Glykosidy Cistanche zlepšují učení a paměť u potkaního modelu vaskulární demence

další informace:ali.ma@wecistanche.com

J. CHEN1,2, S.-N. ZHOU1, Y.-M. ZHANG2, Y.-L. FENG2, S. WANG2

1 Neurologická klinika, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan, Čína. & Brain Science Research Institute, Shandong University, Shandong, PR Čína

2Neurologická klinika, Lidová nemocnice autonomní oblasti Vnitřní Mongolsko, PR Čína

Jin Chen a Yan-Mei Zhang přispěli k této studii stejnou měrou

Abstraktní.– CÍL:Glykosidy cistanche(GC) jsou extrahovány z Xin JiangCistanche, která je hojně využívána jako čínská bylina. Tato studie si klade za cíl vyhodnotit účinky GC na vaskulární demenci (VD).

MATERIÁLY A METODY: Model VD byl založen ligaturou oboustranné společné karotidy u dospělých potkanů ​​kmene Wistar, kterým byl denně ip podáván fyziologický roztok, GC (10 mg/kg tělesné hmotnosti/d, ip) popř. oxiracetam (450 mg/kg tělesné hmotnosti/den, ip) po dobu 14 dnů. Test Morris Water Maze ocenil kognitivní výkon krys. Hipokampus byl vypreparován a podroben proteomické a imunohistochemické analýze. VÝSLEDKY: Skupina GC vykazovala signifikantně nižší únikovou latenci než skupina VD čtyři a pět dní po operaci. Neukázali žádný významný rozdíl ve srovnání se skupinou s předstíranou operací a kontrolní skupinou s oxiracetamem. V hipokampu vykazovalo 21 proteinových skvrn ve skupině GC různé úrovně exprese ve srovnání se skupinou VD. To zahrnovalo čtyři proteiny, které vykazovaly významný rozdíl: tři upregulované proteiny thioredoxin-like protein 1, duálně specifickou mitogenem aktivovanou protein kinázu 1 a dihydropyridinázu-příbuzný protein 2 (CRMP-2) a jeden down-regulovaná proteinová glutathionsyntetáza. Imunohistochemická analýza ukázala, že hladina proteinu P-tau byla signifikantně vyšší ve skupině s modelem VD než ve skupině s předstíranou operací (p < 0,05).="" po="" ošetření="" gc="" vykazovala="" hladina="" proteinu="" p-tau="" u="" modelových="" potkanů="" ​​vd="" významný="" pokles="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" vd="" léčenou="" fyziologickým="" roztokem="" (p="">< 0,05).="" závěry:="" gc="" hraje="" klíčovou="" roli="" při="" ochraně="" hipokampálních="" neuronů="" ve="" vd="" snížením="" fosforylace="" p-tau="" a="" zvýšením="" hladiny="" exprese="" crmp-2.="" farmakologická="" manipulace="" s="" gc="" nabízí="" novou="" příležitost="" pro="" léčbu="">

klíčová slova:

Cévní demence, Glykosidy cistanche, Proteomika, P-tau, protein související s dihydropyrimidinázou 2.

Klikněte na Cistanche a cistanche deserticola ma pro zlepšení paměti

Úvod

Vaskulární demence (VD) je druhou nejčastější senilní demencí a je způsobena především ischemickou cerebrovaskulární chorobou. VD vede k heterogennímu kognitivnímu poškození a jsou zapotřebí nové účinné terapeutické léky, které léčí nebo zabraňují progresi VD1. Stále však neexistuje účinná čínská bylina pro zlepšení kognitivních poruch způsobených mozkovou ischemií.

Glykosidy cistanche (GC) byly široce používány jako bylina s neuroprotektivními účinky. Herba Cistanches Extract zvyšujeučení a paměťmyší podporou diferenciace neuronových buněk, růstu neuritů a tvorby synapsí2. Glykosidy cistanche mohou zabránit apoptóze v neuronech cerebelárních granulí a projevit antiapoptózový účinek inhibicí aktivace kaspázy-3 a kaspázy-83. Echinakosid, hlavní aktivní složka Herba Cistanches, je dostatečný k ochraně neuronálních buněk před poškozením rotenonem aktivací signalizace Trk4. Mechanismy, kterými GC zlepšuje kognitivní poruchu u VD, jsou však stále do značné míry neznámé.

Tau protein je neuronální mikrotubulový protein, který stabilizuje neuronální mikrotubuly. Fosforylace proteinu tau (P-tau) ovlivňuje jeho schopnost interagovat s mikrotubuly a ovlivňuje synaptický přenos. Akumulace neurofibrilárních klubek (NFT) sestává z proteinu P-tau a je jednou z hlavních charakteristik Alzheimerovy choroby (AD)5. Je dobře známo, že VD a AD jsou dvě nejčastější onemocnění demence. Sdílejí společnou korelaci s vaskulárními rizikovými faktory, jako je hypertenze, diabetes mellitus a hypercholesterolémie. Proto se P-tau může také podílet na VD.

Hodnotili jsme účinky GC nafunkce učení-paměťna krysím modelu VD a provedli proteomiku a imunohistochemickou analýzu na hipokampu VD krys, aby poskytli pohled na neuroprotektivní účinky GC. Naše výsledky ukázaly, že GCzlepšené učení a paměťu VD potkanů ​​a změnily hladiny proteinů, jako je P-tau u VD potkanů.

Materiály a metody

Zvířata

Šestiměsíční samci potkanů ​​Wistar (hmotnost 230- 270 g) byli poskytnuti experimentálním zvířecím centrem v provincii Hubei v Číně. Všechny experimentální postupy na zvířatech byly prováděny v souladu s pokyny pro péči o zvířata a místními etickými předpisy nemocnice Wuhan č. 1, Čína. Číslo etického schválení je 00014834. Zvířata byla chována odděleně ve skupinách po 4 na klec při 25 stupních s cyklem 12-hodina světlo/12-hodina tma a volným přístupem k potravě a vodě. Zvířata (n=45) byla náhodně rozdělena do čtyř skupin: modelová skupina (n=12), falešně operovaná skupina (n=11), skupina léčená GC (n{{14} }) a kontrolní skupina léčená oxiracetamem (n=10).

Bilaterální podvázání společné krční tepny (2-VO)

V hluboké anestezii s 10% chloralhydrátem (reagent Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, Tianjin, Čína) (350 mg/kg tělesné hmotnosti,

ip) byly bilaterální společné krční tepny (CCA) opatrně odděleny od okolních tkání a poté těsně podvázány stehem. Kůže byla následně rekonstruována a krysy byly následně udržovány při pokojové teplotě a vráceny do domácí klece až do resuscitace. Falešně operované kontrolní krysy byly podrobeny stejnému chirurgickému postupu bez podvázání CCA. Potkani VD byli léčeni GC (10 mg/kg tělesné hmotnosti/d, ip) nebo oxiracetamem (450 mg/kg tělesné hmotnosti/d, ip) bezprostředně po operaci po dobu 14 po sobě jdoucích dnů. Modelové skupině byl injikován stejný objem normálního fyziologického roztoku.

Morrisův test vodního bludiště

Test MWM byl proveden podle dříve popsané metody7. Testovací oblast sestávala z kruhového bazénu naplněného vodou (25 ± 1 stupeň), který byl neprůhledný mlékem, takže krysy nebyly schopny vidět podvodní plošinu 1 cm pod vodní hladinou. Bazén byl rozdělen do čtyř kvadrantů (označené zóny I, II, III a IV) a plošina byla ponořena do zóny II. Vizuální podněty byly umístěny na stěně testovací místnosti. Zvířata byla umístěna do vody v jednom ze čtyř výchozích kvadrantových bodů, které se v průběhu pokusů náhodně měnily. Krysy dostaly 2 minuty, aby našly plošinu a seděly na ní po dobu 15 sekund. Krysy, které nenašly místo v daném čase, byly jemně navedeny na plošinu a bylo jim umožněno na ní zůstat po dobu 15 sekund. K záznamu dráhy plavání, latence, vzdálenosti plavání a času v každé zóně byl použit automatický sledovací systém. Všechny krysy byly usmrceny dva týdny po MWM testu pro následnou analýzu.

Extrakce proteinů

V hluboké anestezii s 10% chloralhydrátem byly všechny krysy podrobené testu MWM dekapitovány. Hipokampální tkáně byly rychle sklizeny na ledu a poté okamžitě zmrazeny v kapalném dusíku. Všechny tkáně byly homogenizovány pod kapalným dusíkem za použití třecí misky a tloučku a shromážděny v lyzačním pufru (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 2 procenta CHAPS, 20 mM Tris). Nerozpustné částice byly odstraněny centrifugací při 12, 000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut při 4 stupních. Kontaminované nukleové kyseliny ve vzorcích byly rozrušeny přerušovanou sonickou oscilací po dobu 5 minut. Supernatanty byly shromážděny po centrifugaci za stejných podmínek, jak je popsáno výše. Koncentrace proteinu v supernatantech byla měřena Bradfordovým testem a supernatanty byly skladovány při 80 °C.

Dvourozměrná gelová elektroforéza

Proteinové alikvoty (12 0 ug) byly upraveny rehydratačním pufrem (7 M močovina, 2 M thiomočovina, 4 procenta CHAPS, 1 procento hmotn./obj. DTT, 0,5 procenta IPG pufr a stopa bromfenolové modři) v objemu 350 µL. Izoelektrická fokusace (IEF) byla provedena v IPG proužcích (pH 4-7, velikost 22 cm) při 30}0 V po dobu 12 minut, 700 V po dobu 18 minut, 1500 V po dobu 1,5 hodiny, 9900 V po dobu 3 h, 9990 V po dobu 6,5 h a poté 600 V po dobu 20 h na systému Ettan IPGphor II (GE ETTAN IPGPHOR3). Po programu IEF byly proužky ekvilibrovány v IPG ekvilibračním pufru I (6 M močovina, 2 procenta SDS, 30 procent glycerol, 0,375 M Tris, pH 8,8, 20 mg/ml DTT a stopy bromfenolové modři) a poté alkylována (25 mg/ml jodacetamidu místo DTT v ekvilibračním pufru) po dobu 15 min. 2-DE byla provedena na 12,5% SDS polyakrylamidových gelech (24 cm x 19,5 cm x 1,0 mm) s 0,5% agarózovým těsnícím lepidlem za použití elektroforetického systému Ettan DALT Six (GE ETTAN DALTsix, PA, USA). Elektroforéza byla prováděna při 2 W po dobu 45 minut, následovala separace při 17 W po dobu čtyř hodin, dokud bromfenolová modř téměř nedosáhla dna gelů. Proteinové skvrny byly vizualizovány barvením stříbrem (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) v analytických gelech. 2-DE promývačka vytvořená v triplikátech a ze tří nezávislých proteinových extrakcí pro každou skupinu.

Preparativní gelová elektroforéza

Vzorky proteinu (600 ug) ze čtyř skupin krys byly podrobeny 2-DE podle výše popsané metody. Proteinové skvrny byly vizualizovány pomocí barvení Coomassie brilantní modří (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory) v preparativních gelech.

Získávání a analýza obrazu

Gelové obrazy byly zachyceny na {{0}}DE Image Scanning systému (UMAX Powerlook1100, VT, USA) a analyzovány softwarem Image Master 2D Platinum 5.0 (GE, PA, USA). Proteinové skvrny byly detekovány automaticky a poté ručně upraveny, aby se odstranily pruhy, skvrny a artefakty.

Laserová desorpční ionizace za pomoci matrice – hmotnostní spektrometrie doby letu (MALDI-TOF-MS)

Pro otisk peptidové hmoty a následnou analýzu byly gely nakrájeny a skvrny obarvené Coomassie byly odbarveny a promyty 100mM hydrogenuhličitanem amonným a acetonitrilem, redukovány DTT při 60 stupních po dobu 40 minut a poté alkylovány IAA po dobu 30 minut ve tmě. Gel byl obsažen v 50 ul 12 ng/ul modifikovaného roztoku trypsinu v 50 mM hydrogenuhličitanu amonném (pH 8,6) při 37 stupních přes noc. Peptidy byly extrahovány z gelové zátky 1% kyselinou mravenčí/2% acetonitrilem a koncentrovány pomocí C-18 Zip-Tips. Digesty byly naneseny (čtyři replikáty) na cíl MALDI s použitím a-kyano 4-hydroxyskořicové kyseliny (2 mg/ml v 50% acetonitrilu, 0,1% TFA obsahující 10 mM fosforečnanu amonného) jako matrice. Spektra byla získána na hmotnostním spektrometru 4700 MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems, NY, USA) a analyzována softwarem GPS Explorer TM (Applied Biosystems).

Imunohistochemie

Koronální hipokampální řezy byly fixovány ve 4% paraformaldehydu před uložením do parafínu a poté rozřezány na 4- µm silné řezy. Koronální hipokampální řezy dokončené odchýlením byly zpracovány k utlumení aktivity endogenní peroxidázy za použití 3% H2O2 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem. Nespecifické imunoreakce byly blokovány při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Řezy byly poté inkubovány s protilátkou P-tau a sekundární protilátkou při teplotě místnosti po dobu 3 0 min a byly vizualizovány po reakci 3,3'-diaminobenzidin tetrahydrochloridu (Dako, Tokio, Japonsko). Obrázky byly zachyceny pomocí světelného mikroskopu (Olympus, Tokio, Japonsko) a zpracovány pomocí softwaru Photoshop (verze 7.0, Adobe, San Jose, CA, USA).

Statistická analýza

Kvantitativní data byla vyjádřena jako průměr ± SD. Dvoucestná analýza rozptylu (ANOVA) byla provedena pomocí analytického softwaru SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). p < 0,05="" bylo="" považováno="" za="">

Výsledek

GC podporuje učení a paměť u potkanů ​​VD

Pro vyhodnocení účinků GC na kognitivní funkce modelu VD potkanů ​​jsme provedli MWM test. V testu MWM skupina GC vykazovala významně nižší únikovou latenci než skupina VD 4 a 5 dnů po operaci, ale nevykazovala žádný významný rozdíl ve srovnání se skupinou s předstíranou operací a kontrolní skupinou s oxiracetamem (tabulka I). Tyto údaje naznačují, že GC podporuje učení a paměť u VD potkanů. GC mění proteomické profily hippocampu VD krys.

Proteomickou analýzou krysího hipokampu jsme zjistili, že 21 proteinových skvrn ve skupině GC vykazovalo různé úrovně exprese ve srovnání se skupinou VD. Mezi nimi čtyři proteiny vykazovaly významný rozdíl v hippocampu GC potkanů ​​(tabulka II): včetně tří upregulovaných proteinů thioredoxin-like protein 1 (TXNL 1), duální specifická mitogenem aktivovaná proteinkináza kinázy 1 (MAPKK 1) a protein 2 související s dihydropyrimidinázou (DPYSL2); a jedna down-regulovaná proteinová glutathionsyntetáza (GCL). Typické profily dvourozměrné gelové elektroforézy (2-DE) DPYSL2 jsou znázorněny na obrázku 1.

GC moduluje hladinu P-tau v hippocampu VD krys

Imunohistochemickou analýzou jsme zjistili, že hladina proteinu P-tau byla signifikantně vyšší ve skupině s modelem VD než ve skupině s předstíranou operací (p < 0.05).="" po="" ošetření="" gc="" hladina="" proteinu="" p-tau="" u="" vd="" modelových="" potkanů="" ​​vykázala="" významný="" pokles="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" vd="" léčenou="" fyziologickým="" roztokem="" (p="">< 0,05),="" ale="" nevykazovala="" žádný="" významný="" rozdíl="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" s="" oxiracetamem="" (obrázek="">

Diskuse

VD je způsobena poruchou paměti a kognitivních funkcí způsobenou především cerebrovaskulárními chorobami8,9,10,11. Model dvoucévní okluze (2VO) je jednoduchý a stabilní a uznávaný jako standardní model mozkové ischemie. V této studii jsme použili model 2VO k vytvoření zvířecího modelu VD. Testem MWM jsme zjistili, že skupina VD vykazovala sníženou kognitivní schopnost ve srovnání se skupinou s falešně operovanou skupinou, což potvrdilo, že jsme model VD vytvořili úspěšně. Na základě tohoto modelu jsme zjistili, že léčba GC zlepšila prostorovou kognitivní schopnost VD potkanů ​​v podobném rozsahu s oxiracetamem, pozitivní kontrolou. Tato data naznačují, že GC by mohla podporovat prostorové učení a zhoršení paměti u VD.

Abychom prozkoumali mechanismus, kterým GC uplatňuje neuroprotektivní účinky na VD, použili jsme proteomický přístup ke screeningu odlišně exprimovaných proteinů v hipokampu VD potkanů. Zjistili jsme, že několik proteinů souvisejících s energetickým metabolismem, skládáním proteinů, signální dráhou a cytoskeletem vykazovalo různé exprese v hippocampu VD potkanů ​​léčených GC ve srovnání s těmi, kterým byl jako kontrola podáván fyziologický roztok.

Jedním z odlišně exprimovaných proteinů je DPYSL2, také známý jako kolapsinový mediátorový protein -2 (CRMP{2}}), který je obohacen v distální části rostoucích axonů v primárních hipokampálních neuronech a je zásadní pro diferenciaci axonů. a neuronální růst12,13. Kromě toho CRMP-2 podporuje sestavení mikrotubulů a zprostředkovává signalizaci Ras ke zvýšení tvorby více axonů a neuronální polarity14,15. V této studii byla hladina proteinové exprese CRMP-2 zvýšena 2,28krát ve skupině GC ve srovnání se skupinou VD, což naznačuje důležitou roli CRMP-2 v potenciálních opravných mechanismech tvorby neuronové sítě a udržení polarity neuronů u VD.

Kromě toho jsme v této studii zjistili vyšší P-tau ve skupině modelu VD, ale nižší expresi P-tau po léčbě GC. Tau protein hraje klíčovou roli v morfogenezi neuronů. V určitých patologických situacích může P-tau protein generovat aberantní agregáty, které jsou toxické pro neurony, ovlivněním mitochondriální funkce15. Předchozí studie naznačují, že GC může zvýšit mitochondriální energetický metabolismus s antioxidační funkcí16,17,18. Je zajímavé, že fosforylace CRMP-2 byla také charakterizována jako složka neurofibrilárních klubek u AD.

Závěry

CRMP2 je běžně fosforylován cyklin-dependentní proteinkinázou-5 (Cdk5) a glykogensyntázovoukinázou-3 (GSK3) v mozku pacientů s AD, stejnými kinázami, které fosforylují protein tau za vzniku NFT19,20. Jsou zapotřebí další studie, aby se zjistilo, zda GC reguluje hladinu exprese P-tau a CRMP2 u VD regulací aktivity Cdk5 a GSK321,22,23. V souhrnu naše data naznačují, že GC hraje zásadní roli při ochraně hipokampálních neuronů VD snížením fosforylace P-tau a zvýšením hladiny exprese CRMP-2. Farmakologická manipulace GC nabízí novou příležitost pro rozvoj terapie proti VD.

Poděkování

Tato studie byla podpořena Zvláštní nadací pro učence Taishan a Národním fondem přírodních věd (30960520).

Konflikt zájmů

Autoři prohlašují, že nedochází ke střetu zájmů.

Reference

1)GORELICK PB, PANTONI L. Pokroky v vaskulárním kognitivním postižení. Mrtvice 2013; 44: 307-308.

2)CHOI JG, MOON M, JEONG HU, KIM MC, KIM SY, OH MS. Cistanches Herba zlepšuje učení a paměť indukcí nervových růstových faktorů. Behav Brain Res 2011; 216: 652-658.

3) TIAN XF, PU XP. Fenylethanoidní glykosidy z Cistanches salsa inhibují apoptózu indukovanou 1- methyl-4-fenylpyridiniovým iontem v neuronech. J Ethnopharmacol 2005; 97: 59-63.

4)ZHU M, LU C, LI W. Přechodná expozice echinakosidu je dostatečná k aktivaci signalizace Trk a ochraně neuronových buněk před rotenonem. J Neurochem 2013; 124: 571-580.

5)MEDINA M, AVILA J. Nové pohledy na roli tau u Alzheimerovy choroby. Důsledky pro terapii. Biochem Pharmacol 2014; 88: 540-547.

6) NING M, ZHANG Z, CHEN Z, ZHAO T, ZHANG D, ZHOU D, LI W, LIU Y, YANG Y, LI S, HE L. Genetický důkaz, že vaskulární demence souvisí s Alzheimerovou chorobou: genetická asociace tween tau polymorfismus a vaskulární demence u čínské populace. Stárnutí věku 2011; 40: 125-128.

7) CAIN DP, BOON F. Podrobná behaviorální analýza odhaluje jak strategie úkolů, tak poruchy prostorové paměti u potkanů ​​po bilaterální mrtvici střední mozkové tepny. Brain Res 2003; 972: 64-74.

8) ZHONG G, WANG Y, ZHANG Y, GUO JJ, ZHAO Y. Kouření je spojeno se zvýšeným rizikem demence: metaanalýza prospektivních kohortových studií se zkoumáním potenciálních modifikátorů účinku. PLoS One 2015; 10: e0118333.

9) NETO E, ALLEN EA, AURLIEN H, NORDBY H, EICHELE T. EEG spektrální znaky rozlišují mezi Alzheimerovou demencí a vaskulární demencí. Přední Neurol 2015; 6:25.

10) CALABRÒ RS, DE LUCA R, LEO A, BALLETTA T, MARRA A, BRAMANTI P. Lokomat trénink u vaskulární demence: motorické zlepšení a ještě dál! Aging Clin Exp Res 2015 12. března.

11)UTKAN T, YAZIR Y, KARSON A, BAYRAMGÜRLER D. Etanercept zlepšuje kognitivní výkon a zvyšuje expresi eNOS a BDNF během experimentální vaskulární demence u diabetu vyvolaného streptozotocinem. Curr Neurovasc Res 2015 11. března.

12) ZHOU LS, ZHAO GL, LIU Q, JIANG SC, WANG Y, ZHANG DM. Umlčení proteinu mediátoru kolapsinové odpovědi-2 přeprogramuje fenotyp makrofágů a zlepší hojení infarktu v experimentálním modelu infarktu myokardu. J Inflamm (Londýn) 2015; 12:11.

13) WILSON SM, KI YEON S, YANG XF, PARK KD, KHANNA R. Diferenciální regulace fosforylace kolapsinového mediátorového proteinu 2 (CRMP2) pomocí GSK3ß a CDK5 po traumatickém poranění mozku. Front Cell Neurosci 2014; 8:135.

14)LIM NK, HUNG LW, PANG TY, MCLEAN CA, LIDDELL JR, HILTON JB, LI QX, WHITE AR, HANNAN AJ, CROUCH PJ. Lokalizované změny kinázy glykogensyntázy-3 a proteinu mediátoru kolapsinové reakce-2 v mozku postiženém Huntingtonovou chorobou. Hum Mol Genet 2014; 23: 4051-4063.

15) BRUSTOVETSKY T, PELLMAN JJ, YANG XF, KHANNA R, BRUSTOVETSKY N. Protein mediátoru kolapsové odpovědi 2 (CRMP2) interaguje s N-methyl-D-aspartátovým (NMDA) receptorem a Na plus /Ca2 plus ex-měničem a reguluje jejich funkční činnost. J Biol Chem 2014; 289: 7470-7482.

16)DONG B, YUAN X, ZHAO Q, FENG Q, LIU B, GUO Y, ZHAO B. Ultrazvukem asistovaná vodná dvoufázová extrakce fenylethanoidních glykosidů z kmenů Cistanche deserticola YC Ma. J Sep Sci 2015 Jan 21. [Epub před tiskem].

17)HU GS, JIA JM, KIM DH. Účinky podávání tyrosinu a fenylalaninu na akumulaci fenylethanoidních glykosidů do buněčné suspenze Cistanche deserticola. Chin J Nat Med 2014; 12: 367-372.

18)DONG S, GAO R, YANG Y, GUO M, NI J, ZHAO L. Simultánní stanovení fenylethanoidových glykosidů a aglykonů kapilární zónovou elektroforézou s modifikátorem běžícího pufru. Anal Biochem 2014; 449: 158-163.

19)XIONG WT, GU L, WANG C, SUN HX, LIU X. Antihyperglykemické a hypolipidemické účinky Cistanche tubulosa u diabetických db/db myší 2. typu. J Ethnopharmacol 2013; 150: 935-945.

20) LIU B, OUYANG J, YUAN X, WANG L, ZHAO B. Adsorpční vlastnosti a preparativní separace fenylethanoidových glykosidů z Cistanche deserticola pomocí makroporézních pryskyřic. J Chro- motor B Analyt Technol Biomed Life Sci 2013; 937: 84-90.

21) CALDERÓN-RIVERA A, SANDOVAL A, GONZÁLEZ-RAMÍREZ R, GONZÁLEZ-BILLAULT C, FELIX R. Regulace neuronových cav3.1 kanálů cyklin-dependentní kinázou 5 (cdk5). PLoS One 2015; 10: e0119134.

22)CASTRO-ALVAREZ JF, URIBE-ARIAS A, CARDONA-GÓMEZ GP. Cílení na cyklin-dependentní kinázu 5 zabraňuje agregaci b-amyloidu zahrnující glykogensyntázovou kinázu 3b a fosfatázy. J Neurosci Res 2015 24. února [Epub před tiskem].

23) ROUGET R, SHARMA G, LEBLANC AC. Cyklin-dependentní kináza 5 Fosforylace familiárních prionových proteinových mutantů zhoršuje konverzi na amyloidní strukturu. J Biol Chem 2015; 290: 5759- 5771.