Materiály a metody

6. Testy buněčného příjmu

Internalizace EV do buněk byla monitorována nejprve barvením LEV a SEV lipofilním DiI (MOP-D -3911) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Po ošetření buněk obarvenými EV po dobu 1, 3, 6, 12, 24 a 48 hodin bylo růstové médium odstraněno a buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem (Wako, Japonsko). Byl přidán Hoechst 33342 (Invitrogen) a buňky byly inkubovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti, aby se obarvila jádra (modrá). Nakonec byly buňky promyty PBS obsahujícím 1 procento hovězího sérového albuminu a fluorescence (červená a modrá) byla pozorována pod fluorescenčním mikroskopem (Leica Microsystems, Wetzlar, Německo). Alespoň tři pole byla vybrána a analyzována pomocí softwaru ImageJ.

7. Měření obsahu melaninu

Pro posouzení obsahu melaninu byly buňky melanomu B16BL6 nejprve naočkovány do 24-jamkových destiček (5 × 104 buněk/jamku) v objemu 500 μl. Po 24 hodinách inkubace buňkybyly ošetřeny 100 nM -MSH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) samotným nebo 50 ul LEV a SEV při 1, 5 a 10 ug/ml po dobu 48 hodin. Po ošetření byly buňky promyty PBS a poté inkubovány s 2,5% trypsinem (Gibco, Thermo Fisher Scientific) pro izolaci. Buněčné mikrokuličky byly rozpuštěny v 1n roztoku hydroxidu sodného (Sigma-Aldrich) obsahujícím 1 procento DMSO (Sigma-Aldrich) po dobu 1 hodiny při 80 stupních. Buněčné lyzáty byly přeneseny na 96-jamkovou destičku a obsah melaninu byl stanoven měřením absorbance při 405 nm pomocí enzymového markeru (BioTek). Obsah melaninu byl stanoven pomocí melaninové standardní křivky zkonstruované z 0-100 ug/ml roztoku syntetického melaninu (Sigma-Aldrich) (extracelulární vezikuly, obrázek následovně). Obsah melaninu byl vypočten srovnáním s kontrolami.

8. Test aktivity tyrosinázy

Aktivita TYR byla měřena pomocí aktivity L-DOPA oxidázy. Buňky B16BL6 byly inokulovány v -MEM médiu obsahujícím 100 nM Sigma-Aldrich -MSH (500 ul) a kultivovány v hustotě 1 x 105 buněk/jamka v 24-jamkových kultivačních destičkách. Po ošetření buněk 50 ul LEV a SEV v koncentracích 10, 50 a 100 ug/ml po dobu 24 hodin byly buňky promyty PBS a lyžovány 1% Tritonem X-100 (Sigma-Aldrich). Lyžované buňky byly inkubovány při - 80 stupni po dobu 30 minut a poté lyofilizovány a skladovány při teplotě místnosti po dobu 10 minut. Výsledné vzorky byly vyčeřeny centrifugací při 12,000 x g po dobu 15 minut, poté byly přidány 2 mg/ml L-DOPA (Sigma-Aldrich) a inkubovány při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Absorbance byla poté měřena při 490 nm pomocí enzymového markeru (BioTek). Absorbance byla poté měřena při 490 nm pomocí BioTek.

Pro získání klikněte semvýhody bělení pleti Cistancheajaké jsou účinky Cistanche tubulosa

9. Western blot analýza

Hladiny proteinu spojené s anti-melanogenní cestou byly stanoveny intracelulárně analýzou Western blot extraktů celých buněk. Objem 500 μl myších melanomových buněk B16BL6 byl naočkován do 24-jamkových destiček (1 x 105 buněk/jamku). Buňky byly lyžovány inkubací v pufru RIPA (Thermo Fisher Scientific) po dobu 20 minut v přítomnosti směsi inhibitorů proteázy (Roche, Německo) a ošetřeny 50 μl 10, 50 a 100 μg/ml EV po dobu 24 hodin. Buněčné lyzáty byly centrifugovány při 17 709 g po dobu 15 minut a koncentrace proteinu ve výsledných lyzátech byla stanovena pomocí testovací soupravy BCA (Thermo Fisher Scientific). Stejná množství proteinu (10-20 ug/vzorek) byla vložena do jamek Bolt 4-12 procent Bis-Tris Plus gelů (Invitrogen) a elektrotransferována na membrány PVDF (polyvinylidenfluorid) (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). Membrány byly promyty Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem obsahujícím 0,2 procenta (v/v) deset -20 (TBST), uzavřeny TBST obsahujícím 5 procent (w/v) odstředěného mléka (Gibco, Thermo Fisher Scientific) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté inkubovány při 4 stupních v roztoku primární protilátky zředěném 1 procentem (w/v) odstředěného mléka. Inkubace byla prováděna přes noc. Použité primární protilátky zahrnovaly anti-TRP-1 (1:1000), anti-TRP-2 (1:1000) a anti-MITF(1:1000) protilátky od Abcam, Cambridge, UK; anti-TYR (1:500) protilátky od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Pro standardizaci na úrovni proteinu byla použita anti- -aktinová protilátka (1:500; Santa Cruz). Primární protilátky byly detekovány sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidázou (HRP) od Genetex (Irvine, CA, USA). Membrány byly promyty TBST a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s 1:2000 ředěním sekundární protilátky v TBST. Signál generovaný po promytí membrány TBST a inkubaci s činidlem zesílené chemiluminiscence (ECL) (GE Healthcare) byl detekován pomocí gelového zobrazovacího systému ImageQuant 350 (GE Healthcare).

10. Elektronová mikroskopie detekce intracelulární produkce melaninu

Buňky byly zpracovány pomocí LEV nebo SEV a inkubovány po dobu 48 hodin. Po ošetření byly buňky fixovány inkubací s 200 mM kakodylátovým pufrem obsahujícím 8 procent glutaraldehydu a 20 procent paraformaldehydu (Wako). Po dehydrataci ethanolem byly připraveny ultratenké řezy pomocí mikrotomu Leica EM UC7 (Leica) a shromážděny na 200-měděné mřížce. Řezy byly obarveny 1 procentem uranylacetátu a citrátu olovnatého a snímky byly pořízeny transmisním elektronovým mikroskopem JEOL JEM 1010 (JEOL) při 80 kV.

Extrakt z cistanche

11. Měření bělícího účinku pomocí modelu lidské kůže

K testování bělícího účinku LEV byl použit model lidské kůže derm-me (Tego Science, Soul, Korea). Lidská kožní tkáň byla ošetřena 10 μg/ml lev po dobu 7 dnů jako negativní kontrola. Koncentrace arbutinu byla 70 ug/ml. Lidská kožní tkáň byla rozpuštěna v 1N NaOH a byla měřena absorbance při 405 nm pomocí enzymového markeru (BioTek) pro stanovení obsahu melaninu. Sedmý den byla porovnána pigmentace kůže mikroskopickou analýzou vzorků obarvených Fontanou - mason. Pro barvení podle Fontana-Massona byly vzorky kůže fixovány přes noc při teplotě místnosti ve 4% paraformaldehydu (Waco), nařezány a zality do parafinového vosku. Řezy zalité v parafínu byly poté zahřívány v sušárně při 60 stupních po dobu 1 hodiny k vysušení. Řezy byly poté třikrát namočeny v xylenu, dvakrát v 95% ethanolu a dvakrát ve 100% ethanolu a poté promyty destilovanou vodou. Barvení podle Fontana-Massona bylo provedeno pomocí roztoku amoniakálního stříbra při 56 stupních a promyto destilovanou vodou. Sklíčka pak byla fixována v 0,2% roztoku chloridu zlata a ponořena do 5% roztoku thiosíranu sodného při teplotě místnosti. Nakonec byla sklíčka dehydratována v čerstvém alkoholu.

12. Statistická analýza

Data získaná z experimentů jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Provedli jsme experimenty se čtyřmi šaržemi aktivity, obsahu melaninu a aktivity TYR (doplňkový obr. S3). Jednocestná analýza rozptylu (ANOVA) a Dunnettův test byly provedeny pomocí GraphPad Prism (GraphPad Prism Software Inc., San Diego, CA, USA). p < rozdíly; 0.05, p < 0,01, p < 0,001 byly považovány za statisticky významné.

Extrakt z Cistanche tubulosa

Diskuse

Na rozdíl od většiny eukaryotických buněk mají rostliny složitou buněčnou stěnu, která představuje důležitou bariéru pro pohyb exozomů. Výsledkem je, že rostlinné buňky uvolňují exosomy prostřednictvím řady multivezikulárních těles spojených s plazmatickou membránou. Sekreční produkty uvolňované rostlinnými sekrety jsou uloženy v periplazmatické mezeře přiléhající k plazmatické membráně; jak se hromadí, vytvářejí tlak, který umožňuje sekretu procházet bariérou buněčné stěny. Výsledkem je, že vylučovaný materiál, včetně exosomů, může být uvolněn bez potřeby energie. EV pocházející z rostlin jsou podobné velikosti nebo větší než přirozeně se vyskytující exozomy živočišných buněk a jsou podobné těm, které byly pozorovány v exosomální tekutině slunečnice (50-200 nm) a Arabidopsis EV (50-300 nm). Účinnost buněčného příjmu je považována za klíčový determinant účinnosti, protože cíle mnoha terapeutických činidel jsou umístěny intracelulárně. Proto jsme určili optimální načasování a koncentraci příjmu melanomovými buňkami a pozorovali rychlý přenos LEV a SEV do melanomových buněk během 12 hodin.

TYR je glykoprotein, který katalyzuje konverzi l-tyrosinázy na L-DOPA, krok omezující rychlost syntézy melaninu. Obě EV vykazují antimelanogenní účinek, ale antimelanogenní účinek LEV je významně větší než účinek SEV.

Produkce melaninu je regulována pomocí -MSH-MC1R a je známo, že inhibice PKC snižuje pigmentaci kůže a vlasů. Mnoho genetických, biochemických a farmakologických studií však naznačuje, že signální dráha -MSH-MC1R je hlavní hnací silou melanogeneze. Ačkoli naše experimenty neprokázaly přímou interakci mezi MITF a TYR, bylo prokázáno, že LEV inhibují melanogenezi snížením exprese MITF prostřednictvím dráhy -MSHMC1R závislé na UV záření, což zase snižuje expresi TYR, TRP-1, a TRP{10}}. Předpokládáme, že proteiny rodiny TRP jsou navzájem nepřímo spojeny, ale k prokázání přímé interakce mezi nimi mohou být nutné další experimenty. Kromě toho rekonstruované modely lidské kůže ukazují, že syntéza melaninu indukovaná UV zářením a obsah melaninu jsou účinně inhibovány LEV.

Cistanche dulcis

Závěr

Naše zjištění naznačují, že LEV jsou kandidáty na nová antimelanogenní léčiva, která snižují melanogenezi inhibicí exprese proteinů souvisejících s melaninem. Výsledky potvrdily, že LEV redukovaly MITF a tím down-regulovaly TRP v buňkách melanomu B16BL6. levs a arbutin inhibovaly TRY o 66 procent a 67 procent, v daném pořadí. Obsah melaninu v rekonstruované kůži ošetřené LEV se snížil o 43 procent a 28 procent ve srovnání s neošetřenou negativní kontrolou a arbutinem jako pozitivní kontrolou, v tomto pořadí.

Na základě prvních zjištění se domníváme, že EV získané z rostlin by mohly být užitečné jako antimelanogenní činidlo pro vývoj přírodní kosmetiky. V budoucnu je zapotřebí dalšího výzkumu pro vývoj EV pocházejících z rostlin jako účinné složky pro zlepšení pokožky a je nezbytné prokázat bezpečnost EV pocházejících z rostlin na modelech lidské kůže. Naše výsledky naznačují, že EV lze použít k redukci melaninu a tím k rozjasnění pleti. EV však může mít toxické účinky na kůži a měly by být provedeny další experimenty, jako jsou alergické testy nebo Amesovy testy.

REFERENCE

[1] Nosanchuk JD, Nimrichter L, Casadevall A, et al. Úloha vezikulárního transportu makromolekul přes buněčné stěny v patogenezi hub. Commun Integr Biol. 2008;1(1):37–39.

[2] Robinson DG, Ding Y, Jiang L. Nekonvenční sekrece proteinů v rostlinách: kritické hodnocení. Protoplasma. 2016;253(1):31–43.

[3] Paiva EA. Jak sekreční produkty procházejí stěnou rostlinné buňky, aby se uvolnily? Nová hypotéza zahrnující cyklické mechanické působení protoplastu. Ann Bot. 2016;117(4):533–540.

[4] Hood JL, Scott MJ, Wickline SA. Maximalizace koloidní stability exosomu po elektroporaci. Anal Biochem. 2014;448(1):41–49.

[5] Rutter BD, Innes RW. Extracelulární vezikuly izolované z apoplastu listu nesou proteiny odezvy na stres. Plant Physiol. 2017;173(1):728–741.

[6] Luan X, Sansanaphongpricha K, Myers I, et al. Inženýrské exosomy jako rafinované biologické nanoplatformy pro dodávání léků. Acta Pharmacol Sin. 2017;38(6):754–763.

[7] Videira IF, Moura DF, Magina S. Mechanismy regulující melanogenezi. Dermatol podprsenky. 2013;88(1):76–83.

[8] Park HY, Lee J, Kapasi S, et al. Lokální aplikace inhibitoru proteinkinázy C snižuje pigmentaci kůže a vlasů. J Invest Dermatol. 2004;122(1):159–166.

[9] Yamanishi DT, Graham M, Buckmeier JA, et al. Diferenciální exprese genů protein kinázy C v normálních lidských neonatálních melanocytech a metastatických melanomech. Karcinogeneze. 1991;12(1):105–109.

[10] Borovanský J, Riley PA. Melaniny a melanosomy: biosyntéza, biogeneze, fyziologické a patologické funkce. Hoboken, NJ: Wiley-Blackwell; 2011

[11] D'Mello S, Finlay G, Baguley B a kol. Signální dráhy v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.