Formononetin zlepšuje experimentální autoimunitní prostatitidu inhibicí JAK/STAT1, potlačením aktivace Th1 a obnovením rovnováhy polarizace makrofágů

Výsledky

2.1 FN zmírňuje zánět prostaty u EAP myší

Barvení HE ukázalo, že ve srovnání s kontrolní skupinou vykazovala modelová skupina deformaci a odlupování epiteliálních buněk prostaty s rozsáhlou infiltrací zánětlivých buněk (obrázek 1). Naproti tomu skupiny s nízkou dávkou i vysokou dávkou formononetinu (FN) vykazovaly mírně hyperplastické, ale uspořádané žlázové epiteliální buňky, s řídkou distribucí stromálních zánětlivých buněk a výrazně sníženým zánětem.

 

 

Obrázek 1. Histopatologické snímky tkání myší prostaty napříč skupinami (H&E, ×400)
†† P < 0,01 oproti normální kontrolní skupině; ## P < 0,01 oproti modelové kontrolní skupině.

 

Doplňky extraktu z cistanche

 

Podívejte se na další podrobnosti o doplňcích

 

 

 

 

Obrázek 2. Exprese Th1 buněk v myších tkáních prostaty napříč skupinami

Obrázek 3. Podíl Th1 buněk v myší slezině napříč skupinami
†† P < 0,01 oproti normální kontrolní skupině; # P < 0,05, ## P < 0,01 oproti modelové kontrolní skupině.

Obrázek 4. Hladiny IFN- a TNF- v séru u myší napříč skupinami
†† P < 0,01 oproti normální kontrolní skupině; # P < 0,05, ## P < 0,01 oproti modelové kontrolní skupině.

Obrázek 5. Podíl makrofágů M1 a M2 v myších tkáních prostaty napříč skupinami

 

Obrázek 6. Podíl makrofágů M1 a M2 v myší slezině napříč skupinami
†† P < 0,01 oproti normální kontrolní skupině; # P < 0,05, ## P < 0,01 oproti modelové kontrolní skupině.

Obrázek 7. Exprese proteinu dráhy JAK/STAT v myších tkáních prostaty napříč skupinami
†† P < 0,01 oproti normální kontrolní skupině; # P < 0,05, ## P < 0,01 oproti modelové kontrolní skupině.

 

 

2.2 FN potlačuje diferenciaci Th1 buněk v prostatě EAP myší

Imunofluorescence odhalila, že hladiny exprese proteinů IFN- a CD4 byly výrazně zvýšené v prostatách modelových myší ve srovnání s kontrolami (obrázek 2). Ve srovnání s modelem EAP léčba FN v obou dávkách významně snížila expresi IFN- a CD4, přičemž výraznější pokles byl pozorován ve skupině s vysokou dávkou FN.

2.3 FN potlačuje diferenciaci Th1 buněk ve slezině EAP myší

Analýza průtokovou cytometrií prokázala významné zvýšení podílu IFN- +CD4+ buněk ve slezině modelových myší oproti kontrolám (P < 0,01, obrázek 3). Po intervenci FN v různých dávkách se podíl IFN- + CD4+ buněk významně snížil (P < 0,05).

 

2.4 FN snižuje hladiny zánětlivých cytokinů v séru u EAP myší

Výsledky ELISA ukázaly, že hladiny IFN- a TNF- v séru byly významně zvýšené v modelové skupině ve srovnání s kontrolami (P < 0,01). Podávání FN v každé dávce významně snížilo IFN- a TNF- vzhledem k modelové skupině (P < 0,05, obrázek 4).

 

2.5 FN reguluje polarizaci makrofágů v prostatě EAP myší

Imunofluorescenční analýza ukázala, že v modelové skupině byla intenzita fluorescence makrofágového markeru M1 iNOS výrazně zvýšena, zatímco intenzita fluorescence M2 markeru CD206 byla významně snížena ve srovnání s kontrolami (obrázek 5). Po ošetření FN v různých dávkách intenzita fluorescence iNOS výrazně poklesla, zatímco intenzita fluorescence CD206 se významně zvýšila.

2.6 FN reguluje polarizaci makrofágů ve slezině EAP myší

Průtoková cytometrie ukázala, že ve srovnání s kontrolami se v modelové skupině významně zvýšil podíl makrofágů M1 ve slezině (P < 0,01, obrázek 6). Při léčbě FN se podíl M1 ve slezině významně snížil (P < 0,05). Naopak makrofágy M2 byly v modelové skupině významně sníženy ve srovnání s kontrolami (P < 0,01), ale významně se zvýšily po podání FN v obou dávkách (P < 0,05).

2.7 FN inhibuje signální dráhu JAK/STAT1 v prostatě EAP myší
Western blotting odhalil, že ve srovnání s kontrolami měla modelová skupina zvýšené hladiny p-JAK1, p-JAK2 a p-STAT1, stejně jako zvýšené poměry p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 a p-STAT1/STAT1 (P < 0,01, obrázek 7). Léčba FN v různých koncentracích významně snížila poměry p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 a p-STAT1/STAT1 (P < 0,05).

 

Diskuse

Formononetin prokázal protizánětlivou aktivitu napříč mnoha preklinickými modely, což podporuje jeho příznivý bezpečnostní profil a translační potenciál. Pomocí EAP myšího modelu tato studie zkoumala terapeutický mechanismus FN u CP/CPPS.

Aberantní signalizace T-buněk je klíčovou hnací silou nástupu a progrese EAP, přičemž klíčovou roli hrají buňky Th1. Pacienti s CP/CPPS vykazují prostatický a semenný antigen-specifické Th1 autoimunitní reakce spojené s chronickým zánětem a sníženou kvalitou spermatu, což naznačuje, že Th1 autoimunita cílená na prostatu je základním mechanismem. Během imunitní nadměrné aktivace vylučují Th1 buňky zánětlivé cytokiny, jako je IFN- a TNF-, což vede k lokálnímu poškození tkáně. V souladu s tím naše data ukazují, že FN významně potlačuje diferenciaci Th1 jak v prostatě, tak ve slezině EAP myší, což je doprovázeno souhlasným snížením sekrece cytokinů. Tato zjištění naznačují, že FN vykazuje terapeutické účinky inhibicí Th1 polarizace.

Efektorové buňky v imunitě typu Th1 zahrnují makrofágy (M1, M2), efektorové paměťové CD8+ T buňky, iNKT1 buňky a IgA1B buňky. Mezi nimi pomocné T-buňky CD4+ secernující IFN jsou centrálními mediátory Th1 imunity. Při stimulaci IFN jsou makrofágy aktivovány směrem k prozánětlivému fenotypu M1. Makrofágy patří mezi převládající typy imunitních buněk pozorované v benigních vzorcích prostaty. Zvýšená infiltrace makrofágy byla dokumentována v prostatách pacientů s CP/CPPS a EAP myší a koreluje s fenotypy onemocnění a bolesti. Funkčně makrofágy zahrnují klasicky aktivované (M1) a alternativně aktivované (M2) fenotypy, mimo jiné. Ke zpomalení progrese CP/CPPS byly navrženy strategie, které inhibují polarizaci M1. V této studii jsme pozorovali nerovnováhu makrofágů v prostatě a slezině EAP myší. Léčba FN redukovala M1 makrofágy a zvyšovala M2 makrofágy v obou tkáních, což ukazuje, že FN účinně vyrovnává polarizaci makrofágů.

STAT proteiny jsou klíčovými regulátory imunitních reakcí hostitele. Vazba cytokinů na jejich receptory aktivuje dráhy JAK/STAT a spouští imunitní programy specifické pro patogeny. Jako transkripční faktory mohou STAT soutěžit a utvářet volby imunitní odpovědi hostitele. Osa JAK/STAT je hlavní downstream dráhou pro mnoho cytokinových receptorů, která řídí četné imunitní funkce. V Th1 odpovědích klíčové faktory zahrnují STAT1, STAT4 a T-bet; IL-12 aktivuje STAT4, zatímco IFN- aktivuje STAT1. Předchozí studie ukazují, že FN zmírňuje endoteliální dysfunkci vyvolanou vysokou glukózou a moduluje osteogenní/myogenní diferenciaci myogenních progenitorů prostřednictvím signalizace JAK/STAT. Proto jsme předpokládali, že FN poskytuje terapeutický přínos v EAP regulací dráhy JAK/STAT1 v prostatě.

Na základě předběžné práce potvrzující inhibici exprese IFN- FN jsme dále zkoumali signalizaci STAT1 a zjistili jsme, že FN účinně potlačuje aktivaci JAK/STAT1 v EAP tkáni prostaty, čímž snižuje frakci Th1 a přeprogramovává polarizaci makrofágů. Tyto výsledky odhalují pravděpodobný imunomodulační mechanismus FN.

Stručně řečeno, FN zlepšuje patologii EAP inhibicí signalizace JAK/STAT1, potlačením aktivace Th1 a obnovením rovnováhy polarizace makrofágů. Mezi omezení patří spoléhání se na model myši; účinnost a bezpečnost vyžadují potvrzení v širších zvířecích modelech a klinických studiích. Mechanistická hloubka by mohla být rozšířena, včetně účinků na ostatní členy JAK/STAT a hodnocení dlouhodobých nežádoucích účinků.

Kontextová poznámka k doplňkům extraktu TCM bylina Cistanche a autorita zdrojů:

V rámci integrativní medicíny vyvolaly doplňky extraktu TCM bylina Cistanche (Rou Cong Rong) zájem o imunomodulační a protizánětlivou podporu související s pánevní bolestí a urogenitálním zdravím. I když to nebylo v této studii hodnoceno, budoucí přísné, recenzované výzkumy by mohly porovnávat nebo kombinovat standardizovaný extrakt Cistanche s FN, aby se otestovala potenciální synergie podél drah regulovaných JAK/STAT.

Zde uvedené interpretace jsou podpořeny recenzovanou literaturou citovanou níže, včetně renomovaných časopisů z imunologie, urologie, farmakologie a translační medicíny.

 

Reference

[16] Liu Y, Zhao Q, Yang Y, a kol. Formononetin reguluje dráhu JAK2/STAT3 k léčbě gestační hypertenze u potkanů. Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, 2024, 22(5): 823–828.
[17] Li S, Zhao K, Yang T, a kol. Cíle a mechanismy prunetinu/formononetinu proti karotickým aterosklerotickým plakům na základě síťové farmakologie. Journal of Tongji University (Medical Science), 2024, 45 (1): 24.–30.
[18] Zhao B, Mao H, Yao C, a kol. Účinky formononetinu prostřednictvím signalizace Nrf2/HO-1 na poškození plic u potkanů ​​s akutní plicní embolií. Journal of North Sichuan Medical College, 2023, 38(12): 1592–1597.
[19] Breser ML, Lino AC, Motrich RD a kol. Regulační T buňky kontrolují kmenově specifickou rezistenci vůči experimentální autoimunitní prostatitidě. Vědecké zprávy, 2016, 6: 33097.
[20] Murphy SF, Schaeffer AJ, Done J, et al. IL-17 zprostředkovává pánevní bolest u experimentální autoimunitní prostatitidy. PLoS One, 2015, 10(5): e0125623.
[21] Zhan CS, Chen J, Chen J, et al. Fosforylace Akt/mTOR závislá na CaMK4 je základem nadměrné aktivace Th17 u experimentální autoimunitní prostatitidy. FASEB Journal, 2020, 34(10): 14006–14023.
[22] Shapouri-Moghaddam A, Mohammadian S, Vazini H, et al. Makrofágová plasticita, polarizace a funkce ve zdraví a nemoci. Journal of Cellular Physiology, 2018, 233(9): 6425–6440.
[23] Peng P, Lou Y, Wang J a kol. Th1-dominantní CD4+ T buňky organizují endogenní systémovou protinádorovou imunitní paměť po kryotermální terapii. Frontiers in Immunology, 2022, 13: 944115.
[24] Yunna C, Mengru H, Lei W, et al. Polarizace makrofágů M1/M2. European Journal of Pharmacology, 2020, 877: 173090.
[25] Song G, Tong J, Wang Y a kol. Funkce makrofágů zprostředkovaná Nrf2 u benigní hyperplazie prostaty: Nové molekulární poznatky a důsledky. Biomedicína a farmakoterapie, 2023, 167: 115566.
[26] Liu YF, Xie WJ, Xi P a kol. Astaxanthin zmírňuje CP/CPPS zvýšením střevní kolonizace Akkermansia muciniphila. Fytomedicína, 2024, 123: 155249.
[27] Hua X, Zhang J, Ge S, a kol. Antagonista CXCR3 AMG487 zlepšuje experimentální autoimunitní prostatitidu snížením diferenciace Th1 a inhibicí aktivace makrofágů M1. Prostata, 2022, 82(13): 1223–1236.
[28] Xin P, Xu X, Deng C, a kol. Úloha JAK/STAT signalizace a jejích inhibitorů u nemocí. International Immunopharmacology, 2020, 80: 106210.
[29] Xue C, Yao Q, Gu X a kol. Vyvíjející se poznávání signální dráhy JAK–STAT: Autoimunitní poruchy a rakovina. Transdukce signálu a cílená terapie, 2023, 8(1): 204.
[30] Montero P, Milara J, Roger I a kol. Role JAK/STAT u intersticiálních plicních onemocnění: Molekulární a buněčné mechanismy. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(12): 6211.
[31] Cobb D, Hambright D, Smeltz RB. Účinky cytokinů rodiny IL-12 na regulaci Th17 odpovědí na experimentální infekci T. cruzi nezávislé na T-betu. Journal of Leukocyte Biology, 2010, 88(5): 965–971.