GTP energetická závislost endocytózy a autofagie u stárnoucího mozku a Alzheimerovy choroby

Abstraktní

Zvýšený zájem o stárnutí aAlzheimerova chorobaPoruchy autofagie v mozku související s (AD) vyvolávají důležité otázky týkající se regulace a léčby. Vzhledem k tomu, že mnoho kroků v endocytóze a autofagii závisí na GTPázách, jsou zapotřebí nová měření buněčných hladin GTP.hodnotit regulaci energie při stárnutí a AD. Nedávný vývoj poměrových GTP senzorů (GEVALS) a zjištění, že hladiny GTP nejsou uvnitř buněk homogenní, zvyšujínové otázky regulace GTPázpodle místní dostupnosti GTP. V této recenzi zdůrazňujememetabolismus GTPve vztahu k Rab GTPázám zapojeným do tvorby časných endozomů, pozdních endozomů a lysozomálního transportu k provedení autofagické degradace poškozeného nákladu. Specifické GTPázy řídí makroautofagii (mitofágii), mikroautofagii a autofagii zprostředkovanou chaperony (CMA). Z toho vyplývá, že místní úrovně GTP by řídily autofagii, ne-li nadměrně. Další úrovně kontroly jsou dány redoxním stavem buňky, včetně zapojení thioredoxinu. V celé této recenzi zdůrazňujemezměny související s věkemto by mohlopřispívají k deficitům v GTP a AD. Dospěli jsme k závěru s vyhlídkami na zvýšení hladin GTP a zvrácení oxidačních redoxních posunů souvisejících s věkem k obnovení autofagie. Hladiny GTP by proto mohly regulovat četné GTPázy zapojené do endocytózy, autofagie a vezikulárního obchodování. Při stárnutí by metabolická adaptace na sedavý způsob života mohla narušit mitochondriální funkci, generující méně GTP a redoxní energie pro zdravé hospodaření s amyloidem atau proteostáza, synaptickou funkci, azánět.

Klíčová slova GTP · Energetika · Autofagie · Mitofágie ·Endocytóza· Lysozomy ·Alzheimerova choroba · Stárnutí

Kliknutím sem získáte bylinný přípravek Cistanhe na léčbu Alzheimerovy choroby

GTP, další energetická měna, při stárnutí a AD

Syntéza vysokoenergetických molekul ATP a GTP závisí na redoxním stavu NAD plus /NADH a jejich dostatečných koncentracích. Syntéza ATP z glykolýzy je primárně poháněna oxidační silou NAD a působením na redukující cukry. Syntéza ATP oxidativní fosforylací v mitochondriích je poháněna generací NADH v cyklu TCA pro redukci pyruvátu, glycerolu nebo mastných kyselin s kyslíkem jako koncovým akceptorem elektronů v řetězci transportu elektronů. Naše studie bez označení na živých hipokampálních neuronech potkanů ​​nebo myší ukazují na věkem podmíněnou depleci NAD a NADH, která by mohla narušit syntézu ATP a GTP [1–4]. Toto vyčerpání bylo dále prohloubeno v neuronech z myší nesoucích transgeny pro lidský beta-amyloid a tau. Dále posmrtná analýza enzymů cyklu TCA ukázala až 40% poškození enzymů cyklu TCA z mozků AD ve srovnání s kontrolami stejného věku [5]. Energetická deplece NAD plus a NADH související s věkem navíc k mitochondriálnímu poškození aktivity enzymů TCA související s AD by mohla lokálně ovlivnit hladiny ATP a GTP, i když jejich objemové koncentrace byly ovlivněny minimálně.

Energie dostupná z hydrolýzy GTP je stejná jako hydrolýza ATP, ale GTP se využívá pro jiné účely než ATP kvůli selektivitě specifických enzymů. Koncentrace GTP v buňkách jsou v průměru desetkrát nižší než milimolární ATP. GTP je hlavním regulátorem mnoha energeticky závislých buněčných procesů syntézy proteinů a vezikulárního transportu zahrnujících endocytózu a autofagii. Odhadovaná celková koncentrace GTP v buňkách savců se pohybuje v rozmezí 250–700 μM [6], ale volný GTP ve výběžcích rakovinných buněk se blíží 30 μM [7]. Mezi hlavní proteiny poháněné GTP patří dynaminy pro membránové štěpení a fúzi, malé regulační GTPázy a mikrotubuly, jak je podrobně popsáno níže. Kromě de novo syntézy z inosinu pomocí IDMPH2 a xanthosinu pomocí GMPS jsou buněčnými zdroji GTP primárně lokalizované nukleosiddifosfátkinázy (NDPK) z nemetastatických genů (NME; někdy nazývané NM23), které přeměňují ATP na GTP [8]. Existuje alespoň deset členů rodiny genů NME, ale pouze první čtyři mají aktivitu nukleosid difosfátkinázy. Podle Allen Brain Atlas jsou NME1 až 4 silně a selektivně exprimovány v myším a lidském hipokampu, kde je paměť u AD narušena. NME1–3 jsou cytoplazmatické, zatímco NME4 je mitochondriální. Vzhledem k tomu, že při stárnutí a AD jsou ovlivněny oba odlišné procesy endocytózy a autofagie, předpokládáme, že změny upstream ovlivňují obojí, možná důsledek omezení hladin GTP na tyto kritické funkce pro amyloid související s věkem a AD.

Měření úrovní GTP

Ačkoli GTP reguluje několik klíčových procesů pro přežití buněk, měření hladin GTP v živé buňce za fyziologických a patologických podmínek je obtížné kvůli vysokému obratu a existenci jak proteinu vázaného, ​​tak volného stavu. Bianchi-Smira glia a kol. [9] popsali nový geneticky kódovaný GTP senzor (GEVAL) založený na žlutém fluorescenčním proteinu, který detekuje poměrové změny v koncentraci bez GTP a GTP vázané in vitro a in vivo. Nedávno stejná skupina oznámila mechanismus regulace GTPázy Rac1 při buněčné invazi buněčnou linií lidského melanomu řízenou lokální produkcí GTP [7] a přezkoumala svou metodologii [10]. Jak uvidíme v tomto přehledu, GTP hraje klíčovou roli během endocytózy a autofagie související se zpracováním amyloidu. V současné době studujeme změny GTP související s věkem ve zpracování A v primárních kulturách hipokampálních neuronů z trojité transgenní myši 3xTg-AD a jeho vliv na změny v autofagii. Obrázek 1 ukazuje předběžné výsledky transfekce GEVAL530 do primárních dospělých neuronů z tohoto AD myšího modelu ve srovnání s netransgenními myšími neurony. Jak pozorovali Bianchi-Smiraglia et al. [7] vidíme nerovnoměrnou distribuci GTP v procesech a okrajích soma při měření volného GTP (obr. 1Aa), s nižšími hladinami volného GTP v neuronech 3xTg-AD (obr. 1Ac). Jak je podrobně uvedeno v části 10, předběžné ošetření těchto neuronů prekurzorem NAD plus, nikotinamidem, zvýšilo hladiny volného GTP (obr. 1Ab, d). 530-uM Kd pro GEVAL530 použitý v těchto experimentech naznačuje, že lokální koncentrace volného GTP je v rámci několikanásobku 530 uM. Na obr. 1B jsme zkoumali vázaný GTP, který se zdá být lokalizován ve váčcích a zvýšen nikotinamidem (obr. 1Bf, h), zejména v neuronech 3xTg AD. Předběžné důkazy ukazují, že neurony ošetřené NME1 siRNA snižují své hladiny volného GTP (Santana Martinez, nepublikováno). Další studie s dospělými neurony napříč věkovým spektrem určí věkovou závislost deficitů GTP a schopnost je napravit pomocí NAD plus -prekurzorů. Vzhledem k zásadní úloze GTP v procesech vezikulárního obchodování endocytózy a autofagie a tomuto předběžnému důkazu změn v GTP s genetikou podobnou AD poskytují následující části podrobnosti o těchto procesech a účincích stárnutí a Alzheimerovy choroby na ně. Výsledek tohoto přehledu zdůrazňuje potřebu nových metod, jako jsou sondy GEVAL, k přímému měření změn ve vázaném a volném GTP a celkových koncentracích GTP.

Obr. 1 Poměrná měření GTP v primárních myších hipokampálních neuronech od myší středního věku transfekovaných senzorem GEVAL530 Falešně zbarvené poměrové snímky neuronů pixel po pixelu ukazují nejednotné rozložení GTP. (a) Nadbytek volného GTP/vázaného GTP středního věku (14 měsíců) netransgenního (NTg) na okrajích a apikálního dendritu ve srovnání s (c) neuronem středního věku (10 měsíců) 3xTg-AD. (b, d) Zvýšení volného GTP v neuronech ošetřených 2 mM nikotinamidem za 24 hodin. (e, g) Neošetřené neurony vykazují vezikulárně vázaný GTP, který je zvýšen u (f, h) neuronů ošetřených 2 mM nikotinamidem do 24 hodin

Endocytóza: GTP závislost při stárnutí a AD

V procesu endocytózy buňka internalizuje makromolekuly a receptory vázané na ligand a povrchové proteiny včetně amyloidního prekurzorového proteinu (APP) [11] (obr. 2A). Ze dvou hlavních endocytárních drah dochází k vychytávání APP začleněného do plazmatické membrány většinou prostřednictvím vychytávání zprostředkovaného klatrinem (obr. 2B.1) spíše než kaveolou z náplastí bohatých na cholesterol (obr. 2B.2). Hydrofobní A se však rozděluje do oblastí lipidových raftů bohatých na cholesterol v plazmatické membráně s následným vychytáváním kaveolovou cestou [12] (obr. 2B.2). V obou případech se komplexy dynamin GTPázy sestaví při invaginaci, aby katalyzovaly zakřivení membrány závislé na GTP pro konečnou fúzi a uvolnění zralých vezikul z plazmatické membrány [13–15]. Lokální GTP fueling je katalyzován NME1 a 2 nukleotidovými fosfátkinázami, které se vážou na dynamin [16]. Rozhodnutí časného endozomu Rab5 GTPázy směrem k exocytóze a recyklaci receptoru nebo transformaci na pozdní endozom Rab7 GTPázu pro degradaci.

Rab5 GTPáza je považována za marker pro časný endozom [17]. Protein Rab5 je přítomen v plazmatické membráně, ve vezikulách potažených klatrinem a časných endozomech (obr. 2). V buněčných a fy modelech Huntingtonovy choroby se Rab5 účastní tvorby autofagozomů k regulaci autofagie a eliminaci toxického mutantního huntingtinu [18]. Inhibice Rab5 snižuje konjugaci proteáz Atg5-Atg12 regulujících autofagii, což vede ke snížení tvorby autofagozomů. Konjugát Atg12-Atg5 podporuje lipidaci Atg8 a lipidovaný Atg8 usnadňuje tvorbu autofagozomů a selektivní rozpoznání nákladu během autofagie [19].

Dalším faktorem přispívajícím k Rab5-zprostředkované autofagii je fosfatidylinositol-3-kináza (PI3K). Komplex PI3-kinázy inhibuje autofagii aktivací signální dráhy Akt/mTOR [20]. Podjednotka P110 komplexu PI3K reguluje katalytickou aktivitu komplexu Vps34, aby podpořila tvorbu PI3P [21]. Tento krok je nezbytný pro tvorbu autofagozomů. P110 podporuje přechod z Rab{12}} GDP na Rab5-GTP. Nadměrná exprese P110 zmírňuje autofagický deficit po aktivaci makromolekulárního komplexu složeného z Rab5, Vps34 a Beclin1, což zase vede k tvorbě autofagozomů [22]. Zacílení na tyto specifické proteiny může objasnit terapeutické cesty ke zmírnění patologie AD.

Obr. 2 Endocytóza amyloidního prekurzorového proteinu (APP). N-koncová část proteinu APP se 770 zbytky se zeleným stínováním A náchylného k agregaci vyžaduje štěpení BACE a gama peptidázami. B Endocytóza APP. (1) Tvorba vnitřního pupenu z plazmatické membrány řízená klatrinem s endoproteázami BACE a 훾-sekretázou. Endocytóza podporovaná dynaminem přijímá lokální GTP pomocí NME1. (2) Mikrodomény obohacené o cholesterol (lipidové rafty) váží APP zpracovaný na A nebo A adsorbovaný z parenchymu. (3) Časný endozom přitahuje GTPázu Rab5, která je rozpoznána jinou GTPázou, Rab11, aby zprostředkovávala (4) endocytickou recyklaci receptorů zpět do plazmatické membrány. Alternativně (5) Rab7 zprostředkovává segregaci časnou do pozdních endozomů, což umožňuje další zpracování APP a akumulaci A. (6) Pozdní fúze endozomu s (7) lysozomem za účelem degradace obsahu. Některé agregované A mohou být odolné vůči trávení a při narušení endozomu se A může akumulovat v cytosolu.

Membránově vázaný Rab5 je klíčovým faktorem při přímé podpoře aktivace Rab7 závislé na Mon1-Ccz1- a membránové fúzi závislé na Rab7- [23]. Mon1-Ccz1 je heterodimerní komplex guaninového nukleotidového výměnného faktoru GEF, který aktivuje Rab5. Po1-zprostředkované přemístění GEF Rab5 vede k přemístění Rab5 pomocí Rab7. Komplex C-Vps funguje jako GEF pro Rab7 a podporuje přechod Rab7 ze stavu vázaného na HDP do stavu vázaného na GTP pro aktivaci Rab7. Gen rezistence vůči ultrafialovému záření (UVRAG) stimuluje aktivaci Rab7 interakcí UVRAG‐ C‐Vps prostřednictvím výměny Rab7 GDP/GTP [24]. Dalším regulačním bodem v autofagickém procesu je homotypická fúze a vakuolový protein‐sorting (HOPS) komplex, který aktivuje kvasinkovou vakuolární Ypt‐Rab GTPázu během membránové fúze [25]. Jednou ze 6 podjednotek komplexu HOPS je komplex třídění vakuolárních proteinů třídy C (C‐Vps), který obsahuje Vps11, Vps16, Vps18 a Vps33. Pozdní endocytické vezikuly Rab7 následně fúzují s lysozomy pro degradaci nákladu (obr. 2).

Změny v endozomálním obchodování Rab 5 a Rab 7 v myších modelech a v AD

V myších modelech AD s mutacemi v amyloidovém prekurzorovém proteinu (APP) nebo A-produkujícím presenilinu se dráha endozom–autofagozom–lysozom jeví jako dysregulovaná zčásti v důsledku poruchy acidifikace lysozomů, která nedokáže dostatečně aktivovat proteázu a lipázy [26]. V myších modelech AD velká perinukleární tělíska obsahující agregáty A značí autofagozomový marker LC3 kolokalizovaný s Rab7 a pozdními endozomálními a lysozomálními složkami. To by mohlo být způsobeno selháním ochranné upregulace nebo patologickým poškozením. U neuronů kultivovaných z myší 3xTg-AD napříč věkovým rozpětím jsme zjistili, že agregovaný vezikulární A se s věkem zvyšuje 30–50krát, nejvýrazněji v raných endozomech a mitochondriích značených Rab5-, ale také v Rab{{9} }značené pozdní endozomy a autofagozomy [27]. Akumulace A 42 a A 45 podobná sněhové kouli naznačuje, že staré neurony nebyly schopny dokončit autofagickou degradaci těchto delších agregátů A. Předpokládáme, že narušená produkce energie ve starých neuronech omezuje energetickou kapacitu pro dokončení autofagie. Ve srovnání s hladinami v mladém hipokampu a mozkové kůře se u 7–12-měsíčního myšího hipokampu APP/PS1 hladiny Rab7 snížily spolu se snížením aktivátorů Beclin1 a Rubicon a zvýšením inhibitoru Rubicon [28]. V mladším hipokampu a všech věkových skupinách v kortexu Beclin1 aktivuje Rab7, zatímco Rubicon inhibuje aktivaci Rab7 prostřednictvím suprese interakce genu proteinu asociovaného s odolností vůči UV záření (UVRAG) a genu pro třídění vakuolárních proteinů (Vps). Nedostatek Rab7 u kvasinek a ovocných mušek vede k masivní akumulaci autofagozomů [29]. Rab7 knockdown také inaktivuje mTORC1/S6K1 a lokalizaci mTOR v pozdních endozomech [30]. Je zajímavé, že inhibice dalších fází endocytárního obchodování nemění aktivitu mTORC1, což naznačuje, že intaktní pozdní endozomy jsou klíčové pro signalizaci mTORC1 v autofagii. To je důležitý důvod, proč cílení na mTOR nemusí zpomalit stárnutí nebo AD.

Regionálně selektivní upregulace proteinů Rab 5 a Rab7 a mRNA u AD naznačuje selektivní příspěvky k patologii onemocnění nebo nedostatečný ochranný mechanismus [31]. A se hromadí převážně v Rab7-pozitivních pozdních endozomech a autofagických vakuolách neuronových buněk [32] způsobem souvisejícím s věkem [27], což způsobuje internalizaci A a následné zvýšení Rab7 spouštějící neuronální degeneraci [33]. Blokování pozdní endocytární dráhy supresí Rab7 indukuje tvorbu amyloidních fibril závislou na A na buněčném povrchu, což způsobuje zvětšení endozomu [34], což vede k urychlené recyklaci Rab7 a endocytickému transportu A do lysozomů k degradaci [35]. Inhibice proteolýzy Iysoso mal také může ovlivnit axonální retrográdní transport autofagických organel způsobujících axonální dystrofii podobnou AD [36]. Praktické intervence na podporu Rab7-zprostředkované autofagie by však mohly zpozdit nebo zvrátit progresi AD. Příklady zahrnují posun od sedavého stavu ke cvičení, středomořskou dietu a sloučeniny zvyšující energii, jako jsou prekurzory NAD, k vytvoření redoxního posunu [4] (část 10). Další cestou je podivný objev, že hladiny guanosinmonofosfátreduktázy 1 (NADPH-dependentní GMPR1) jsou zvýšeny v mozcích AD, což by samo o sobě mohlo snížit hladiny GTP a zvýšit signalizaci AMP [37]. Neurofibrilární klubka tau byly sníženy, když byla tato aktivita inhibována u AD myší.

S progresí z mírné kognitivní poruchy do AD byly endozomální exprese Rab5 a Rab7 upregulovány v hipokampálních neuronech CA1, jak bylo měřeno pomocí transkripčního mikročipu [31]. Zvětšení Rab5-pozitivních endozomů bylo spojeno s neurofibrilárními klubky a ukládáním amyloidu. Neurotrofické faktory, jako je nervový růstový faktor (NGF), se vážou na jejich Trk receptory a internalizují se do Rab5-pozitivních endozomů, aby iniciovaly downstream signalizaci [38]. Je zajímavé poznamenat, že signální endozom je zachován jako rané endozomy Rab5 a během jejich tranzitu dlouhými axony neprogreduje do pozdních endozomů Rab7 [39]. To odlišuje doručení signálu zprostředkovaného receptorem od endozomového zpracování směrem k autofagii [40]. Po aktivaci NGF TrkA rekrutuje Rab5‐GAP pro rychlou konverzi GTP‐Rab5 na GDP‐Rab5, aby udržela hladinu GTP‐Rab5 pod kontrolou, což zabraňuje konverzi Rab5 na Rab7, což vede k inhibici signalizace NGF/TrkA a předčasná degradace.

Funkce Rab5 je v časných fázích AD narušena [41]. Přetrvávající hyperaktivace Rab5 promotovala endocytickou dráhu směrem k pozdním endozomům, lysozomové fúzi a autofagii, což mělo za následek předčasnou degradaci signalizace neurotrofního faktoru a neuronální atrofii. Vps35 a Vps26, dva klíčové retromerní proteiny, byly také sníženy v mozcích AD [42]. Vps26 se váže na SorLA, což je třídící receptor, který řídí přenos APP z endozomů do Golgiho aparátu. Snížení Vps retromerních proteinů vede k abnormálnímu komplexu Vps-SorLA, který brání akumulaci APP transportního pouzdra v endozomech, kde podléhá beta-sekretáze. Napodobování fosforylace APP na S655 v bazolaterálním motivu APP 653YTSI656 však může zlepšit vyhledávání APP v procesu zprostředkovaném retromery, což způsobí snížení lysozomálního cílení APP a snížení produkce Abeta [43]. Zvýšení plné délky APP a APP fragmentu ‐CTF může naopak zvýšit aktivitu Rab5 GTPázy indukující zvětšení časných endozomů [44]. Je zajímavé, že neuronální atrofie vyvolaná APP ‐CTF mohla být zachráněna dominantně negativní mutantou Rab5 in vitro [39] i in vivo [45].

Čistým výsledkem stárnutí je vyčerpání pozdních endozomů, pozdní endocytická dysfunkce a zhoršená lysozomální fúze. U AD se endocytóza A zvyšuje do zvětšených raných endozomů Rab5. Úloha Rab7 v AD musí být ještě jasně objasněna, protože byla pozorována jak časná upregulace, tak pozdní downregulace Rab7 ovlivňující neuronální zdraví v obou směrech. Jak zdůrazňuje Bianchi-Smiraglia et al. [7], celkový buněčný GTP, který je měřen v homogenátech, neumožňuje stanovení volného GTP dostupného lokálně pro Rab GTPázy. Volná měření GTP nebyla dosud popsána, takže jejich možná role ve věkových a AD souvisejících poruchách endocytózy není prozkoumána. Proto bude důležité měřit volný GTP v živých buňkách a účinky variací volného GTP na endocytózu jako funkci věku a modelů AD.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

PRODEJNA:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop