Jak může Cistanche pomoci zdraví kostí?

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

[Abstraktní]Objektivní:Studovat směrovou diferenciaci mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně (MSC) indukované tradiční čínskou medicínou tonizující ledviny a vypracovat teorii „ledviny řídí kost a dřeň“. Metoda: Tekutina tradiční čínské medicíny

Cistancheechinakosidmůže ulevitosteoporóza

SD potkanům byly intragastricky podávány po dobu 4 dnů a poté byla odebrána krev z abdominální aorty pro přípravu medikovaného séra. M SC 4. generace byly naočkovány do dvou 6-jamkových destiček při 5×106, každá se 6 jamkami, rozdělených do slepých skupin,

skupina Morinda officinalis, skupina eucommia ulmoides, skupina psoralen,cistancheskupina, skupina epimedium. Když buňky narostou na 80 procent, ke každé skupině tradiční čínské medicíny se přidá sérové ​​médium LDM EM obsahující lék a pokračuje se v kultivaci původního média slepé skupiny; 10. den indukce se vyjme 6-jamková destička pro barvení ALP; druhý je 6-dobře 20. den Obarvený alizarinovou červení. Výsledky: skupina Morinda officinalis, skupina Eucommia ulmoides,Cistancheskupina Epimedium vykazovala pozitivní barvení ALP 10. den, bílé kalciové uzliny byly pozorovány kolem 14. dne a barvení alizarinovou červení bylo pozitivní 20. den. Závěr: „Ledviny

Vedena teorií "hlavní kosti a dřeně", může čínská medicína tonizující ledviny vyvolatkostmezenchymální kmenové buňky dřeně k diferenciaci na osteoblasty.

Klíčová slova: mezenchymální kmenové buňky kostní dřeně; osteoblasty; řízená diferenciace

Tradiční čínská medicína věří, že ledviny dominujíkostiskladovat esenci a vyrábět dřeň. Klinické i experimentální studie potvrdily klinický vůdčí význam této teorie, ale nebyl proveden žádný výzkum indukce diferenciace mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně (MSC). M SC jsou druh pluripotentních dospělých kmenových buněk, které se vyskytují hlavně v kostní dřeni, ale také v extraoseálních tkáních mezenchymálního původu během embryonálního období, jako jsou kožní fibroblasty, tukové kmenové buňky, satelitní buňky kosterního svalstva a vaskulární endoteliální buňky. . M SC kostní dřeně (BM SC) jsou součástí stromatu kostní dřeně. Po izolaci a kultivaci in vitro mají za určitých indukčních podmínek schopnost diferencovat se na osteoblasty, chondrocyty, nervové buňky, adipocyty, kardiomyocyty atd. mnoha způsoby. Hlavními zdroji semenných buněk v inženýrství kostní tkáně jsou osteoblasty a BMSC. I když mají osteoblasty dobrou osteogenní aktivitu, jejich zdroj je omezený, je obtížné je izolovat a získat ve velkých množstvích a mají nedostatečný potenciál pro rozsáhlou expanzi in vitro, což je obtížné splnit potřeby klinických aplikací v inženýrství kostní tkáně; BM SC mají nejen dobrý diferenciační potenciál osteoblastů a vysoký diferenciační potenciál. Osteogenní aktivita, silný proliferační potenciál a vhodný zdroj mohou uspokojit autologní tkáňové inženýrství.

Cistancheechinakosidumí léčitosteoporóza

1 Materiál a metody

1.1 Materiál

1.1.1 Pokusná zvířata

Dvanáct SPF SD potkanů ​​o hmotnosti 120 g ~ 150 g není omezeno na samce a samice, které poskytlo Experimentální centrum Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine.

1.1.2 Reagencie a vybavení Haiclone L-DM EM médium, Haiclone jihoamerické fetální bovinní sérum (FBS), Morinda officinalis, Psoralen, Eucommia, Cistanche, Epimedium čínský léčivý prášek, DM SO (sigma), alizarinová červeň (Guangzhou Weijia), barvivo alkalické fosfatázy (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), 0,25 procent pankreatinu (společnost GI BCO). 0.22μm injekční filtr (MI LL Ipo re), kultivační baňka 75 cm2, 96-jamková destička, 6-jamková destička (corning). Rotační odparka, čtečka mikrodestiček (Thermo), chlazená centrifuga (sigma 3K 15), CO2 inkubátor (firma SH ELDO NA).

1.2 Metoda

1.2.1 Příprava séra obsahujícího tradiční čínskou medicínu

Vezměte 150 g surového čínského léčivého prášku, přidejte 10násobné množství 70% ethanolu, zahřejte dvakrát pod zpětným chladičem, pokaždé 1 h, zfiltrujte, filtrát spojte, filtrát zahustěte za sníženého tlaku na 300 ml, ochlaďte při pokojové teplotě a uložte do lednice při teplotě 4 stupňů pro pozdější použití. Zřeďte kapalinu tradiční čínské medicíny na 0,3 g surového léčiva/ml a sondou, pokaždé 1 ml, dvakrát denně, po nepřetržitém podávání po dobu 4 dnů se odebírá krev z břišní aorty, po precipitaci přes noc se odstřeďuje při 2500r po dobu 20 minut , seberte supernatant a jehlou Sterilizujte přes filtr a skladujte při -20 stupních.

1.2.2 Separace a kultivace MSC

Po anestezii SD potkanů ​​přes břišní dutinu byla za aseptických podmínek vyjmuta stehenní a holenní kost obou dolních končetin a byly vyčištěny měkké tkáně, konce kostí byly oříznuty ráfky, dřeňová dutina byla obnažena a 10 ml injekční stříkačka byla použita k odsátí L-DM EM obsahujícího 10 procent fetálního hovězího séra. Dřeňovou dutinu opakovaně promývejte médiem, dokud se kost nezdá bílá a nezvýší se propustnost světla. Shromážděte tekutinu na promývání dřeňové dutiny do kultivační baňky o objemu 75 cm2 a umístěte ji do inkubátoru s 5% CO2 při teplotě 37 stupňů. Vyměňte tekutinu každé 2 až 3 dny.

1.2.3 Předávání MSC

Když jsou buňky z 90 procent plné dna lahvičky, jsou štěpeny 0,25 procenty trypsinu, poté pipetovány do buněčné suspenze a pasážovány v poměru 1:3.

1.2.4 MSC indukují diferenciaci

Když jsou buňky P4 z 90 procent přerostlé, jsou štěpeny 0,25 procenty trypsinu za účelem přípravy buněčné suspenze. Buňky jsou nasazeny na 2 6-jamkové destičky s hustotou buněk 5x106 na jamku, se 6 jamkami na destičku. Rozděleno na prázdnou skupinu, skupinu Morinda officinalis, skupinu Psoralen, skupinu Eucommia ulmoides, skupinu Cistanche cistanche, skupinu epimedium. Když byly buňky z 80 procent plné dna lahvičky, médium se vyměnilo. Pokračovalo se v kultivaci původního média slepé skupiny a do skupiny s čínskou medicínou bylo přidáno 10 procent L-DM EM médium obsahující sérum obsahující čínskou medicínu.

1.2.5 Barvení alkalickou fosfatázou

10. den indukční kultivace byla vyjmuta 6-jamková destička a obarvena podle metody soupravy pro barvení alkalickou fosfatázou. Pozorujte výsledky pod mikroskopem.

1.2.6 Barvení alizarinovou červení

2. 0 den indukční kultivace vyjměte 6-jamkovou destičku, odsajte roztok pro indukci osteoblastů, promyjte 3x P BS, fixujte 95% alkoholem po dobu 10 minut, přidejte 0,1 procenta Alizarin Red-Tr is-HCl (pH 8,3), vodní lázeň 37 stupňů po dobu 30 minut, pozorujte výsledky pod mikroskopem.

Cistancheechinakosidmůže odolávat apoptóze a podporovatkostrůst

2 Výsledky

2.1 Pozorování buněčné morfologie

MSC jsou buňky podobné fibroblastům, které po připojení ke stěně tvoří fusiform (viz obrázek 1). Po přidání indukčního roztoku se buňky ve slepé skupině významně nezměnily; od 3. dne vykazovaly buňky ve skupině Morinda officinalis, skupině Eucommia ulmoides, skupině Cistanche deserticola a skupině Epimedium agregovaný růst buněk a mírně zvýšený objem buněk (viz obrázek 2), o 14 dní později byla patrná tvorba uzlíků pod zadním mikroskopem (viz obrázek 3). V buňkách psoralenové skupiny nebyla žádná zjevná změna.

2.2 Barvení alkalickou fosfatázou

10. den byla skupina Morinda officinalis, skupina Eucommia ulmoides, skupina Cistanche cistanche a skupina Epimedium obarvena alkalickou fosfatázou. Bylo vidět, že oblast buněčné agregace zfialověla a zčernala (viz obrázek 4) a buněčná disperze byla modrá (viz obrázek 5). ). Skupina s psoralenem a slepá skupina byly negativní.

2.3 Barvení alizarinovou červení

21. den skupina Morinda officinalis, skupina Eucommia ulmoides, skupina Cistanche, skupina Epimedium Alizarin Red obarvila bílou granulární hmotu na dně 6-jamkové destičky a po obarvení tmavě červenou. Skupina Jitian, skupina psoralen, skupina eucommia, skupina cistanche, skupina epimedium. Pod mikroskopem jsou v oblasti agregace buněk červené částice, což jsou kalciové noduly (obrázek 6). Skupina s psoralenem a slepá skupina byly negativní.

3 Diskuse

3.1 Příprava séra s obsahem tradiční čínské medicíny

Složení tradiční čínské medicíny je složité a je obtížné studovat každou složku. Sérová farmakologie může do jisté míry překonat interferenci nejistých faktorů, jako jsou fyzikální a chemické vlastnosti přípravků tradiční čínské medicíny, na výsledky experimentů a je relativně blízko skutečné biotransformaci léčiva v těle.

Skutečný proces. To znamená, že má dvě hlavní výhody: ①Odráží účinek biochemické transformace sloučeniny v těle;

②Překonejte přímou interferenci fyzikálních a chemických vlastností samotného léku na experimentu [1].

Jak preparát séra, tak zvířata odvozená od M SC jsou potkani SD a k přípravě séra se používají homologní zvířata, která mohou snížit imunitní odpověď způsobenou rozdíly mezi druhy a zlepšit spolehlivost experimentálních výsledků [2] s přihlédnutím k metabolismu zvířat. . Různé, vezměte váhu, způsob přeměny plochy povrchu těla k podání. Někteří lidé si myslí, že existuje mnoho enzymů, anti-Body, komplementu, cytokinů a dalších biologicky aktivních látek, které mohou mít přímý dopad na buňky, viry, patogeny a tkáně a orgány používané pro experimenty in vitro, které mohou interferovat s výsledky experimentů a ovlivňují objektivní hodnocení účinnosti léčiva. Farmakologická interference po inaktivaci séra [3]. Složky tradiční čínské medicíny jsou však složité a farmakologické účinky na organismus komplikované. Neinaktivované sérum může lépe odrážet účinky léku v těle a během experimentu nebyly pozorovány žádné cytotoxické účinky.

3.2 Indukční účinek čínské medicíny tonizující ledviny na přímou diferenciaci MSC

M SC kostní dřeně (BM SC) jsou součástí stromatu kostní dřeně. Po izolaci a kultivaci in vitro mají za určitých indukčních podmínek schopnost se mnoha způsoby diferencovat na osteoblasty, chondrocyty, neurocyty, adipocyty, kardiomyocyty atd. Experimentální studie ukázaly, že jak jednotná tradiční čínská medicína [4], tak složená čínská medicína tonizující ledviny [5] má účinek indukce MSC k diferenciaci na osteoblasty. V experimentu může pět čínských léčivých sér připravených z pěti léků, které mají účinky „tonifikace ledvin a posílení kostí a svalů“, kromě psoralenu, indukovat diferenciaci M SC na osteoblasty, ale specifický mechanismus zůstává k dalšímu studiu.

3.3 Klinický význam ledvin tonizujícího séra obsahujícího tradiční čínskou medicínu pro indukci MSC k diferenciaci na osteoblasty.

Inženýrství kostní tkáně má široké vyhlídky pro klinické aplikace a stalo se centrem výzkumu v moderní ortopedii. BM SC, jako v současnosti nejideálnější semena pro inženýrství kostní tkáně, mohou eliminovat vliv těchto interferujících faktorů na experimentální výsledky a pomoci snížit nebuněčný obsah séra. Ústředním úkolem výzkumu jeho účinku je, jak jej vyrobit za co nejjednodušších podmínek. Přímo se diferencují na osteoblasty a poté se transformují na zralé kostní buňky. V současnosti jsou běžně používanými induktory pro diferenciaci M SC na osteoblasty dexamethason, který se skládá z vitaminu C a -glycerofosfátu sodného. Klinicky má dexamethason vedlejší účinky, jako je infekce, osteonekróza a osteoporóza, a má významný inhibiční účinek na buněčnou proliferaci in vitro [6, 7], což omezí použití MSC jako induktoru in vivo po transplantaci. Čínská medicína tonizující ledviny má za následek indukci MSC, aby se diferencovaly na osteoblasty. Při dlouhodobé klinické aplikaci nebyly pozorovány toxické a vedlejší účinky čínské medicíny tonizující ledviny. Proto má jeho použití jako induktoru in vivo širokou perspektivu klinické aplikace.

Stručně řečeno, většina současného výzkumu M SC jako semenných buněk pro inženýrství kostní tkáně je stále ve fázi experimentu. V současné době se studuje, jak jednoduchými metodami získat dostatek M SC v krátkém čase a přimět je k diferenciaci na osteoblasty. Zaměřit se. Ačkoli tradiční čínské léky s účinky povzbuzení ledvin a posílení kostí a svalů mohou indukovat MSC k diferenciaci na osteoblasty, má světlou budoucnost jako induktor diferenciace MSC pro léčbu opožděného spojení, nezhojení a osteoporózy zlomenin. . Mechanismus účinku je třeba dále studovat.

Cistanche echinacosidemůže odolávat apoptóze a podporovatrůst kostí