Hepatoprotektivní účinky chitosanu na jaterní toxicitu indukovanou thioacetamidem u samců albínských potkanů

Pro více informací Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: Chitosan, přírodní produkt odvozený od chitinu, přitahuje velkou pozornost jako slibná polysacharidová sloučenina díky svým jedinečným biologickým aktivitám. Tato studie byla navržena tak, aby prozkoumala možné zlepšení potenciálu chitosanu jako přírodního mořského produkturegeneraci jaterv hepatotoxicitě indukované thioacetamidem u samců albinotických potkanů. Padesát zvířat bylo rozděleno do 5 skupin, včetně kontrolní skupiny; skupina, které byla intraperitoneálně injikována jedna dávka thioacetamidu (300 mg/kg b.wt) pro indukci jaterní toxicity; skupina, která dostávala dietu obsahující 5 procent chitosanu po dobu 14 dnů; skupina dostávala dietu obsahující 5 procent chitosanu po dobu 14 dnů, poté jim byl jednou injekčně podán thioacetamid (300 mg/kg tělesné hmotnosti) a poslední skupině, které byl injekčně podán thioacetamid (300 mg/kg tělesné hmotnosti) jednou dieta obsahující 5 procent chitosanu po dobu 14 dnů. Biochemické výsledky ukázaly, že příjem chitosanu před nebo po intoxikaci thioacetamidem zlepšil jaterní markery (ALAT, AST, GGT, ALP, albumin) a funkce ledvin a také plazmatický TNF- . QRT-PCR analýza odhalila, že chitosan downreguloval jaterní TNF-, survivin a c-Myc kvantitativní genovou expresi. Navíc chitosan zlepšil histologický obraz jater. Tato studie ukázala slibný účinek chitosanu na regeneraci jater.

Klíčová slovathioacetamid; chitosan; regenerace jater;přežití; c-myc; tumor nekrotizující faktor- .

1. Úvod

Onemocnění jaterjsou celosvětově život ohrožující onemocnění, zejména v Egyptě [1]. V Egyptě jsou onemocnění jater hlavní příčinou ročních úmrtí [2, 3]. Játra jsou velmi náchylná k toxicitě kvůli jejich roli v metabolismu většiny xenobiotik, jako jsou léky a cizorodé sloučeniny. Buněčná proliferace by naštěstí mohla pomoci játrům k regeneraci po velké buněčné ztrátě [4,5]. V důsledku toho jsou alternativní léčby zásadními požadavky, které je třeba nahradit nebo být používány souběžně se současnými režimy. Chitosan je slibná přírodní polysacharidová sloučenina. Dalo by se získat z odpadu krabů, krevet a langust a buněčné stěny hub.

Chitosan je dobrým zdrojem vlákniny [6,7]. Má četné zdravotní přínosy, jako je regulace imunity, protinádorová aktivita, ochrana jater, antidiabetikum a antioxidant[8]. antibakteriální, hypolipidemické, protizánětlivé [9], účinky na hojení ran [10,11] a hepatoprotektivní účinek [12I. Vzhledem k tomu, že je chitosan netoxický a má velkou biologickou rozložitelnost, je jeho použití při zvládání oxidačního stresu velkou výhodou [13].

Kontaminované potraviny a expozice životního prostředí nebo chemických látek při práci jsou možnými zdroji toxických sloučenin. Z těchto toxických sloučenin je thioacetamid (TAA), široce používaná sloučenina obsahující síru, která se nachází v životním prostředí jako organické sloučeniny síry a používá se v mnoha technických aplikacích [14]. Také se používá k indukci jaterní fibrózy u potkanů ​​ke studiu terapeutického účinku antifibrotických léků [15]. Normálně se TAA zaměřuje na játra, a proto indukuje poškození jater produkcí reaktivních forem kyslíku (ROS) [16,17]. Thiosulfátová skupina TAA je podrobena dalšímu metabolismu prostřednictvím oxidázového systému za vzniku acetamidu a TAA-S-oxidu [18]. Potom. Vzniká oxid TAA-S, který se kovalentně váže na jaterní makromolekuly a iniciuje poškození jater. Toto poškození je ve formě centrilobulární nekrózy [19] a tvorby ROS, které společně způsobují buněčnou smrt prostřednictvím oxidačního stresu [10,20]. Jedna dávka TAA způsobuje degeneraci hepatocytů, infiltraci zánětlivých buněk a zvyšuje hladinu ALP, ALT a AST [21].

Apoptóza je normálně se vyskytující mechanismus buněčné smrti používaný k vývoji a udržení zdravých tkání [22]. V důsledku dysregulované apoptózy by se mohlo vyvinout mnoho onemocnění, jako je rakovina, neurodegenerativní poruchy a onemocnění imunodeficience. Je zajímavé, že samotná apoptóza by mohla stimulovat buněčnou proliferaci a regeneraci tkání v mechanismu známém jako apoptózou indukovaná proliferace. Navíc by apoptotický proces mohl být blokován skupinou proteinů rodiny známých jako inhibitor proteinů apoptózy (IAP) inhibicí aktivity kaspázy. V genomu savců je osm identifikovaných členů rodiny IAP [23]. Nejdůležitějším proteinem v této rodině je survivin, nejmenší člen v této rodině. Je kódován genem BIRC5 umístěným na chromozomu 17 v pásmu. Bylo zjištěno, že protein 17q25.3.c-myc je vysoce zvýšený v procesu regenerace jater [24-26]. TNF- může fungovat dvěma opačnými mechanismy. Mohl by působit jako iniciátor buněčné smrti; alternativně by to mohlo zvýšit buněčnou proliferaci. V důsledku toho hraje důležitou roli v patofyziologii virových hepatitid a alkoholických a nealkoholických onemocnění jater [27,28].

Tato studie zkoumala účinnost chitosanu při posilování regenerace tkání proti jaterní toxicitě vyvolané TAA u potkanů. Byl studován účinek chitosanu na jaterní funkce a funkce ledvin. Kromě toho byla provedena měření prozánětlivého cytokinu TNF- v plazmě a kvantitativní analýza hladin exprese survivinu, genů c-Myc a TNF- v jaterní tkáni. Dále byl zkoumán histologický rys jater.

Cistanchemůže upravit ultrastrukturu jaterních buněk, podporovat syntézu bílkovin a chránit játra.Celkové glykosidy fenylethanolumůže zvýšit množství jaterního glykogenu,echinakosidmůže zlepšit aktivitu drnu a verbaskosid může vychytávat volné radikály a snižovat apoptózu kmenových buněk. Cistanche může také regulovat oběhový systém a má následující účinky: chrání ischemický myokard; snižují krevní lipidy, odolávají ateroskleróze a odolávají trombóze; snížit periferní vaskulární odpor, rozšířit periferní krevní cévy a snížit krevní tlak; chránit játra a odolávat ztučnění jater.

2. Materiály a metody

2.1.Chemikálie.

TAA byl zakoupen od Aldrich Chem Co., Anglie, jako čisté krystaly; byl rozpuštěn ve fyziologickém roztoku a čerstvě připraven před každou injekcí.

Chitosan (CS) byl získán od Sigma-Aldrich (molekulová hmotnost =100 KDa). Chitosan, důležitý polysacharid mořského původu, se připravuje z krunýřů korýšů a používá se jako nový zdroj dietní vlákniny při vývoji léků kvůli své vnitřní bezpečnosti při perorálním podávání [29].

2.2.Experimentální design.

Padesát dospělých samců albínských krys Wistar o hmotnosti přibližně 120-150 g bylo získáno z Animal House Colony Národního výzkumného centra, Káhira, Egypt. Zvířata byla držena v nerezových klecích za standardních laboratorních podmínek s dobrou ventilací a 12-hodinovým cyklem světlo-tma, s relativní vlhkostí 60 ± 5 procent, s volným přístupem ke standardnímu komerčnímu laboratornímu krmivu a vodě z vodovodu.

Před začátkem experimentálního protokolu byly krysy adaptovány na experimentální podmínky po dobu 2 týdnů. Péče o člověka byla aplikována podle standardních kritérií instituce pro péči a použití pokusných zvířat podle metody potvrzené etickou komisí Národního výzkumného centra (FWA 00014747), která sleduje doporučení National Institutes of Health Guide pro péči a použití zvířat v laboratoři (publikace č.{2}}, revidovaná v roce 1985).

Zvířata byla po aklimatizaci rozdělena do pěti skupin (vždy 10 potkanů) následovně:

Skupina (1): normální zdravá zvířata sloužila jako kontrolní skupina.

Skupina (2): (TAA) skupina, ve které byl potkanům intraperitoneálně injikován TAA (rozpuštěný v 0,9% normálním fyziologickém roztoku) v jedné dávce (300 mg/kg tělesné hmotnosti) podle Mustafy et al. [30] pro indukci jaterní toxicity.

Skupina (3): chitosanová skupina, ve které byla zvířata krmena chitosanovou smíšenou bazální stravou v poměru 5 procent (50 g plus 950 g bazální stravy) podle AboZaida et al. [9] po dobu 14 dnů.

Skupina (4): chitosan, potom skupina TAA, ve které zvířata dostávala stravu obsahující 5 procent chitosanu 9] po dobu 14 dnů, poté jim byla intraperitoneálně injikována jedna dávka TAA (300 mg/kg tělesné hmotnosti), jak je uvedeno výše.

Skupina (5): TAA a poté chitosanová skupina, ve které byla zvířatům intraperitoneálně injikována jednorázová dávka TAA (300 mg/kgb.w), jak je uvedeno výše, a poté krmena dietou obsahující 5 procent chitosanu po dobu 14 dnů.

Každý týden a na konci experimentu byla zaznamenávána tělesná hmotnost každého zvířete, aby se sledovala změna tělesné hmotnosti. Na konci experimentálního období zvířata hladověla po dobu 12 hodin. Poté byli anestetizováni inhalací diethyletheru; vzorky krve byly odebrány z retroorbitálního venózního plexu v centrifugačních zkumavkách s použitím heparinizovaných sterilních skleněných kapilár.

Pro separaci plazmy byla část všech vzorků krve sestavena na EDTA, druhá část byla sestavena do zkumavky bez antikoagulancií za účelem oddělení séra. Jak vzorky séra, tak plazmy byly odděleny pomocí centrifugace za studena při 3000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut při 4 stupních. Alikvoty plazmy a séra byly uchovány v -20 stupni pro biochemickou analýzu.

Jakmile byla odebrána krev, byla zvířata usmrcena cervikální dekapitací

Játra každé krysy byla vyjmuta a důkladně promyta pomocí izotonického fyziologického roztoku, vysušena a rozdělena na dvě části; první řez byl bleskově zmražen přímo v kapalném dusíku a konzervován při -80 stupni před izolací RNA pro analýzu genové exprese. Naproti tomu druhá část byla fixována ve formálním fyziologickém roztoku (10 procent), aby byla použita při histopatologickém vyšetření.

2.3.Biochemická analýza.

Aktivity sérové ​​aspartátaminotransferázy (ASAT), alaninaminotransferázy (ALAT), alkalické fosfatázy (ALP) a gama-glutamyltransferázy (GGT), stejně jako albumin

hladiny močoviny a kreatininu byly odhadnuty spektrofotometricky za použití souprav reagencie zakoupených od bio-diagnostic Co., Egypt. Koncentrace plazmatického tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-a) byla odhadnuta pomocí techniky ELISA za použití soupravy TNF-ELISA pro potkany zakoupené od Glory Science Co., Ltd., USA.

2.4. Analýza genové exprese.

Pomocí kvantitativní analýzy (Real-Time PCR) byla ve vzorcích jaterní tkáně stanovena exprese genů pro survivin, c-Myc a TNF-.

2.4.1. Izolace RNA, čištění a kvantitativní RT-PCR v reálném čase.

RNA byla izolována ze 100 mg vzorku jaterní tkáně pomocí Qiazol pufru (Qiagen, USA); RNA byla následně vyčištěna pomocí RNAeasy Mini kit (Qiagen, USA); RNA byla reverzně transkribována a výsledná cDNA byla poté amplifikována. Počet kopií genu -aktinu, survivinu, c-myc a TNF-alfa byl kvantifikován pomocí soupravy QuantiFast Sybergreen RT-PCR (Qiagen, USA). Všechny vzorky byly testovány v triplikátech a počty kopií byly normalizovány na 100000 kopií provozního beta-aktinového genu. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1. Podmínky cyklování RT a následné PCR byly následující, 50 stupňů po dobu 10 minut, 95 stupňů po dobu 5 minut, 95 stupňů po dobu 15 s, poté 60 stupňů po dobu 30 s, počet cyklů byl 40 cyklů . MiniOpticonTM Bio-Rad Real-Time Thermal Cycler byl použit pro kvantizaci genové exprese.

2.5. Histopatologické vyšetření.

Po fixaci jaterních tkání v 10% fyziologickém roztoku po dobu 24 hodin byly vzorky tkáně promyty běžnou vodovodní vodou; poté se podrobí dehydrataci za použití ethylu (sériová ředění směrem nahoru k absolutnímu ethylu). Vzorky byly vyčištěny v xylenu a uloženy do parafínu při 56 stupních v horkovzdušné peci po dobu 24 hodin. Bloky voskové tkáně byly připraveny pro dělení na 4 mikrony tloušťky kalovým mikrotomem. Řezy byly zbaveny parafinu, obarveny hematoxylinem a eosinem a nakonec vyšetřeny pomocí elektrického světelného mikroskopu [31].

2.6. Statistická analýza.

Data byla analyzována pomocí verze 13 počítačově založeného statistického balíčku pro společenské vědy. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± SD ze tří nezávislých experimentů. Statistická významnost rozdílu byla stanovena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) následované LSD post hoc srovnávacím testem při p menší nebo rovno 0,05, což bylo definováno jako statisticky významné.

3. Výsledky a diskuse

3.1.Výsledky.

Údaje uvedené na obrázku 1 ukázaly, že přírůstek tělesné hmotnosti u skupiny zvířat intoxikovaných TAA byl významně snížen (-308,5 procenta), zatímco u skupiny s pouze chitosanem došlo k významné změně (50 procent), když byly obě skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou. Je zajímavé, že skupina zvířat s chitosanem a potom TAA vykazovala významný nárůst (289,7 procenta) v přírůstku tělesné hmotnosti; podobně skupina zvířat TAA a poté chitosan vykazovala významný nárůst (239,56 procent) v přírůstku tělesné hmotnosti, když byly obě skupiny srovnány se skupinou zvířat intoxikovaných TAA.

Pokud jde o testy jaterních funkcí, krmení normálních potkanů ​​5% chitosan-bazální dietou po dobu 14 dnů nenarušilo jaterní ani ledvinové funkční testy, které odrážejí jejich bezpečný účinek při této koncentraci ve stravě; naopak, jaterní toxicita indukovaná TAA u potkanů ​​významně zvýšila (94,47 procent) aktivitu sérové ​​aspartátaminotransferázy (ASAT) ve srovnání s kontrolní skupinou. Nicméně významný pokles (-32 procent a -15,4 procenta) sérové ​​aktivity ASAT byl zaznamenán v obou režimech krmených chitosanem (skupiny chitosan-TAA a TAA-chitosan, v tomto pořadí) ve srovnání s Skupina intoxikovaná TAA. Významné zvýšení (91,89 procent) aktivity sérové ​​alaninaminotransferázy (ALAT) bylo zaznamenáno ve skupině TAA ve srovnání s kontrolní skupinou. Ve slibném účinku vedly skupiny chitosan, pak TAA a TAA a poté chitosan k významnému snížení (-40,8 procenta a 32,3 procenta, v tomto pořadí) sérové ​​(ALAT) aktivity ve srovnání se skupinou TAA. Podobně bylo zjištěno významné zvýšení (232,9 procent) aktivity sérové ​​alkalické fosfatázy (ALP) ve skupině zvířat intoxikovaných TAA ve srovnání s kontrolní skupinou. Krmení potkanů ​​smíšenou stravou s chitosanem po dobu 14 dnů před intoxikací TAA vedlo k významnému poklesu (-54,06 procent) v sérové ​​ALPaktivitě; také významné snížení (-50,6 procent) sérové ​​aktivity ALP bylo zaznamenáno ve skupině zvířat, která krmila chitosan smíšenou stravou po intoxikaci TAA, když byly obě skupiny zvířat srovnány se skupinou léčenou pouze TAA.

Pokud jde o aktivitu sérové ​​gamaglutamyltransferázy (GGT), TAA-indukovaná jaterní toxicita významně zvýšila (223,5 procenta) aktivitu sérové ​​GGT, zatímco skupina zvířat léčených pouze chitosanem nezhoršila svou aktivitu, když byly obě skupiny srovnány s touto kontrolní skupiny. Zajímavé je, že dříve krmili zvířata smíšenou stravou s chitosanem

TAA-intoxikace prokázala významné snížení (-50,28 procent) sérové ​​GGT aktivity; podobně byl zaznamenán významný pokles (-41.0 procent o) v aktivitě GGT ve skupině zvířat, která byla intoxikována TAA před krmením smíšenou stravou s chitosanem, když byly obě srovnány s TAA- intoxikovaná skupina. Hladina sérového albuminu byla významně snížena (-36,58 procenta) po injekci TAA (skupina TAA), zatímco skupina s chitosanem odhalila nevýznamnou změnu (2,4 procenta o) hladiny sérového albuminu, když byly obě skupiny srovnány s kontrolní skupinou . Avšak krmení zvířat chitosanem v různých režimech, buď před nebo po TAA-intoxikaci, odhalilo významné zvýšení (50 procent a 38,4 procent, v tomto pořadí) hladin sérového albuminu, když byly obě srovnány se skupinou TAA (tabulka 2).

S ohledem na funkce ledvin varlat (Tabulka 2) byl pozorován významný vzestup (82,67 procent a 232,77 procent) v sérových hladinách močoviny a kreatininu, v daném pořadí, ve skupině intoxikované TAA; mezitím skupina léčená pouze chitosanem vykázala nevýznamnou změnu (19,3 procent a -15 procent, v tomto pořadí), když byly obě skupiny srovnány s kontrolní skupinou. Slibným způsobem vykázala skupina zvířat chitosan a TAA významný pokles (-36,04 procenta a -45,2 procenta) sérových hladin močoviny a kreatininu, v tomto pořadí, ve srovnání se skupinou TAA . Krmení krys smíšenou stravou s chitosanem po dobu 14 dnů po intoxikaci TAA navíc prokázalo významný pokles (-30,6 procent a-35,10 procent) sérových hladin močoviny i kreatininu, v tomto pořadí, když byly obě skupiny porovnány se skupinou zvířat léčených TAA.

Jak je znázorněno na obrázku (2), významné zvýšení (98,26 procent) bylo zaznamenáno u hladiny tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-) ve skupině zvířat intoxikovaných TAA; zatímco skupina s chitosanem vykazovala nevýznamnou změnu (-2,6 procent) v hladině TNF- v plazmě, když byly obě skupiny zvířat srovnány s kontrolní skupinou. Oblíbeným způsobem krmení zvířat smíšenou stravou s chitosanem v různých režimech, buď před nebo po intoxikaci TAA, odhalilo významný pokles (-36,6 procenta a -31,57 procenta, v tomto pořadí) v plazmatické hladině TNF-, když byly obě srovnány se skupinou TAA.

3.1.1. Genová exprese.

Jak je znázorněno na obrázku 3, skupina zvířat intoxikovaných TAA vykázala významné snížení (-81 procent) v expresi jaterního genu pro survivin, zatímco skupina se samotným chitosanem vykazovala nevýznamné změny v expresi jaterního genu pro survivin, když byly obě skupiny porovnány s kontrolní skupinou. Bohužel obě skupiny zvířat léčených chitosanem, pak TAA a TAA a poté chitosanem nevykazovaly žádné výrazné změny (1,27 procent a -3,2 procent, v tomto pořadí) v této genové expresi ve srovnání s intoxikovanými TAA skupina zvířat.

Pokud jde o expresi genu c-myc, skupina pouze s chitosanem vykázala významné zvýšení (400 procenta). Nicméně skupina zvířat intoxikovaných TAA neovlivnila (0,0 procenta) expresi tohoto genu, když byly obě skupiny srovnány s kontrolní skupinou. Navíc obě skupiny s chitosanem, pak TAA a TAA a poté chitosanem vykazovaly významný nárůst (300 procent a 700 procent, v tomto pořadí) v hladinách exprese genu c-myc ve srovnání se skupinou TAA (obrázek 4).

Data odhalila, že skupina zvířat léčená chitosanem zaznamenala pouze výrazné zvýšení (73,33 procent) hladiny jaterní exprese TNF-genu; navíc skupina zvířat intoxikovaných TAA vykázala významné zvýšení (368,3 procenta) při srovnání obou skupin s kontrolní skupinou. Toto zvýšení bylo významně sníženo (-66,5 procenta, resp. -57,3 procenta) při léčbě chitosanem, buď před nebo po intoxikaci TAA, ve srovnání se skupinou zvířat TAA (obrázek 5).

3.1.2.Histologický nález.

Normální kontrolní skupina vykazovala normální architekturu jaterní tkáně s normální centrální žílou, zachovaný portální trakt s minimemzánětlivébuňky a většinou normální hepatocyty (obrázek 6). Mezitím výzkumy skupiny TAA odhalily zhoršení jater reprezentované vakuolizovanými buňkami hepatocytů, dilatovanou přetíženou centrální žilou dilatovanou přetíženým portálním traktem a moderovanými rozptýlenými zánětlivými buňkami (obrázek 7). Skupiny s chitosanem prokázaly normální architekturu jaterní tkáně s mírně dilatovaným, centrálním, normálním portálním traktem s minimem zánětlivých buněk a normálními hepatocyty (obrázek 8). Skupina Chitosan a TAA odhalila zdeformovanou dilatovanou centrální žílu, rozptýlené zánětlivé buňky a dilatované přetížené sinusové prostory, výraznou degeneraci hepatocytů s tukovými změnami a zvýšenou tloušťku hepatocytů (tloušťka více než 2 buňky) (obrázek 9). Kromě toho skupina TAA a poté chitosan prokázala překrvené dilatované centrální žíly rozptýlené zánětlivé buňky, výrazný dilatovaný přetížený portální trakt a rozptýlené degenerované hepatocyty (obrázek 10).

3.2.Diskuse.

Játra představují největší žlázu v těle, kde řídí mnoho biologických procesů, které vyžadují energii, jako je metabolismus, biosyntéza, vylučování, sekrece a detoxikace. Tyto velké energetické nároky dělají z jater tkáň vysoce závislou na kyslíku. Po masivní buněčné ztrátě pomáhá buněčná proliferace při regeneraci jater. Regenerace však může selhat, pokud ztráta překročí určité meze, což má za následek selhání jater a nakonec smrt 32].

Bylo provedeno mnoho studií za účelem testování účinků antioxidantů na zlepšení jaterních onemocnění a podporu normálních jater. Antioxidanty se objevily jako terapeutická možnost pro léčbu a prevenci nemocí souvisejících s životním stylem. Potřebuje však další studie k objasnění mechanismu účinku 33,34]. Chitosan (CS) je cenný mořský polysacharid, který se získává z krunýřů některých korýšů. Má mnoho dobře prokázaných biologických přínosů, jako je regulace imunity, protinádorová, jaterní ochrana, antidiabetický, antibakteriální, antioxidační, antiobezitní účinek, účinky na hojení ran a hypolipidemický účinek [5].

Tato studie zkoumala protektivní a terapeutickou účinnost chitosanu při posilování regenerace tkání při TAA indukované jaterní toxicitě u potkanů. TAA se tradičně používá k indukci poškození jater v experimentálních zvířecích modelech [15,35]. Toxický účinek TAA je způsoben jeho metabolity, jako je acetamid, sulfát a složky odvozené od sulfoxidu. Tento metabolit způsobuje strukturální deformace strukturálních proteinů a enzymů, což vede k jejich inaktivaci. Svou úlohou metabolit TAA mění buněčnou permeabilitu, zvyšuje objem jádra, koncentruje intracelulární vápník a inhibuje mitochondriální aktivitu, což má za následek buněčnou smrt. V důsledku tohoto metabolitu jsou narušeny leukotrieny jako silný zánětlivý mediátor vylučovaný jaterními buňkami [36].

V této studii léčba chitosanem pozitivně ovlivnila jaterní enzymy. Na rozdíl od očekávaných účinků intoxikace TAA aktivity sérových AST, ALT, ALP a GGT vykazovaly významné zvýšení ve skupině léčené TAA ve srovnání s normální kontrolou. Tyto výsledky jsou v souladu s Baskaran et al. [37], Jain a Singhai [38,39] Osama et al. [40], kteří spojili zvýšení aktivity sérových transamináz s oxidačním stresem a peroxidací lipidů, která je důsledkem toxického účinku TAA, kdy jsou lipidy, proteiny a DNA poškozeny působením volných radikálů, což má za následek hepatocelulární poškození nekróza. Normálně nekrotické buňky vypouštějí svůj obsah do krevního řečiště, což vede ke zvýšení aktivity transamináz. Na druhé straně protektivní a kurativní skupiny léčené chitosanem vykazovaly jasnou downregulaci v aktivitách ALAT, AST, ALP a GGT, což lze přičíst antioxidantům, imunomodulacím a/nebo hojení ran a ochraně jater chitosanem [9]. Podobně byla snížena hladina sérového albuminu u TAA-intoxikovaných potkanů ​​v důsledku jaterní dysfunkce syntézy proteinů v důsledku narušeného endoplazmatického retikula a mitochondrií hepatocytů. Tato hladina však byla up-regulována a normalizována léčbou chitosanem buď v ochranných nebo kurativních skupinách.

Intoxikace TAA vedla k insuficienci ledvin, protože se zvýšily hladiny močoviny a kreatininu v séru; toto zhoršení bylo agonizováno Begum et al. 41], který uvádí, že tubulární poranění u akutní tubulární nekrózy má na starosti především sníženou glomerulární filtraci. Bylo také navrženo, že zahrnuté tubulární abnormality jsou zablokováním tubulů, což způsobuje zpětný tok glomerulárního filtrátu. Renální alterace u potkanů ​​léčených TAA tedy může být způsobena škodlivými účinky ROS. Toto zvýšení však bylo zvráceno po léčbě chitosanem jako buď ochranné nebo kurativní léčbě. Toto pozorování je v souladu s pozorováním Mohameda [42], který uvedl, že požití chitosanu významně snížilo hladiny močoviny a kreatininu u pacientů se selháním ledvin a přisoudil tento účinek jednomu nebo dvěma možným mechanismům: prvním z nich je aktivace renálních funkcí pro clearance. metabolitu dusíku vede ke snížení močoviny a kreatininu, zatímco druhou možností je, že se chitosan spojí s metabolitem dusíku v trávicím traktu a poté se vyloučí, což vede ke snížení močoviny a kreatininu.

V současné studii akutní toxicita TAA významně snížila expresi survivinového genu v jaterní tkáni ve srovnání s kontrolní skupinou. Avšak krmení zvířat bazální dietou se směsí chitosanu jako kontrola léčiva a jako ochranná léčba před toxicitou TAA vedlo k nevýznamnému zvýšení hladin exprese survivinového genu. Survivin má dobře zavedenou funkci ve fázi G2/M buněčného cyklu; během buněčného dělení narušuje survivin podjednotku chromozomálního pasažérského komplexu [43,44]. Survivin je exprimován v normálních proliferujících a regenerujících tkáních a bylo popsáno, že potlačuje apoptózu a pomáhá při progresi buněčného cyklu [45]. Bylo zjištěno, že exprese survivinu má pozitivní souvislost s počtem hepatocytů v regenerujících se játrech. To lze vysvětlit zjištěním, že survivin se účastní separace sesterských chromatid během mitózy 46]; tato fakta mohou interpretovat snížení exprese survivinového genu v post-TAA-intoxikaci. Hagemann a kol. [46] uvedli, že když je snížena exprese survivinu, je přerušena lokalizace členů chromozomálního pasažérského komplexu, a proto se sníženou aktivitou Aurur B jsou narušeny fosforylace centromerických cílových proteinů a procesy cytokineze.

V předchozích studiích na hlodavcích byla exprese survivinu významně zvýšena po částečné hepatektomii a po operaci. Navíc bylo zjištěno, že exprese survivinu je zvýšena ve štěpu při transplantaci lidských jater. Jak u hlodavců, tak u lidí je nadměrná exprese survivinu spojena s proliferací a ne s apoptózou; v důsledku toho je survivin důležitý při proliferaci a mitóze hepatocytů, nejen při regeneraci, ale také během normálního vývoje [46].

Akutní toxicita vyvolaná TAA výrazně neovlivnila hladinu exprese genu c-myc v jaterní tkáni. Léčba chitosanem jako léková kontrola, ochranná nebo kurativní léčba skutečně významně a dramaticky upregulovala hladinu exprese genu c-myc. Bylo publikováno, že vývojové a mitogenní signály v normálních, netransformovaných buňkách regulují expresi c-myc [47]. Hlavní role c-myc je podporovat buněčnou proliferaci a bránit buněčné diferenciaci. Bylo zjištěno, že progrese buněčného cyklu je zesílena c-myc regulací mnoha proteinů řídících buněčný cyklus, jako jsou cykliny (D, E, A a B1) a cyklin-dependentní kinázy (CDK1.2. 4,6). E2F transkripční faktory. Na druhé straně bylo zjištěno, že c-myc mnoha způsoby potlačuje aktivitu blokátorů buněčného cyklu, jako jsou p15, p21 a p27 [48].

Snížení hmotnosti a proliferujícího buněčného jaderného antigenu je spojeno s poklesem exprese proteinu c-myc během regenerace jater. Kromě toho byl výrazně snížen buněčný cyklus regulující protein p53 a počet buněk ve fázi G2 buněčného cyklu. V důsledku toho je c-myc považován za silný pozitivní regulátor buněčné proliferace. Kromě toho bylo zjištěno, že c-myc antisense omezuje regeneraci jater u potkanů ​​[24,26].

Podobně v ledvinové tkáni bylo zjištěno, že c-mycgen je aktivován v buňkách ledvinových tubulů během regenerace a po poškození ledvin vyvolaném kyselinou listovou in Vivo [49]. Bylo také zjištěno, že C-myc podporuje biosyntézu proteinů, kde byla syntéza proteinu třikrát vyšší ve fibroblastech nadměrně exprimujících c-myc než v jejich nativních buněčných liniích. C-myc vykonává tento účinek regulací ribozomové transkripce a biogeneze; c-myc také pracuje v koordinaci s jadernými RNA polymerázami (RNA pol I a III) pro regulaci biogeneze a translace ribozomů.

Kromě toho byla transkripce ribozomální RNA stimulována c-myc, který aktivuje syntézu proteinů [50].

V současných výzkumech vedla akutní toxicita TAA k významnému zvýšení hladin exprese genu TNF- v jaterní tkáni a rovněž ke zvýšeným hladinám v plazmě, přičemž toto zvýšení bylo významně sníženo při léčbě chitosanem, a to jak protektivní, tak i léčebné, ve srovnání s TAA- intoxikovaná skupina. Toto zjištění je v souladu s předchozím pozorováním Park et al. [51], kteří uvedli zlepšující účinek chitosanu na hladinu TNF. Zhang a kol. [52] uvedli, že zesítěný karboxymethyl chitosan zvýšil aktivity enzymů zánětlivých faktorů na začátku léčby; poté je však vrátí na jejich normální úroveň. Navrhli účinky zesíťovaného karboxymethylchitosanu na hojení ran prostřednictvím jeho downregulačních účinků na aktivitu jaterních enzymů potkanů.

TNF- je produkován z neuronálních buněk, fibroblastů, lymfoidních buněk, žírných buněk, endoteliálních buněk a makrofágů. TNF- zprostředkovává své prozánětlivé a proapoptotické účinky prostřednictvím interakce s jejich membránovými receptory (TNF-R1 a TNF-R2). Oba receptory zprostředkovávají dvě různé signální dráhy a aktivace jedné je doprovázena inaktivací druhé [51].

Naše výsledky naznačují pozitivní roli chitosanu v regeneraci tkání, což je v souladu s Shilpou et al.[53], kteří zjistili, že léčba částečně hepatektomizovaných potkanů ​​nanočásticemi chitosanu a kyselinou gama-aminomáselnou zvýšilo vychytávání tritiovaného thymidinu ve srovnání s částečně hepatektomizovanými skupinami bez nanočástic léčba. Celkovým výsledkem léčby nanočásticemi chitosanu ve spojení s kyselinou gama-aminomáselnou je zvýšení regenerace hepatocytů a snížení buněčné smrti ve srovnání s hepatektomizovanými krysami. Současné výsledky jsou také v souladu s Chen et al. [54], kteří uvedli, že nanočástice chitosanu zlepšily regeneraci jater u potkanů ​​trpících akutním selháním jater. Schopnost chitosanu vázat matrici umožňuje růst a aktivaci makrofágů, které jsou nezbytné pro regeneraci tkání. Rána u psa ošetřeného chitosanem ukázala úplné vyléčení po třech týdnech. Avšak v kontrolní skupině léčené fyziologickým roztokem trvá pouze proces vytvrzování čtyři týdny. Ve skupině léčené chitosanem se vytvořila keratinová vrstva jako důkaz regenerace pojivové tkáně. Kromě toho byla vytvořena síť kolagenových vláken k ochraně neovaskulatury rány [55].

V současné studii histologický nález odhalil zhoršený vzorec jaterní tkáně ve skupině TAA; nicméně tento vzor byl výrazně zlepšen ve skupině chránící chitosanu a nějakým způsobem ve skupině léčivých chitosanu.

4. závěr

Dospělo se k závěru, že chitosan může zvýšit regeneraci jater při jaterní toxicitě indukované TAA, buď jako kurativní nebo proliferativní. Navíc vykazoval protizánětlivý účinek, protože snižoval hladinu TNF-, jak na úrovni genu, tak na úrovni proteinu. Naproti tomu chitosan zvýšil genovou expresi survivinu a c-myc, což jsou zesilovače buněčné proliferace. K objasnění přesného mechanismu, kterým chitosan ovlivňuje expresi genu c-myc, survivin a TNFC, by mohly být provedeny další studie. Chitosan se proto doporučuje používat u onemocnění jater, kde je potřeba regenerace tkání.