Abstraktní

Zájem spotřebitelů o produkty kosmetického průmyslu s účinky zesvětlující pokožku zvýšil poptávku po přípravcích, které snižují melanogenezi. Řada antimelanogenních léků je známá pro své vedlejší účinky, jako je kontaktní dermatitida a vysoká toxicita a špatná penetrace kůží. Značný nedávný výzkum se zaměřil na produkty rostlinného původu jako alternativy k chemoterapeutickým lékům s menšími vedlejšími důsledky.

V této studii jsme zkoumali antimelanogenní působení extracelulárních vezikul (EV) extrahovaných z listů a stonků patogenního Dendropanaxu. Při práci se spektrofotometrickými a biochemickými metodami jsme zjistili, že extracelulární vezikuly odvozené z listů (LEV) a extracelulární vezikuly odvozené ze stonků (SEVs) snižují obsah melaninu a aktivitu tyrosinázy (TYR) v závislosti na koncentraci v buněčné linii myšího melanomu B16BL6. Elektronová mikroskopická analýza dále prokázala, že LEV a SEV indukovaly na koncentraci závislý pokles obsahu melaninu v melanomových buňkách. Ve srovnání s arbutinem jako pozitivní kontrolou vykazovaly LEV a SEV silnější bělící účinek na melanomové buňky a bělící účinek LEV byl silnější. Je pozoruhodné, že ani LEV, ani SEV neindukovaly významnou cytotoxicitu. Také jsme zkoumali účinky rostlinných EV na expresi proteinů souvisejících s tyrosinázou (TRP) v melanomových buňkách. LEV inhibovaly expresi genů a proteinů souvisejících s melanogenezí, včetně transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF), TYR, TRP-1 a TRP-2. V lidském epidermálním modelu LEV inhibovaly melanogenezi silněji než arbutin. Celkově vzato naše data naznačují, že lev z D. pathogens může být novou kandidátskou přírodní látkou pro použití jako antimelanogenní činidlo ve farmaceutických přípravcích.

klíčová slova:EV pocházející z rostlin; LEV aSEV; anti-melanogenní; TYRaktivita; obsah melaninu aVýhody extraktu z cistanche

Pro získání klikněte semvýhody Cistanche pro bělení pokožkyaúčinky extraktu Cistanche

Úvod

Melanin, kritická část systému pigmentace lidských vlasů, očí a kůže, je produkován melanocyty prostřednictvím postupu zvaného melanogeneze. Aberantní hromadění melaninu může mít za následek kožní poruchy, jako jsou pihy, sluneční pihy a melasma, a může také způsobit rakovinu a vitiligo. Regulace melanogeneze je proto zásadní strategií v léčbě hyperpigmentovaných poruch. Například hydrochinon, hydroxyfenylová sloučenina, která interferuje s aktivitou TYR, se používá jako činidlo pro bělení kůže v kosmetickém průmyslu. Nicméně hydrochinon může způsobit vedlejší účinky, jako je kontaktní dermatitida a exogenní hnědnutí. Va-kyselina je další syntetická látka, která inhibuje aktivitu TYR, ale její použití je spojeno s vysokou frekvencí edému nebo podráždění.

Vzrůstá zájem o identifikaci alternativních léků z přírodních zdrojů proti melanogenezi, vzhledem k omezením existujících chemických sloučenin, což odráží skutečnost, že kosmetické produkty vyrobené z rostlin a bylin mají tendenci být jemnější, více biologicky rozložitelné a vykazují nižší toxicitu než syntetické sloučeniny. Bylo prokázáno, že extrakty listů onemocnění Dendrobium inhibují produkci melaninu přímou interakcí s intracelulární aktivací TYR a expresí enzymů zapojených do biosyntézy melaninu. Podobným způsobem extrakt z listů Croton officinalis potlačil obsah melaninu a buněčnou aktivitu TYR inhibicí transkripčního faktoru souvisejícího s melanogenezí (MITF) a melanogenních enzymů. Kromě toho měly listy moruše inhibiční účinek na aktivitu TYR a tvorbu melaninu v buňkách melan-A. Kyselina P-kumarová z listů ženšenu byla identifikována jako hlavní inhibitor TYR.

Herba Cistanche

Navzdory skutečnosti, že v léčebných kosmetických přípravcích byla použita široká škála botanických sloučenin, jejich nízká rozpustnost, nízká cílová afinita a mírný účinek zesvětlující pokožku bránily pokroku ve zlepšování terapeutických účinků botanické kosmetiky. To motivovalo k hledání nových a progresivních technik pro zvýšení účinnosti léčivých a bioaktivních sloučenin a zlepšení jejich účinnosti dodávání do pokožky. Například byla úspěšně vyvinuta řada nanotechnologií, včetně nano-lovely pro účinnou péči o pleť, nano-kvercetinu pro oddálení poškození buněk způsobeného ultrafialovým (UV) zářením, nanofullerenů pro regeneraci kolagenu a prevenci stárnutí pleti. , nano-luteolin pro udržení antioxidační aktivity a nano-resveratrol pro ochranu pokožky před UV zářením.

V této studii se zaměřujeme na roli extracelulárních vezikul pocházejících z rostlin (EV). Nedávné studie ukázaly, že EV pocházející z rostlin mají strukturu podobnou struktuře izolovaných exozomů savců a působí jako extracelulární poslové zprostředkovávající mezibuněčnou komunikaci. Kromě toho jsou tyto vezikuly schopné translokovat mRNA, mikro-RNA (miRNA), bioaktivní lipidy a proteiny do živočišných buněk.

Mezitím jsme studovali inhibiční účinek EV pocházejících z listů a stonků nemocných luštěnin na melanogenezi. Charakterizovali jsme velikost a vlastnosti extracelulárních vezikul pocházejících z listů (LEV) a extracelulárních vezikul pocházejících ze stonků (SEV) extrahovaných z listů a stonků nemocných luštěnin a ukázali jsme, že tyto EV byly snadno absorbovány buňkami melanomu a nebyly cytotoxické. Abychom demonstrovali antimelanogenní účinky LEV a SUV, zkoumali jsme obsah melaninu a aktivitu TYR v melanomových buňkách. Dále jsme hodnotili vliv EV na komplexní proces syntézy melaninu sledováním změn hladin různých proteinů a enzymů.

Hormon stabilizující alfa-melanocyty ( -MSH) se váže na receptor melanokortinu 1 (MC1R) na buněčném povrchu a aktivuje adenylátcyklázu, což vede ke zvýšení intracelulárních hladin cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP). cAMP je zprostředkován prostřednictvím cAMP-dependentní proteinkinázy A, což vede k fosforylaci cAMP responzivního elementu vázajícího proteinu (CREB). Aktivovaný CREB indukuje MITF, který je exprimován v melanocytech a hraje klíčovou roli v diferenciaci a vývoji melanocytů. -TRP1 je nezbytný pro správnou translokaci TYR k syntéze melaninu a TRP2 hraje důležitou roli v katalytické aktivitě TRP v raných fázích syntézy melaninu. Tyto tři interagují v melanomových buňkách (doplňkový obrázek 1).

Zjistili jsme sníženou expresi MITF v melanomových buňkách ošetřených LEV, následovanou sníženou expresí TYR, TRP-1 a TRP-2 a potvrdili jsme elektronovou mikroskopií, že syntéza melaninu byla v těchto buňkách snížena ultrastrukturální úroveň. Dále jsme potvrdili antimelanogenní účinek LEV pomocí rekonstruovaného lidského epidermálního modelu. Abychom kvantitativně vyhodnotili inhibiční účinek LEV na buněčnou syntézu melaninu, připravili jsme standardní roztoky z tkání a měřili obsah melaninu pomocí kolorimetru. melaninové skvrny byly redukovány v řezech tkání obarvených Fontana-Masson. LEV inhibovaly produkci melaninu účinněji než inhibitor TYR arbutin, který byl použit jako pozitivní kontrola.

Stručně řečeno, tato zjištění naznačují, že použití EV pocházejících z přírodních látek pro řízení hyperpigmentace je pro farmaceutický průmysl proveditelným budoucím přístupem. Kromě toho se očekává, že s výhodami malé velikosti, nízké toxicity, vysoké absorpce a bezpečnosti pro životní prostředí budou EV pocházející z rostlin další generací terapeutických aplikačních systémů pro léčbu jiných onemocnění. Je pozoruhodné, že EV pocházející z rostlin mají dobré antimelanogenní účinky na rekonstruovanou lidskou kožní tkáň (podobnou lidské epidermis), což je předpokladem pro budoucí klinické studie.

Doplněk Cistanche

Materiály a metody

1. Izolace D. morbifera LEV a SUV

Čerstvé listy a stonky byly shromážděny z Poge Island, Guandao-gun a Jeollanam-do. EV byly izolovány z 50 g listů a stonku, v daném pořadí, mletím pomocí extraktoru a průchodem výsledné šťávy přes filtrační papír a centrifugací při 10,000 × g po dobu 10 minut. Velké nečistoty byly odstraněny filtrací supernatantu přes 0,22 μm membránu, následovala centrifugace pomocí centrifugačního filtru Amicon Ultra-4 PL 100 K (Merck Millipore. Darmstadt, Německo), aby se EV koncentrovaly odstředěním vzorků při 5000 × g po dobu 10 minut při 4 stupních. Po odstředění byla koncentrace proteinu EV stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů s kyselinou bischinolinovou (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2. Charakterizace velikosti izolovaných EV

Hydrodynamická velikost izolovaných EV byla měřena dynamickým rozptylem světla (DLS), technikou používanou ke stanovení distribuce velikosti malých částic v suspenzi, pomocí systému Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments, Malvern, UK). Shromážděné EV byly umístěny do buňky s konstantní teplotou při 20 stupních. Distribuce velikosti částic a z-průměr použitý ke stanovení hydrodynamické distribuce velikosti částic byly stanoveny měřením autokorelační funkce intenzity rozptylu. Izolované EV byly zředěny bublinkovou vodou bez vezikul a poté podrobeny analýze sledování nanočástic (NTA) (Nanosight; pomocí 488 nm laseru při 25 stupních).

3. Analýza EV transmisní elektronovou mikroskopií

5 μl roztoku vzorku bylo naneseno na uhlíkový film potažený měděnou mřížkou pro analýzu transmisní elektronovou mikroskopií (TEM). Po adsorpci vzorku po dobu 1 minuty byly mřížky promyty kapkou čisté vody a poté negativně obarveny 1 procentem uranylacetátu po dobu 1 minuty. Přebytečná skvrna byla odstraněna filtračním papírem a mřížky byly vysušeny na vzduchu. Vzorky byly zobrazeny v ohnisku mezi 0.8 - 1,5 μm pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEM- 1400 Plus (JEOL Ltd., Tokio, Japonsko) vybaveného pistolí Lab6 pracující při 120 kV . Snímky byly zaznamenány pomocí kamery UltraScan OneView CMOS (Gatan, Pleasanton, CA, USA).

Cistanche tubulosa

4. Příprava liposomů

Lipozomové směsi byly připraveny s použitím poměru 95:5 (mol/mol) DMPC (1,2-stearoyl-sn-glycerol-3-fosfocholin) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) s DSPE-mPEG (1,2-stearoyl-sn-glycerol-3-fosfoethanolamin-[methoxy(polyethylenglykol)- 2000] (Avantipolární lipidy) k přípravě směsí liposomů jako lipidových membrán. hydrofobní fluorescenční barvivo 1,1-dioktadecyl-3,3,3ʹ,3ʹ-tetramethylindokarbocyanin chloristan (DiI, Invitrogen, Waltham, MA, USA) bylo smícháno s EV, 725,49 ug DMPC, 151 ug DSPE6. a 15 ug DiI. Po odpaření organického rozpouštědla byla membrána obsahující směs lipidů a DiI hydratována 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) Dále byly pomocí extruderu (Avanti Polar Lipidy).

5. Buněčné kultury a testy viability

Buňky melanomu B16BL6 byly kultivovány v alfa-minimálním základním médiu (alfa-MEM) obsahujícím 10 procent fetálního bovinního séra (Rocky Mountain Biologicals, Missoula, MT, USA) a 1 procento penicilin/streptomycin (Lonza, Basilej, Švýcarsko) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) v kultuře. Buňky byly inkubovány při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2. 100 ul buněk melanomu B16BL6 bylo naočkováno do 96-jamkových destiček (5 x 104 buněk/jamka) pro testy životaschopnosti buněk. Po inkubaci po dobu 24 hodin byly buňky ošetřeny LEV a SEV v koncentracích 1, 5 a 10 ug/ml, v daném pořadí, po dobu 24 hodin. Koncentrace liposomů a arbutinu byly 10 ug/ml, respektive 70 ug/ml, pro všechny experimenty. Do každé jamky bylo následně přidáno 10 ul EZ-Cytox činidla (Daeil Lab Service, Soul, Korea). Destičky byly inkubovány po dobu 1 hodiny. Destičky byly poté jemně protřepány a absorbance byla poté měřena při 450 nm pomocí enzymového markeru (BioTek, Winooski, VT, USA).

REFERENCE

[1] Meredith P, Sarna T. Fyzikální a chemické vlastnosti eumelaninu. Pigment Cell Res. 2006;19(6):572–594.

[2] Grimes PE. Melasma: etiologické a terapeutické úvahy. Arch Dermatol. 1995;131(12):1453–1457.

[3] Todd MM, Rallis TM, Gerwels JW a kol. Srovnání 3 laserů a kapalného dusíku při léčbě solárních lentiginů: randomizovaná, kontrolovaná srovnávací studie. Arch Dermatol. 2000;136(7):841–846.

[4] Kawalek AZ, Spencer JM, Phelps RG. Kombinovaný excimerový laser a topický takrolimus pro léčbu vitiliga: pilotní studie. Dermatol Surg. 2004;30(2):130–135.

[5] Bastiaens M, Ter Huurne J, Gruis N, et al. Gen melanokortinového-1-receptoru je hlavním pihovým genem. Hum Mol Genet. 2001;10(16):1701–1708.

[6] Pillaiyar T, Manickam M, Jung SH. Downregulace melanogeneze: objev léků a terapeutické možnosti. Drug Discov Dnes. 2017;22(2):282–298.

[7] Hu ZM, Zhou Q, Lei TC, a kol. Účinky hydrochinonu a jeho glukosidových derivátů na melanogenezi a antioxidaci: biologická bezpečnost jako činidla pro bělení kůže. J Dermatol Sci. 2009;55(3):179–184.

[8] Westerhof W, Kooyers T. Hydrochinon a jeho analogy v dermatologii – potenciální zdravotní riziko. J Cosmet Dermatol. 2005;4(2):55–59.

[9] Picardo M, Carrera M. Nové a experimentální léčby chloasmatu a další hypomelanózy. Dermatol Clin. 2007;25(3):353–362.

[10] Shin JW, Park KC. Současné klinické použití depigmentačních činidel. Dermatol Sin. 2014;32(4):205–210.

[11] Chaita E, Lambrinidis G, Cheimonidi C, et al. Antimelanogenní vlastnosti řeckých rostlin. Nový depigmentační prostředek ze dřeva Morus alba. Molekuly. 2017;22(4):1–14.

[12] Park SA, Park J, Park CI a kol. Buněčná antioxidační aktivita a bělící účinky výtažků z listů Dendropanax morbifera. Microbiol Biotechnol Lett. 2013;41(4):407–415.

[13] Chatatikun M, Yamauchi T, Yamasaki K, et al. Antimelanogenní účinek listů Croton roxburghii a Croton sublyratus v buňkách B16F10 stimulovaných -MSH. J Tradit Complement Med. 2019;9(1):66–72.

[14] Lee SH, Choi SY, Kim H a kol. Mulberrosid F izolovaný z listů Morus alba inhibuje biosyntézu melaninu. Biol Pharm Bull. 2002;25(8):1045–1048.

[15] Lim JY, Ishiguro K, Kubo I. Kyselina P-kumarová inhibující tyrosinázu z listů ženšenu. Phytother Res. 1999;13(5):371–375.

[16] Chanchal D, Swarnlata S. Nové přístupy v bylinné kosmetice. J Cosmet Dermatol. 2008;7(2):89–95.

[17] Ganesan P, Choi DK. Současná aplikace nanokosmeceutik na bázi fytosloučenin pro kosmetickou a pleťovou terapii. Int J Nanomedicína. 2016;11 (11):1987–2007.

[18] Takahashi M, Kitamoto D, Asikin Y a kol. Lipozomy zapouzdřující gelový extrakt z listů Aloe vera výrazně zvyšují proliferaci a syntézu kolagenu v buněčných liniích lidské kůže. J Oleo Sci. 2009;58(12):643–650.

[19] Bose S, Du Y, Takhistov P, a kol. Optimalizace formulace a topická dodávka kvercetinu z nanosystémů na bázi pevných lipidů. Int J Pharm. 2013;441(30):56–66.

[20] Ngan CL, Basri M, Tripathy M, et al. Intervence nanoemulze s integrovaným fullerenem při strukturální a kolagenové regeneraci proti stárnutí pleti. Eur J Pharm Sci. 2015;70(5):22–28.

[21] Mitri K, Shegokar R, Gohla S, et al. Lipidové nanonosiče pro dermální dodávání luteinu: příprava, charakterizace, stabilita a výkon. Int J Pharm. 2011;414 (1–2):267–275.

[22] Juškaitė V, Ramanauskienė K, Briedis V. Návrh a formulace optimalizovaných mikroemulzí pro dermální podávání resveratrolu. Evid Based Complement Alternat Med. 2015;2015:1–10.

[23] Zhang M, Viennois E, Xu C, a kol. Jedlé nanočástice rostlinného původu jako nový terapeutický přístup proti nemocem. Tkáňové bariéry. 2016;4(2):1–9.

[24] Criton M, Le Mellay-Hamon V. Analogy N-hydroxy-N'-fenylthiomočoviny a N-hydroxy-N'-fenylmočoviny jako inhibitory tvorby tyrosinázy a melaninu. Bioorg Med Chem Lett. 2008;18 (12):3607–3610.

[25] Kobayashi T, Hearing VJ. Přímá interakce tyrosinázy s Tyrp1 za vzniku heterodimerních komplexů in vivo. J Cell Sci. 2007;120(24):4261–4268.

[26] D'Mello S, Finlay G, Baguley B a kol. Signální dráhy v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016;17(7):1–18.

[27] Fang D, Tsuji Y, Setaluri V. Selektivní down-regulace genu tyrosinázové rodiny TYRP1 inhibicí aktivity melanocytového transkripčního faktoru, MITF. Nucleic Acids Res. 2002;30(14):3096–3106.

[28] Oh MJ, Hamid MA, Ngadiran S a kol. Extrakt z Ficus deltoidea (Mas cotek) projevoval antimelanogenní aktivitu tím, že zabránil aktivitě tyrosinázy in vitro a suprimoval expresi genu tyrosinázy v buňkách melanomu B16F1. Arch Dermatol Res. 2011;303(3):161–170.

[29] Jang EJ, Shin Y, Park HJ a kol. Antimelanogenní aktivita fytosfingosinu prostřednictvím modulace signální dráhy transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií. J Dermatol Sci. 2017;87(1):19–28.

[30] Toyofuku K, Wada I, Valencia JC, et al. Okulokutánní albinismus typu 1 a 3 jsou ER retenční onemocnění: mutace tyrosinázy nebo Tyrp1 může ovlivnit zpracování mutantních i divokých proteinů. Faseb J. 2001;15:2149–2161.

[31] Xue L, Li Y, Zhao B a kol. TRP-2 zprostředkovává barevnou pigmentaci srsti v ovčí kůži. Mol Med Rep. 2018;17:5869–5877.

[32] Mu J, Zhuang X, Wang Q a kol. Mezidruhová komunikace mezi hostitelskými buňkami rostlinného a myšího střeva prostřednictvím jedlých rostlinných nanočástic podobných exosomům. Mol Nutr Food Res. 2014;58(7):1561–1573.