Gossypitrin, přirozeně se vyskytující flavonoid, zmírňuje poškození neuronů a mitochondrií vyvolané železem: část 2
Mar 16, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.5. Detekce Gos-Fe(I) komplexů
Pravděpodobnou hypotézou pro vysvětlení výše uvedených výsledků je, že Gos tvoří přechodný komplex s Fe(ll), který usnadňuje jeho oxidaci kyslíkem. Tento přechodný komplex by mohl doručit své elektrony snadněji než citrát Fe() a vytvořit tak stabilnější komplex s Fe(II). Obrázek 6A ukazuje typické spektrum Gos s maximální absorpcí při 276, 332 a 38 0 nm (černá čára). Přidání Fe() vyvolalo koncentračně závislý pokles maximálních absorpčních píku a objevení se nového v blízkosti 500 nm (obrázek 6A). Výskyt pole spekter pocházejících ze spektra Gos byl potvrzen přítomností izosbestického bodu na λiso=405 nm (viz černé tečky), což ukazuje na chemickou rovnováhu (komplexaci) mezi volným a komplexovaným Gos. Vložka (obrázek 6A) ukazuje tvorbu komplexu se stechiometrií 2:1 (Gos-železo). Stechiometrie takových komplexů Gos-železo byla stanovena Jobovou metodou, která ukazuje bod zlomu při molárním poměru 0,5.
Další důkazy o korelaci mezi železem a Gos byly získány IR spektroskopií (obrázek 6B). Pro volný Gos a jeho komplex železa bylo širokopásmové pásmo nacházející se v rozsahu 3000-4000 cm- považováno za roztažení vodíku- vázané hydroxylové skupiny díky přítomnosti molekul vody. Režim v(C=}O)protahování volného Gos nastává při 1654 cm-I, která byla posunuta směrem k tvorbě komplexu 1636 cm-Iupon. Tento výsledek naznačuje, že Fe(Ⅱ) koreluje s karbonylovým kyslíkem [31]. Kromě toho přítomnost v(Fe-O) natahovací vibrace při 630 cm-I potvrzuje tvorbu komplexu železo-Gos, protože volný Gos nevykazuje takový pás.
Obrázek 6. (A) Účinky Fe(II) na Gos UV-VIS spektrum (200-600 nm). Inkubační směs obsahující 125 mM sacharózu, 65 mM KCl, 1 0 mM HEPES pufr (pH 7,2), 2 mM citrát a Gos 1,6 μM. Koncentrace Fe (I) od shora dolů byly {{12 }}, 0.16, 0.32, 0.48, {{20}}.64, 0.8, 0.96 a 1.12 μM.Inset∶ Jobův graf pro komplex Gos-Fe（II） při konstantní celkové koncentraci 【Fe （D）】 plus 【Gos】=1.6 μM. Černá tečka označuje izosbestický bod. Šipky směřující dolů a nahoru ukazují snížení a zvýšení hodnot absorbance při 380 a 500 nm, v daném pořadí. Experimenty byly prováděny při 28 stupních. Rychlost skenování byla 2nm/sA základní linie byla stanovena s inkubační směsí plus 1,6 μM Fe（I）.（B）Infračervená spektra Gos a Gos-Fe（I）. Jsou uvedeny typické příklady.
2.6. Gos Prevented Fe(III) Redukce askorbátem
Železitý stav železa podporovaný Gos představuje pravděpodobný antioxidační mechanismus, protože brání katalytické aktivitě Fe(II). Nicméně, Fe(III) může být stále znovu redukováno na svou železitou formu přírodními redukčními činidly, jako je askorbát. Ten by mohl znovu naplnit biologické systémy Fe(II), které se účastní Fenton-Haber-Weissových reakcí, generujících extrémně reaktivní radikál ·OH. Abychom tyto možnosti prozkoumali, použili jsme 1,10-fenantrolin k měření úrovní tvorby Fe(II) z roztoku Gos （100 μM）ošetřeném 2 mM askorbátem a různými koncentracemi Fe（II）（{{6} } μM). Obrázek 7 ukazuje, že nepřítomnost Gos umožnila maximální rychlost redukce Fe(II) na Fe(II) (černá čára se sklonem 5,85×10-3); tento proces byl však zpomalen přítomností Gos (1-min inkubace, zelená čára) a po 5 min inkubace s Gos se rychlost redukce Fe(I) askorbátem snížila téměř 3krát (červená čára se sklonem 2,04× 10-3). Tento výsledek ukazuje schopnost Gos inhibovat askorbátem zprostředkovanou redukci Fe() na Fe(I)
Obrázek 7. Gos inhibuje redukci Fe(ⅢI) askorbátem v nepřítomnosti mitochondrií krysích jater. Experimentální podmínky: 125 mM sacharóza, 65 mM KCI, 10 mM HEPES pufr (pH 7,2), 1 mM citrát, Gos 100 uM. Experimenty byly prováděny při 28 stupních. Po 1 minutě nebo 5 minutách inkubace Gos-Fe(I) byly přidány askorbát (4 mM) a 5 mM 1,{13}}fenantrolinu. Čáry reprezentují tři testy.
2.7. Gos Chrání proti 2-deoxyribózové oxidační degradaci
Aby se zdokumentovala schopnost Gos přednostně působit na železo místo volných radikálů, byly provedeny kompetiční studie s cílem vyhodnotit účinnost Gos a dvou OH scavengerů (DMSO a salicylát) při ochraně 2,8 nebo 28 mM 2-deoxyribózy před železem -zprostředkované oxidační poškození (obrázek 8). Vychytávače ·OH při 20 mM chránily 28 mM 2-deoxyribózu významně méně než 2,8 mM2-deoxyribózu (p<0.05), as="" expected.="" gos="" was="" equally="" effective="" in="" preventing="" oxidative="" degradation="" of="" both="" 2.8="" and="" 28="">
Obrázek 8. Účinek zachycovačů Gos a ·OH dimethylsulfoxidu (DMSO) a salicylátu na oxidační poškození 2,8 nebo 28 mM 2-deoxyribózy vyvolané Fe(II)-EDTA plus askorbát. Roztoky byly inkubovány po dobu 30 min při 37 stupních a obsahovaly 10 mM fosfátový pufr (pH 7,2), 2-deoxyribózu (2,8 nebo 28 mM）, 150 μM EDTA a 50 μM Fe） (ⅢI）) Reakce byly zahájeny přidáním askorbátu do konečné koncentrace 2 mM. Sloupce ukazují průměr ± SD (n{18}}).Kontrola obsahuje pouze DMSO (0,001 procenta), což je koncentrace rozpouštědla ve vzorcích Gos. Jednostranný t-test byl použit pro*p<0.05, n.s.,="">
3. Diskuse
Železo uvolněné za několika neurodegenerativních stavů, včetně ischemické a hemoragické mrtvice, vyvolává deregulaci homeostázy železa v mozku, což vede k patofyziologii neurologického poškození [4,{1}}]. Zdá se, že na subcelulární úrovni se mitochondriální poškození podílí na smrti neuronů zprostředkované železem [10,15,35-38]. Předklinické důkazy potvrzují výhodu použití chelátorů železa, zejména deferoxamin mesylátu, proti neurodegeneraci včetně všech typů mrtvice [7,16]. Jejich vysoká cena a nedostupnost a široká škála nepříznivých účinků klasických chelátorů železa však vedly k použití přírodních chelátorů pro management železa u dyshomeostázy [39,40].
Cistanche může zlepšit imunitu
Ochranný účinek Gos je prokázán na HT-22 buňkách a mitochondriích potkaního mozku inkubovaných se směsí železa a citrátu, kde jsme našli silnou ochranu proti oxidačnímu poškození vyvolanému železem. Buňky HT-22 myšího hipokampu vystavené přetížení železem (24 h) vykazovaly sníženou životaschopnost, která byla úzce spojena s časnou disipací mitochondriálního membránového potenciálu a redukcí ATP (obrázek 2A-C, v tomto pořadí). To naznačuje, že mitochondriální poškození přispívá k neuronální letalitě. V našich podmínkách se skutečně očekává, že alespoň část Fe(II) nahraná do neuronů dosáhne organel, protože železem indukované smrti neuronů předcházela ztráta mitochondriální funkce. Bylo tedy prokázáno, že přetížení železem indukuje smrt HT-22 buněk myšího hipokampu a mitochondriální fragmentaci [41,42]. Stejně tak trvalá expozice železu zvyšuje hladiny mitochondriálního ROS v buňkách dopaminergního neuroblastomu SHSY5Y [43]. Dále byl ověřen rozsáhlý příliv železa do hipokampálních neuronů, stejně jako poškození mitochondrií po expozici 100 uM železnatého železa [36]. Zde jsme pozorovali, že Gos-indukované zachování životaschopnosti hipokampálních neuronů ovlivněných železem úzce souvisí se zachováním jejich mitochondriálního membránového potenciálu a hladin ATP.
Stejně jako v intaktních buňkách vyvolala přímá mitochondriální expozice železnatému železu rozsáhlé nabobtnání organely, disipaci membránového potenciálu a ztrátu ATP (obrázek 3A-C). V tomto experimentálním prostředí byl Gos schopen chránit železem přetížené mitochondrie, což se projevilo zachováním výše zmíněných parametrů. V tomto smyslu bylo pozorováno, že mitochondrie zatížené mikromolární koncentrací železa podstoupily otevření pórů přechodu mitochondriální permeability a disipaci △Y způsobem, který je citlivý na chelaci železa, ale není závislý na antioxidačním působení katalázy |44]. Je zajímavé, že antioxidant Mito-Tempo údajně chrání před poškozením přetížením železem v hipokampálních neuronech tím, že vychytává mitochondriální superoxidový aniontový radikál a zachovává mitochondriální morfologickou integritu a membránový potenciál [36]. Nedávno jsme popsali antioxidační účinky tohoto flavonoidu a jeho schopnost chránit buňky PC12 před smrtí způsobenou chemickou hypoxií [29], kde se dospělo k závěru, že vychytávání volných radikálů a antioxidační schopnost Gos se částečně podílí na ochraně před železem zprostředkovaným HT-22 a poškození mitochondrií. Avšak zlepšená účinnost Gos proti lipoperoxidaci zprostředkované železem oproti lipoperoxidaci zprostředkované tercbutylhydroperoxidem (obrázek 4A, B) silně naznačuje, že jeho kapacita interakce se železem je hlavním mechanismem proti poškození způsobenému železem.
Pro další charakterizaci interakce Gos-Fe bylo provedeno několik experimentů bez buněk a bez mitochondrií. Pozorovali jsme, že když byl polyfenol koinkubován s Fe (II), koncentrace kovových iontů klesala, zatímco došlo k odpovídajícímu zvýšení rychlosti spotřeby kyslíku (obrázek 5A-C). Tyto účinky naznačují, že Gos odstraňuje Fe(II) z citrátového komplexu a oxiduje jej na železitou formu v procesu, který vyžaduje O2 jako akceptor elektronů. V důsledku toho Gos podporuje pokles koncentrace Fe(II), která může bránit hydroxylovým radikálům prostřednictvím Fentonových reakcí. Protože komplex Gos-Fe(II) umožňuje oxidaci příslušných redukčních činidel, jako je askorbát, což vede k tvorbě/regeneraci Fe(II), byli jsme schopni prokázat, že Gos inhibuje askorbátem zprostředkovanou redukci Fe(II) na Fe(II).
Hypotéza, že Gos silně interaguje se železem, zde byla také potvrzena pomocí spektroskopických technik a potvrdila předchozí výsledky, kde různá pole
Stechiometrie komplexu gos-železo byla charakterizována hmotnostní spektroskopií s elektronovou spinovou ionizací [45].
Tyto výsledky prokázaly ochranné účinky Gos proti poškození neuronů zprostředkovaným železem, pravděpodobně interakcí s železnatými ionty, což brání jeho zapojení do tvorby katalytických reaktivních forem kyslíku. Dále to naznačuje tvorbu přechodného komplexu přenosu náboje mezi Fe(Ⅱ) a Gos, urychlující oxidaci Fe(II) a tvorbu stabilnějšího komplexu Fe(III)-Gos, který se nemůže účastnit fáze propagace lipidů. peroxidace. Navíc biologicky relevantní redukční činidlo, jako je askorbát, nebylo schopno redukovat trojmocné železo v přítomnosti Gos, což omezuje prooxidační vlastnosti určitých flavonoidů zapojených do recyklace železitých iontů. [30]. Gos v mikromolárních koncentracích byl účinnější než klasické scavengery v prevenci oxidace 2-deoxyribózy zprostředkované železem. Tuto vysokou účinnost lze připsat tvorbě redoxně aktivního Gos-Fe(II)/(), jak jsme dříve pozorovali u jiných polyfenolů, které zlepšily svůj účinek jako antioxidanty po jejich interakci se železem v různých paradigmatech oxidačního poškození in vitro [ 22,46-48].
Bylo zjištěno, že chelatační činidla, která obsahují jako ligand kyslík (oxoligand, O2-), mohou chelatovat železo a podporovat oxidaci Fe(I), stabilizaci Fe(II), a následně způsobit snížení jeho redukční potenciál49]. Při fyziologickém pH katecholy snadno tvoří termodynamicky stabilní bis komplexy s železitým železem, což je podporováno nízkými koncentracemi ligandů. Přítomnost katecholové části ve struktuře Gos naznačuje podobný mechanismus interakce se železem, což by mohlo vysvětlit ochranu dosaženou před poškozením neuronových buněk a mitochondrií železem. V tomto ohledu jsme také dříve prokázali, že mangiferin a guttiferon A stimulují oxidaci železitého železa a brání redukci železitého železa [23,24,26-28].
Schopnost Gos chelatovat železo může také vyvolat signální dráhy, které přispívají k neuroprotekci. Například enzymy prolylhydroxylázové domény (PHD), klasické enzymy modifikující hydroxylaci faktorem lalfa (HIF{1}}o) hypoxií za normoxie, byly identifikovány jako kritické cíle chelátorů železa, které jsou klinicky prospěšné v mnoha neurologické poruchy [50,51]. Je to pochopitelné, protože PHD závisí na dvojmocném železe jako spojovacím faktoru [52]. Několik genů, které se účastní neuroprotekce, je regulováno HIF-la, jako je eNOS, VEGF a EPO[53]. Aktivace HIF vyplývající z inhibice PHD by navíc mohla zabránit poškození mitochondrií a apoptóze zprostředkovanému oxidačním stresem, nezávisle na jeho roli jako transkripčního faktoru [54].
Ferroptóza, nedávno charakterizovaná na železe závislá regulovaná buněčná smrt, byla navržena jako mechanismus, jehož prostřednictvím odumírají neurony vystavené hemoragickému poškození [8]. Mitochondriální dysfunkce nedávno souvisela s buněčnou smrtí feroptózy [55]. Inhibice ferroptózy, která zachraňuje mitochondriální funkce před poškozením železem, by proto mohla být také pravděpodobným mechanismem neuroprotekce proti železem zprostředkovaným neurologickým poruchám chráněným Gos, který by si zasloužil další pozornost. Musí být proveden další výzkum o předpokládaných prospěšných účincích Gos na zvířecích modelech in vivo neurodegenerace spojené se železem, aby bylo možné navrhnout tento flavonoid jako terapeutický zásah proti poškození mozkové tkáně vyvolanému deregulací homeostázy železa.