethanoidových glykosidů z Brandisia hancei. J Ethnopharmacol. 2000;71:483–486.

[18] Li L, Shi DF, Gui YG a kol. Studie antioxidačních aktivit fenylethanoidních glykosidů z Cistanche deserticola. J Anhui Agri Sci. 2009;32:15835–15836.

[19] Ju BW, Yang JH, Yan Y, a kol. Ochranné účinky glykosidů cistanche na poškození buněk PC12 PARABOLA MARTINI OCHRANA BUNĚK PC12 PŘED H2O2-INDUCED INJURY 2211