Zde je stručnější verze názvu: Současné stanovení šesti složek v Cistanche Tubulosa pomocí blízké infračervené spektroskopie

1. Zavedení

Cistanche (Hoffmg. Et Link) je vytrvalý fanerogamní rod rostlin z čeledi Orobanchaceae. Většina druhů patřících do rodu Cistanche se v Číně používá jako léčivá rostlina po tisíciletí; mít pověst vynikajícího tonika; a jsou známé jako "Ženšen pouště". Cistanche tubulosa je obligátní parazit na kořenech vytrvalé rostliny Tamarix chinensis. Byl zdokumentován v čínském lékopisu jako autentický zdrojCistanches Herba(čínský název: Roucongrong) z vydání z roku 2005. Moderní farmakologický výzkum druhů Cistanche byl zahájen v 80. letech 20. století. Farmakologické výzkumy ukázaly, že extrakty z rostlin Cistanche mají široké spektrum aktivit, jako je léčba nedostatku ledvin a stařecké zácpy, zlepšení schopnosti učit se a zapamatování, anti-Alzheimerova choroba, posílení imunity, anti-aging, anti-únava atd. V posledních třech desetiletích byly komplexní a systematické farmakologické studie kombinovány s fytochemickými výzkumy, aby objasnily materiální základ prospěšných účinků kořenů rostlin Cistanche. Tyto průzkumy ukazují, že fenylethanoidní glykosidy (PhGs) byly hlavními účinnými složkami rostlin Cistanche, které hrají klíčovou roli při léčbě nedostatku ledvin, impotence, proti stárnutí a proti Alzheimerově chorobě. Obsah dvou PhG (echinakosid a verbascosid) byl požadován v čínském lékopisu. Mezitím sacharidy, jako je mannitol, sacharóza, glukóza a fruktóza v rostlinách Cistanche, mají laxativní funkci a sacharidové shlukyRostliny cistanchese používají k léčbě zácpy.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZVÝŠENÍ TESTOSTERONU PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Divoké zdroje C. tubulosa jsou distribuovány především v oblasti kolem pouště Taklamakan v jižní autonomní oblasti Xinjiang v Číně. Podobně jako mnoho jiných druhů používaných jako tradiční čínská léčiva (TCM) má C. tubulosa velkou ekonomickou hodnotu a ve svém volném prostředí je téměř vyhuben kvůli nadměrnému sběru. Pěstování C. tubulosa začalo v 90. letech 20. století v Číně, aby se zajistily dodávky surovin pro Cistanches Herba a také se chránily zdroje volně žijících rostlin. Od roku 2017 existuje v prefektuře Hotan v Sin-ťiangu téměř 13 tisíc ha kultivované C. tubulosa. Pro rozšíření pěstování a zlepšení kvality C. tubulosa jsou vyžadovány pokroky v technologii výsadby.

Primárním účelem kultivace C. tubulosa je produkovat Cistanches Herba, která je bohatá na tyto účinné složky. Obsah účinných složek vCistanches Herba, jako jsou PhGs a oligosacharidy, mohou být během výroby významně ovlivněny mnoha faktory. Měl by být prozkoumán systém detekce kvality C. tubulosa v reálném čase. Proto je nutné vyvinout vysoce výkonnou metodu, která by splnila požadavek analýzy velkého počtu vzorků v krátké době. Tradičně se stanovení těchto primárních účinných složek, jako jsou PhG a sacharidy, u C. tubulosa obvykle dosahovalo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Přestože je přesný a spolehlivý, je časově náročný a pracný pro sběr a zpracování dat. Kromě toho je také zapotřebí mnoho času a úsilí pro přípravu vzorků, která obvykle zahrnuje pulverizaci, extrakci a filtraci testů HPLC. Pro získání relativně velkého množství dat je proto potřeba jasný princip a snadno ovladatelný nástroj. Naštěstí se blízká infračervená spektroskopie (NIRS) široce používá k hodnocení zemědělských produktů, potravin, lékařských vzorků a farmaceutických produktů, protože je rychlá a nedestruktivní. Proto NIRS mohl přesně odpovídat požadavkům na účinná měření TCM a není překvapením, že NIRS byl použit pro kvalitativní identifikaci a kvantifikaci sloučenin v TCM.

V této studii je obsah šesti účinných složek, včetněechinakosid, verbaskosid, mannitol, sacharóza, glukóza a fruktózave 116 dávkách vzorků C. tubulosa, které byly odebrány z prefektury Hotan v Sin-ťiangu v letech 2013–2015, byly poprvé stanoveny pomocí HPLC. Následně byly vytvořeny kalibrační modely těchto šesti komponent metodou parciální regrese nejmenších čtverců (PLSR). Tyto modely byly následně validovány s korelačními koeficienty a chybami predikce v kalibračních sadách. Výsledky ukázaly, že vyvinutou metodu lze použít jako spolehlivou metodu pro kvantitativní analýzu C. tubulosa.

2. Výsledky

2.1. HPLC analýza

Obsahechinakosid a verbascosidbyly stanoveny dobře definovanou metodou HPLC-UV v literatuře a čtyři sacharidy (mannitol, sacharóza, glukóza a fruktóza) byly stanoveny dobře definovanou metodou HPLC-ELSD v literatuře pro všech 116 vzorků. Příprava vzorků a metody stanovení byly popsány v částech 3.1 a 3.3. Obrázek 1 ukazuje charakteristické chromatogramy směsných standardů. Je vidět, že všech šest účinných složek bylo od základní linie odděleno, a proto je bylo možné kvantifikovat. Před testováním vzorku byla validována metoda HPLC. Hlavní výsledky metody HPLC jsou uvedeny v tabulce 1. Příznivý lineární vztah (r=0,9998) a výtěžnost (98,5 %) metody stanovení echinakosidu jsou uvedeny ve výsledcích, stejný výsledek jako u všech pěti komponenty. Obsah šesti účinných složek lze tedy určit přesně. Všechny stanovené rozsahy obsahu jsou shrnuty v tabulce 1.

2.2. Analýza NIRS

Obrázek 2 ukazuje NIR spektra (4000–10,000 cm−1) vzorků C. tubulosa. U všech vzorků se objevily významné absorpční píky od 4000 cm−1 do 7500 cm−1, zatímco mírné výkyvy se objevily od 7500 cm−1 do 10 000 cm−1. K posunu základní linie NIR spekter došlo, protože vzorek byl snadno ovlivněn faktory, jako je velikost částic a barva (obrázek 2A). Ke snížení vlivu zbytečných informací do určité míry byly použity matematické předúpravy spekter. Matematické předběžné úpravy zahrnovaly první derivaci (1. derivace), druhou derivaci (2. derivaci), standardní normální varietu (SNV) a multiplikativní korekci rozptylu (MSC). Obrázek 2B ukazuje 2. derivaci NIR spekter C. tubulosa a jsou pozorovány významné variace, které se vyskytly ze tří oblastí, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 a 7000–7500 cm−1.

2.3. Vytvoření kvantitativních kalibračních modelů

Částečná regrese nejmenších čtverců (PLSR) je klasická modelovací metoda a je široce používána v kvantitativních modelech kvůli vysoké kvalitě výsledků. Mezi výhody PLSR patří dobrá předpovědní schopnost a relativní jednoduchost. PLSR se také široce používá při vytváření kvantitativních kalibračních modelů TCM [25]. Na základě předem upravených spekter NIR byl vytvořen model kvantitativní analýzy NIR pro šest účinných složek v C. tubulosa pomocí metody PLSR s údaji z HPLC analýzy jako skutečnými hodnotami. 116 vzorků bylo náhodně rozděleno do kalibračních a validačních sad v poměru 3:1. Jako nejvhodnější podmínky pro kalibraci byly zvoleny nízké RMSEC a vysoký korelační koeficient.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. Výběr vlnového pásma pro kalibrační modely

Výběr vhodného vlnového pásma byl důležitým krokem pro stavbu kalibračního modelu. V této studii byla porovnána NIR intervalová spektra 4000–7500 cm−1 (doporučeno softwarem TQ analytik) a 4000–10 000 cm−1. Bylo pozorováno, že tento rozsah není vhodný pro kalibraci v intervalu mezi 4000 cm-1 a 7500 cm-1 z tabulky 2. Proto v současné studii byly všechny spektrální intervaly pro šest chemických složek vybrány z intervalu od 4000 až 10 000 cm−1 porovnáním výkonů RMSEC a korelačního koeficientu.

2.3.2. Výběr optimálního počtu faktorů pro kalibrační modely

PLSR vysvětluje maximální množství variability v datech snížením rozměrů dat spekter výpočtem faktorů. Problém „nedostatečnosti“ se objevil kvůli nedostatečným informacím, které vyplývaly z omezeného počtu faktorů; nicméně výběr faktorů větších než optimální hodnoty zavedené v modelu způsobí problém "převybavení". Buď "nedostatečnost" nebo "nadměrná vybavenost" sníží prediktivní schopnost zavedených modelů [22]. Obrázek 3 ukazuje vztah mezi RMSECV a faktory pro všech šest sloučenin. Proto jsme vybrali ty faktory, které odpovídají nejnižším hodnotám RMSECV. Optimální výběr faktorů pro kalibrační modely je uveden v tabulce 3.

2.3.3. Výběr spektrální předúpravy pro kalibrační modely

Dalším kriticky ovlivňujícím faktorem pro kalibrační modely je spektrální předúprava, která je zaměřena na snížení vlivu rozptylu a základního driftu, zvýšení poměru signálu k šumu a odstranění nepravidelných odchylek. K eliminaci vlivu rozptylu záření byly použity metody multiplikativní korekce rozptylu (MSC) a standardní normální variace (SNV). Pro vyřešení vlivů driftu základní linie byla porovnána spektra 1. a 2. derivace a byla vybrána 2. derivace. Pro požadovaný efekt jsme spektra před derivací vyhladili pomocí algoritmu Savitzky–Golay (SG) filtru, abychom zabránili zvětšení šumu. Tabulka 3 ukazuje informace o spektrální předúpravě a její výsledky pro kalibrační modely.

2.4. Hodnocení zavedených modelů

Dobrý kalibrační model NIRS by měl mít nízké hodnoty RMSEC a RMSEP, stejně jako vysoký korelační koeficient (r) a malé rozdíly mezi RMSEC a RMSEP. Kalibrační modely šesti vybraných sloučenin byly vytvořeny podle postupů uvedených výše (tabulka 3). Hodnoty RMSEC a r pro kalibrační sadu echinakosidu byly 27,6 a 0,9808, v daném pořadí. Výkonnostní parametry jiných modelů chemických sloučenin jsou uvedeny v tabulce 3, ze které můžeme usoudit, že zavedené modely poskytují uspokojivé výsledky predikce a lze je použít pro rychlou kvantitativní analýzu C. tubulosa. Rozptylové grafy šesti chemických sloučenin jsou znázorněny na obrázku 4, aby byly kalibrační modely popisnější a pozorované vizuálně. Jak ukazuje obrázek 4, mezi prediktivními a naměřenými hodnotami se vyskytly menší rozdíly, protože většina bodů byla rozmístěna kolem regresní křivky s rovnicí jako y=x. Proto byly na obrázku 4 pozorovány vynikající prediktivní výkony.

3. Materiály a metody

3.1. Příprava vzorku

V letech 2013 až 2015 bylo odebráno 111 vzorků C. tubulosa z prefektury Hotan v autonomní oblasti Xinjiang. Všechny vzorky byly kultivovány, ale byly odebrány v různých fázích růstu. Čerstvá hmotnost vzorků se pohybovala od 20 g do 1000 g. Po vysušení na slunci byly vysušené vzorky rozdrceny a prosety přes 60-síto.

3.2. NIR spektroskopický sběr dat

NIR spektra vzorků byla sbírána v intervalu 8 cm-1 ve spektrální oblasti 4000–10 000 cm-1 systémem Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) vybaveným ruční adaptér odrazivosti optických vláken. Každé spektrum bylo získáno průměrováním 64 skenů. Všechny vzorky byly před skenováním NIR spekter ponechány ekvilibrovat na pokojovou teplotu (25 ◦C), aby bylo zajištěno, že vzorky byly analyzovány při stejné teplotě. Vlhkost v laboratoři byla udržována na okolní úrovni.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ FUNKCE LEDVIN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. Sběr dat HPLC

3.3.1. Příprava extrakce

Jeden gram prášku C. tubulosa byl extrahován 50 ml 50% methanolu v kónické baňce s ultrazvukem (500 W, 40 kHz) po dobu 30 minut. Extrakt byl skladován při 4 ◦C. Supernatant extraktu byl zfiltrován za získání vzorku pro HPLC analýzu.

3.3.2. Současné stanovení echinacosidu a verbascosidu s HPLC-UV

Kapalinová chromatografická analýza byla provedena na systému Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Japonsko) sestávajícím ze dvou jednotek pro dodávání rozpouštědla LC-20ADXR, čerpadla LC-20AD, SIL-20ACXR auto vzorkovač, CTO-20AC kolonová pec, detektor SPD-M20A DAD, odplyňovač DGU-20A3R a ovladač CBM-20A.

Kolona Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) použitá pro chromatografické separace byla udržována při 35 °C. Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu (A) a 0,1% vodné kyseliny mravenčí (B) a byla dodávána podle gradientového programu takto: 0–7 min, lineární gradient 10–20 % A; 7–15 min, 20 % A; a 15–20 min, lineární gradient 20–10 % A. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. UV monitorování bylo prováděno při 330 nm.

3.3.3. Současné stanovení mannitolu, sacharózy, glukózy a fruktózy pomocí HPLC-ELSD

HPLC byla provedena na systému Agilent 1100 series LC (Palo Alto, CA, USA) sestávajícím z odplyňovače G1322A, kvartérního čerpadla G1311A, autosampleru G1311A, regulátoru teploty kolony G1316A a detektoru DAD G1315B.

Pro chromatografické separace byla použita kolona Sigma Prevail Carbohydrate ES (4,6 x 25 0 mm, 5 um) a udržována při teplotě kolony 25 °C. Mobilní fáze se skládala z acetonitrilu a vody (77:23, obj./obj.) a byla izokraticky dodávána rychlostí 0,7 ml/min. Výtok byl monitorován pomocí odpařovacího detektoru rozptylu světla (ELSD) s výchozími parametry.

3.4. Zpracování dat

TQ Analyst (verze 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) byl použit k rozdělení kalibračních a validačních sad, matematické předúpravě spekter, sestavení kalibračních modelů a dalším výpočtům. . K výrobě figurek byl použit Origin (verze 9.1).

4. Závěry

V této studii jsme navrhli rychlou a nedestruktivní metodu pro simultánní analýzuechinakosid, verbaskosid, mannitol, sacharóza, glukóza a fruktózau C. tubulosa pomocí NIRS. Analýzy RMSEC, korelačního koeficientu, RMSEP a hodnot Rp ukázaly, že zavedené kvantitativní modely NIR lze použít k přesné predikci obsahu šesti vybraných účinných složek v C. tubulosa. Ve srovnání s HPLC může metoda NIRS uvedená v této studii ušetřit významnou práci a čas při zachování uspokojivé schopnosti kvantitativní analýzy. Proto zde popsaná metoda má potenciál být použita při kontrole kvality C. tubulosa, a tak vést vývoj kultivační a procesní technologie pro C. tubulosa.

PŘÍRODNÍ CISTANCHE TUBULOSA PRO ZLEPŠENÍ SEXUÁLNÍ FUNKCE PHGS75% ECH 30% ACT 12%