Zelená syntéza a charakterizace nanočástic železa syntetizovaných z vodného extraktu listů Vitex Leucoxylon a jeho biomedicínské aplikace

Abstraktní:K získání vodného extraktu byla použita metoda studené extrakceVitex leukoxylonlisty v poměru 1:10. Nanočástice železa (FeNP) byly syntetizovány pomocí vodného extraktu z listůV. leucoxylonjako redukční činidlo. K výrobě FeNP byl použit fytomedicínský přístup smícháním 1 ml rostlinného extraktu s 1 mM síranu železitého. Ke zkoumání syntetizovaných FeNP byly použity rastrovací elektronová mikroskopie (SEM), infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR), ultrafialová – viditelná spektroskopie (UV-Vis) a energeticky disperzní rentgenová spektroskopie. Redukční reakce se projevila změnou barvy roztoku a vznik černé barvy potvrzuje, že došlo k vytvoření FeNP. Největší absorpční pík (max) byl nalezen při 395 nm při UV-Vis spektrální analýze. FTIR spektraV. leucoxylonvodný extrakt z listů vykazoval posuny v některých vrcholech, konkrétně 923,96 cm−1 a 1709,89 cm−1s funkčními skupinami karboxylovými kyselinami, nenasycenými aldehydy a ketony, které chyběly ve FTIR spektrech FeNP a jsou zodpovědné za tvorbu FeNP. FeNP s průměry mezi 45 a 100 nm byly pozorovány na snímcích SEM. Tvorba FeNP byla potvrzena pomocí EDX, která vykazuje silný signál v oblasti kovového železa při 6–8 Kev. XRD odhalila krystalickou povahu a střední průměr 136,43 nm.Antioxidant,protizánětlivé, cytotoxické ahojení ranin vitro testy prokázaly významnou aktivitu FeNP. Kumulativní nálezy této studie ukazují, že zelená syntéza FeNPzvyšuje jeho biologickou aktivitua může sloužit jakomožné činidlo pro hojení kožních ranacytotoxické činidlo proti rakovině. Je zapotřebí budoucí studie zaměřená na identifikaci mechanismů zapojených do syntézy FeNPV. leucoxylona jeho biomedicínské aplikace.

Klíčová slova:Vitex leukoxylon; nanočástice železa; SEM; hojení ran; cytotoxický

CISTANCHE VÝHODY PROANTIOXIDANT,PROTIZÁNĚTLIVÉ, CYTOTOXICKÉ AHOJENÍ RAN

1. Úvod

Aplikace nanotechnologií ve vědě a technice k výrobě nových materiálů na úrovni nanoměřítek je rychle rostoucí oblastí [1]. Nanotechnologie se zabývá výrobou materiálů na atomové úrovni, aby získaly charakteristické vlastnosti, se kterými lze manipulovat pro preferované aplikace. Tato oblast rychle roste se svými aplikacemi ve vědě a technologii pro výrobu nových materiálů na úrovni nanoměřítek [2]. Různá průmyslová odvětví přijala nanotechnologii v posledních letech díky jejím aplikacím v oblastech elektronických úložných systémů [3], biotechnologie [4], magnetické separace a prekoncentrace cílových analytů, cíleného dodávání léčiv [5] a vehikul pro geny a léky. doručení [3,5,6]. V důsledku toho mají tyto částice potenciál mít podstatný dopad na společnost v důsledku široké škály aplikací, pro které je lze použít. Nanočástice (NP) jsou hmoty částic, které mají velikost menší než sto nanometrů a jsou považovány za klíčové strukturní hmoty v oblasti nanotechnologií. Vyšší aktivita NP je jak jejich definující charakteristikou, tak kvalitou, pro kterou jsou nejpozoruhodnější [7]. Organické a anorganické NP jsou dvě primární klasifikace, které lze použít na nanočástice. Anorganické nanočástice mohou zahrnovat magnetické NP, NP ušlechtilých kovů (jako je zlato a stříbro) a polovodičové NP (jako je oxid titaničitý a oxid zinečnatý). Organické nanočástice mohou zahrnovat uhlíkové NP. Anorganické nanočástice přitahují obrovskou pozornost, protože nabízejí vynikající materiálové vlastnosti spolu s funkční všestranností. Byly zkoumány jako možné nástroje pro lékařské zobrazování i pro léčbu nemocí kvůli velikostním charakteristikám, které mají [8]. Různorodé chemické, fyzikální a biologické vlastnosti NP jsou silně ovlivněny řadou parametrů, včetně velikosti a morfologie nanočástic, stejně jako povrchového povlaku, které jsou běžně určovány během syntézy nanočástic. Ztráta zamýšlené biologické aktivity je způsobena snížením koloidní stability. pH, iontová síla a množství proteinů, které za relevantních okolností interagují s AgNP, mají vliv na koloidní stabilitu. V důsledku toho je správný výběr techniky syntézy rozhodující pro získání požadovaných charakteristik částic pro konkrétní aplikace [9].

V současné době existuje široká škála NP, které lze syntetizovat pomocí různých fyzikálních, chemických, biologických a hybridních procesů. Podle zjištění velkého počtu výzkumných studií zahrnují fyzikální a chemické procesy výroby nanočástic použití organických rozpouštědel, nebezpečných sloučenin, významného množství energie a stabilizačních látek, které nejsou biologicky rozložitelné [10]. V oblasti zelených nanotechnologií je proto stále populárnější syntéza NP za použití přirozeně dostupných materiálů, jako jsou rostlinné extrakty, různé mikroorganismy, jejich metabolity a několik přírodních huminových látek [11,12] jako redukčních a uzavíracích činidel. Metody syntézy, které jsou šetrné k životnímu prostředí, byly použity k výrobě široké škály kovových nanočástic, včetně stříbra, zlata, železa, mědi a zinku. Vývoj jednoduchých a ekologicky přijatelných metod pro syntézu NP je jedním z klíčových zaměření nanotechnologie. Biomateriály, jako jsou mikroorganismy a rostlinné extrakty, mohou být použity v procesu přípravy široké škály NP [13,14]. Protože jsou však některé organismy patogeny, je nebezpečné s nimi zacházet. Aby mikroorganismy prospívaly, musí být udržovány v kultuře a podrobeny pečlivě kontrolovaným podmínkám, včetně teploty, pH a dalších parametrů. Protože odpadá pracný proces udržování mikrobiální kultury, může se někdy syntéza NP pomocí rostlinných částí ukázat jako výhodnější než jiné biologické procesy [15]. Výsledkem je, že si získal velkou pozornost díky svým přirozeným vlastnostem, mezi které patří využití přírodních zdrojů, rychlost, šetrnost k životnímu prostředí a benignost. Tyto lákavé vlastnosti jsou naprosto nezbytné pro použití v lékařských aplikacích. Nanočástice produkované zelenou syntézou mají dobře definovanou a kontrolovanou velikost, neobsahují znečišťující látky a metoda je snadno zvětšitelná. To jsou některé z dalších výhod zelené syntézy [16]. Biologická aktivita syntetizovaných nanočástic je do značné míry určována a dolaďována zelenými materiály používanými pro stabilitu a redukci kovových iontů. Jednou z ideálních vlastností NP by mělo být, že musí mít vynikající schopnost rozlišovat mezi potenciálními cíli (patogeny) a savčími (hostitelskými) buňkami [17].

Z tohoto důvodu byl v současném výzkumu zkoumán vodný extrakt z listů V. leucoxylon pro svůj potenciál usnadňovat tvorbu nanočástic železa (FeNP). Železo je jedním z prvků, které lze na Zemi nalézt v největším množství. V poslední době je uznáván jako nová třída důležitých NP kvůli skutečnosti, že má řadu jedinečných vlastností, včetně vysoké koercivnosti a superparamagnetismu. Cataly sis, elektronická zařízení, ukládání informací, senzory, technologie dodávání léků, biomedicína, magnetická záznamová zařízení a čištění životního prostředí jsou jen některé z mnoha zajímavých aplikací, které využívají FeNP [18]. Navíc podle řady studií mohou být FeNP vytvářeny z různých rostlinných extraktů. Tyto rostlinné extrakty zahrnují list Eucalyptus globulus [19], list granátového jablka [20] a popel z banánové slupky [21]. Rostlina V. leucoxylon, která byla použita v současné studii, je členem čeledi Verbenaceae. Je také známý jako pětilistý cudný strom (Kannada: Sengeni, Holenekki, Hollalakki) a lze jej nalézt v regionu podél břehů řek ve stálezelených a polostálých lesích a vlhkých listnatých lesích podél potoků. Může dosáhnout výšky až 20 m a řadí se mezi skromné ​​až velké listnaté stromy. Podél indických lesů Západního Ghátu se vyskytuje ve velkém množství. Bylo popsáno, že infuze extraktu z listů V. leucoxylon má širokou škálu farmakologických aktivit, jako jsou protizánětlivé, antioxidační, antipsychotické, antidepresivní, antiparkinsonické a antihyperlipidemické aktivity [22]. Přírodní produkty se v průběhu historie a zejména v lidovém léčitelství využívaly k léčbě celé řady neduhů a nemocí. Tato praxe sahá až do starověku. Metody chemie přírodních produktů, které existují již dlouhou dobu, umožnily najít obrovské množství bioaktivních sekundárních metabolitů, které pocházejí ze suchozemských a mořských zdrojů. U značného počtu těchto přirozeně se vyskytujících látek se nyní zvažuje použití jako potenciálních léčiv [23].

Existuje velké množství přirozeně se vyskytujících chemikálií a živin, které dosud nebyly objeveny a které jsou užitečné pro lidstvo. V důsledku toho vzniká okamžitá poptávka po výzkumu a vývoji inovativních terapeutických možností, které lze úspěšně využít v terapeutických intervencích při minimálním množství nežádoucích účinků.

V současnosti navrhovaný proces zelené syntézy FeNP je odlišný a nákladově efektivní. V současné studii byl učiněn pokus vytvořit nanočástice při pokojové teplotě bez použití jakýchkoli chemikálií nebo fyzikálních technik. Ve snaze syntetizovat nanočástice železa byla vybrána rostlina Vitex leucoxylon a byly provedeny komplexní systematické in vitro modely pro hodnocení účinnosti nanočástic železa. O této rostlině bylo publikováno pouze omezené množství výzkumných studií o konceptu nanočástic a jejich biomedicínských aplikacích. V důsledku toho jsme se rozhodli, že by bylo přínosné provést tento výzkum s ohledem na následující cíle: screening na fytochemikálie a měření počtu sekundárních metabolitů u V. leucoxylon; zelená syntéza a charakterizace FeNP z V. leucoxylon; srovnávací studie antioxidačních a protizánětlivých účinků V. leucoxylon a jeho FeNPs in vitro; in vitro cytotoxická aktivita vodného extraktu z listů V. leucoxylon a jeho FeNP proti rakovině kůže, rakovině plic a rakovině ústní dutiny; in vitro aktivita hojení ran vodného extraktu listů V. leucoxylon a jeho syntetických FeNP testem poškrábání.

2. Materiály a metody

2.1. Sběr rostlinného materiálu

V březnu 2022 byly čerstvé listy V. leucoxylon utrženy z lesní oblasti Anshi na Západním Ghátu v okrese Uttar Kannada ve státě Karnataka v Indii. Listy byly identifikovány a ověřeny Dr. Kotresha K., taxonom, Katedra botaniky, Karnataka Science College, Dharwad; Karnataka, odkazem na vzor poukazu uložený na katedře botaniky, Karnataka Science College, Dharwad, Karnataka. Po sběru byl čerstvý rostlinný listový materiál omyt pod tekoucí vodou z vodovodu, vysušen na slunci a poté rozdrcen na hrubý prášek pomocí mechanického mlýnku. Prášek byl uchováván v nádobách, které byly uzavřeny při pokojové teplotě, aby mohl být později použit v procesu extrakce surového rozpouštědla.

2.2. Příprava rostlinného extraktu

Pomocí Soxhletova zařízení bylo 25 g práškových listů extrahováno po dobu 48 hodin 250 ml destilované vody. Vodný extrakt byl dále zahuštěn pomocí rotační odparky a poté byl vysušen v exsikátorech před uchováváním v uzavřené láhvi při 4 °C až do použití. Pro syntézu FeNP byl vodný extrakt použit jako redukční a stabilizační činidlo.

2.3. Rozpouštědla a činidla

Všechny použité chemikálie a rozpouštědla měly analytickou kvalitu a byly zakoupeny od společnosti Hi-media (Hubli, Indie).

2.4. Fytochemická analýza

Podle postupu popsaného Deepti et al. (2012) byl surový vodný extrakt z listů V. leucoxylon kvalitativně testován na přítomnost různých fytochemických složek, jako jsou flavonoidy, alkaloidy, fenoly, glykosidy, steroly, ligniny, saponiny, antrachinony, taniny a redukující cukry [24].

2.5. Syntéza nanočástic železa

Nejprve byl 1 ml vodného extraktu z listů V. leucoxylon přidán k 1 0 ml 0,05 mM vodného roztoku FeSO4 a směs byla protřepána. Při teplotě místnosti a v tmavém prostředí byl proveden celý proces reakční směsi. Oxidační/redukční reakce byla jasně viditelná poté, co byla bezbarvá reakční směs inkubována a zreagována po požadovanou dobu [25]. Aby se odstranily veškeré stopy vodného extraktu z čerstvě syntetizovaných FeNP, které byly po odstředění při 10,000 otáčkách za minutu po dobu 10 10 minut během požadované reakční doby ponechány uschnout v prášku, byla vodná směs obsahující FeNP odstředěna podruhé a redispergován v dvakrát destilované vodě a vysušen [26].

2.6. Charakterizace FeNP

Několik metod, jako je ultrafialová-viditelná spektroskopie (UV-Vis), infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací (FTIR), rastrovací elektronová mikroskopie a energeticky disperzní rentgenová spektroskopie, rentgenová difrakce (XRD), analyzátor velikosti částic a zeta potenciál, byly využity k charakterizaci FeNP.

2.6.1. Analýza založená na UV-viditelné spektroskopii

Nejprve byl vyhodnocen 1 ml alikvot koloidního roztoku FeNPs v křemenných kyvetách pomocí UV-viditelné spektroskopie (U-3310, Hitachi, Tokio, Japonsko), s použitím destilované vody jako reference a 0,05 mM FeSO4 jako slepý pokus pro ověření redukce železitých iontů v koloidním roztoku [27].

2.6.2. Analýza na bázi FTIR

Funkční skupiny (skupiny), které byly navázány na železný povrch a podílely se na syntéze FeNP, byly identifikovány pomocí FTIR spektroskopie (S700, Nicolet, MA, USA), [28]. Po 72 hodinách inkubace byly FeNP izolovány opakovanou centrifugací (3–4krát) reakčních směsí při 10, 000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut. Supernatant byl nahrazen deionizovanou vodou a peleta byla uložena jako prášek. Po vysušení byly FeNP podrobeny analýze FTIR za použití procesu peletování bromidem draselným v poměru 1:100.

2.6.3. Analýza založená na skenování-elektron-mikroskopie

Ke zkoumání nanočástic a stanovení tvaru jejich povrchu byla použita rastrovací elektronová mikroskopie (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA). Substráty byly připraveny na čistém 5 mm x 5 mm Si substrátu odštěpeném z plátku o průměru 100 mm. Substrát byl ponechán reagovat po dobu 2 h až 6 h a vzorek byl připraven centrifugací koloidního roztoku při 10,000 otáčkách za minutu po dobu 5 min. Peleta byla po mnohanásobném odstředění vysušena, poté byla znovu dispergována v deionizované vodě a postup byl opakován. Nakonec byla získána suchá peleta, která byla dále podrobena strukturní charakterizaci pomocí SEM analýzy podle postupu popsaného National Institute of Standards and Technology, NIST-2007 [29].

2.6.4. Energeticky disperzní rentgen

Po vysušení na uhlíkem potažené měděné mřížce byly redukované FeNP analyzovány pomocí EDX (JSM-IT 500, Jeol, Boston, MA, USA), což také umožnilo stanovit elementární složení.

2.6.5. Potenciál Zeta

Pozorování NP Zeta potenciál je užitečným nástrojem pro získání dalších poznatků o stabilitě koloidních NP. Amplituda zeta potenciálu poskytuje náznak možné stability koloidu. Podle Meléndreze a kol. (2010), částice jsou považovány za stabilní, pokud jsou jejich hodnoty zeta potenciálu buď kladnější než plus 30 mV, nebo zápornější než 30 mV [30]. Tuto skutečnost je třeba vzít v úvahu. Laserový zetametr byl použit pro získání údajů o povrchových zeta potenciálech (Malvern zeta seizer 2000, Malvern, UK). Kapalné vzorky nanočástic, celkem 5 mililitrů, byly zředěny 50 mililitry dvakrát destilované vody a jako suspenzní roztok elektrolytu byl použit 2 mm na čtvereční metr chloridu sodného. Poté bylo pH modifikováno, dokud nedosáhlo požadované úrovně. Vzorky byly míchány celkem 30 minut. Po protřepání nádoby bylo zaznamenáno pH v rovnováze a byl stanoven zeta potenciál kovových částic. Pro účely stanovení povrchového potenciálu FeNP byl využit zeta potenciál. V každém případě byla uvedená hodnota průměrem výsledků tří jednotlivých měření. Když se hodnoty zeta potenciálu pohybovaly od vyšších než plus 30 mV do nižších než 30 mV, byla stanovena kritéria pro stabilitu NP [31].

2.6.6. Analyzátor velikosti částic

Aby bylo možné určit velikost částic vzorku, bylo na něm provedeno testování PSA poté, co byl lyofilizován a poté dispergován pomocí ultrazvuku (SZ-100, Horiba, Kyoto, Japonsko).

2.6.7. Analýza rentgenové difrakce (XRD) Analýza

Syntetizované nanočástice železa z vodného extraktu listů V. leucoxylon byly podrobeny XRD analýze (Smart Lab SE, Rigaku, Tokio, Japonsko), aby se určila povaha a také průměrná velikost nanočástic.

2.7. Stanovení antioxidační aktivity pomocí metod in vitro

2.7.1. Antioxidační test na redukci železitých iontů (FRAP)

Podle Oyaizu (1986) byla s menší modifikací hodnocena redukční schopnost železitých iontů [32]. Po dobu 30 min při 50 ◦C bylo 2,5 ml 20 mM fosfátového pufru a 2,5 ml 1% ferrikyanidu draselného přidáno do 2,5 ml extraktu z listů V. leucoxylon a jeho syntetizovaných FeNP smíchaných s kombinace. Po inkubační době byla směs doplněna 2,5 ml 10% hmotn./obj. kyseliny trichloroctové a 0,5 ml 0,1% hmotn./hmotn. chloridu železitého před inkubací po dobu dalších 10 minut. Nakonec byl použit UV-V spektrofotometr k detekci absorbance při 700 nm. Jako standard byla použita kyselina askorbová. Každý vzorek byl testován třikrát.

2.7.2. Test zachycování peroxidu vodíku

Na základě schopnosti vodného extraktu z listů V. leucoxylon a jeho syntetických FeNP vychytávat peroxid vodíku byla hodnocena antioxidační aktivita těchto sloučenin. Nejprve bylo přidáno {{0}},6 ml fosfátového pufru (pH-7,4) obsahujícího 4 mM H2O2 k 0,5 ml standardní kyseliny askorbové o známé koncentraci, stejně jako zkumavky obsahující rostlinné extrakty v různých koncentracích. v rozmezí od 100 µL do 500 µL (pH-7,4). S použitím fosfátového pufru a slepého roztoku bez peroxidu vodíku jsme hodnotili absorbanci roztoku při 230 nm po 10 minutách. K vytvoření kontroly byl místo vzorku nebo standardu použit fosfátový pufr [33]. Každý vzorek byl testován třikrát. Pro výpočet procenta inhibice byl použit vzorec.

2.7.3. DPPH Free-Radical-Scavenging

Test Extrakt z listu V. leucoxylon a syntetizované FeNP byly testovány na jejich schopnost vychytávat volné radikály pomocí DPPH radikálu jako činidla [34]. Vzorky byly smíchány s roztokem radikálů DPPH (60 M) v ethanolu (100 ul) v různých koncentracích (w/v). K měření absorbance směsi při 517 nm po 30 minutách inkubace ve tmě při teplotě místnosti byl použit UV-Vis spektrofotometr. Jako standard pro experiment byla použita kyselina askorbová. Ke stanovení aktivity zachycování DPPH každého vzorku byla použita následující rovnice:

kde Ac představuje absorbanci kontrolní reakce, která se provádí smícháním 100 1 ethanolu se 100 1 roztoku DPPH, a At představuje absorbanci testovaného vzorku. Experimenty byly prováděny v trojicích. Pro každý vzorek byla vypočtena hodnota IC50. Vyšší úroveň aktivity volných radikálů byla indikována tím, že reakční směs měla nižší absorbanci.

2.7.4. Fosfomolybdenový (PM) test

Celková antioxidační aktivita byla stanovena standardní technikou Prieto et al., 1999. Každá zkumavka obsahující 3 ml destilované vody a 1 ml roztoku molybdenanového činidla obdržela vodný extrakt z listů V. leucoxylon a jeho FeNP v různých koncentracích v rozmezí od 100 ul do 500 ul. Tyto zkumavky byly inkubovány po dobu 90 minut při 95 °C. Absorbance reakční směsi byla měřena při 695 nm poté, co byly tyto zkumavky upraveny na pokojovou teplotu po dobu 20–30 minut po inkubaci. Referenčním standardem byla kyselina askorbová [35].

2.8. Hodnocení in vitro protizánětlivé aktivity

Protizánětlivý účinek vodného extraktu z listů V. leucoxylon a jeho generovaných FeNP byl hodnocen pomocí metody denaturace proteinů, kterou nastínil Elias et al., 1988, s mírnými úpravami [36]. Jako standardní lék byl použit diklofenak sodný. Reakční směs obsahující 2 ml známé koncentrace vyrobených FeNP (100 g/ml) se standardním diklofenakem sodným (100 g/ml) a 2,8 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (pH 6,4) byla smíchána s 2 ml čerstvého slepičího vejce. albuminem (1 mM) a inkubovány při 27 ± 1 °C po dobu 15 min. Denaturace byla vyvolána umístěním reakční směsi do vodní lázně o teplotě 70 °C po dobu 10 minut. Po ochlazení byla měřena absorbance při 660 nm za použití dvakrát destilované vody jako slepého pokusu. Každý test byl proveden třikrát. Pro výpočet procenta inhibice denaturace proteinu byl použit následující vzorec:

kde, At=absorbance testovaného vzorku; Ab=absorbance kontroly.

2.9. Stanovení cytotoxické a protirakovinné aktivity nanočástic železa pomocí MTT testu

Byl hodnocen účinek V. leucoxylon a jeho syntetizovaných FeNP na životaschopnost nerakovinných fibroblastových buněk L292 a jeho protirakovinná aktivita na rakovinu kůže (A375), rakovinu plic (A549) a rakovinu ústní dutiny (KB-3-1). za použití standardního testu MTT podle Carmichaela et al., (1987) [37]. Všechny buněčné linie byly získány z National Center for Cell Science (NCCS), Pune, Indie. Hodnoty procentuální inhibice růstu buněk (IC50) byly odvozeny pomocí křivek dávka-odpověď pro každou buněčnou linii a pro výpočet procenta inhibice růstu byl použit následující vzorec. Základem tohoto experimentu je konverze MTT na purpurový formazanový produkt mitochondriální dehydrogenázou zdravých buněk [38].

2.10. Studie hojení ran in vitro pomocí testu Scratch Assay

V současném výzkumu byly zkoumány schopnosti šíření a migrace buněk buněčné linie L292 způsobené vzorky se známými koncentracemi rostlinného extraktu a nanočástic železa [39]. Kultivační destičky zvířecích buněk s DMEM médiem doplněným 10 procentem FBS a 2 procenty antibiotika Pen-Strep (Darmstadt, Německo) byly použity k zahájení procesu buněčné kultivace. Sterilní plastová špička pipety byla použita k poškrábání jednovrstvého soutoku buněk poté, co vyrostly na zhruba 50,000 buněk na ml. Roztok PBS byl použit k odstranění jakýchkoli nežádoucích buněčných zbytků. Jako negativní kontrola byly použity neošetřené buňky, zatímco standardní kyselina askorbová byla použita jako pozitivní kontrola pro vzorky polymeru o známé koncentraci. Dalších 24 hodin byly buňky udržovány při 37 °C s 5 procenty CO2. Pro vyšetření relativní buněčné migrace a uzavření rány byly poškrábané buněčné vrstvy inkubovány a zobrazeny v intervalech od 0 h do 6 h do 12 h a 24 h. Ke kvantifikaci vzdálenosti mezery byla použita kalibrace měření MagVision Software (X64, 2016, Magnus, New Delhi, Indie) při rozlišení 4×. Pro stanovení uzavření rány a rychlosti migrace byl použit vzorec uvedený níže:

s ohledem na následující: A0h=plocha rány měřená bezprostředně po poškrábání; ATh=plocha rány měřená po h hodinách; Rm=rychlost migrace (µm/h); Wf=počáteční šířka rány (µm); a T=čas migrace (hodina).

2.11. Statistická analýza

Data jsou prezentována jako střední standardní odchylka a standardní chyba a každý experiment byl proveden třikrát. Software SPSS verze 20 byl použit k provedení jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) na rozdílech v průměrném skóre, které existovalo mezi skupinami.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

PRODEJNA:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop