Květinové extrakty jako multifunkční barviva v kosmetickém průmyslu, část 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Mnoho přírodních produktů se používá v tradičních lékařských systémech k léčbě úlevy od symptomů bolesti a zánětu, [61] proto byl zkoumán účinek analyzovaných extraktů na inhibici aktivity lipoxygenázy a proteinázy. V rozsahu analyzovaných koncentrací (100-500 ug/ml) vykazoval CTE vodní extrakt nejsilnější schopnost inhibovat proteinázu (obrázek 4) (při 57 procentech pro koncentraci 500 ug/ml). Tato aktivita byla porovnána s dobře známým inhibitorem proteinázy diklofenakem, použitým jako kontrola (asi 89 procent inhibice při nejvyšší testované koncentraci). Podobné výsledky však byly získány pro extrakt GGE a KTE (asi 56 procent a 53 procent, v tomto pořadí, pro nejvyšší koncentrace). Nižší inhibice proteinázy byla pozorována u extraktů PRE a PGE. V dalším testu, který měří schopnost inhibovat lipoxygenázu, vykazují vodné extrakty z KTE a CTE nejvyšší hodnoty (asi 67 procent a 64 procent inhibice, v tomto pořadí, pro koncentraci 500 ug/ml). Diclofenac byl také použit jako kontrola Extrakty GGE, PGE a PRE se také vyznačují významně vysokými hodnotami (60 procent, 57 procent a 54 procent, v tomto pořadí) Bylo také uvedeno, že schopnost inhibovat enzymy LOX a proteinázy závisí na koncentraci extraktu (obrázek 5).

Předchozí studie ukázaly, že mnoho polyfenolických sloučenin významně přispělo k protizánětlivým aktivitám mnoha rostlinných extraktů[62]. Studie prokázaly účast ROS na zánětlivém procesu a fenolové sloučeniny, jako je kyselina gallová a chinová, mohou blokovat metabolismus kyseliny arachidonové inhibicí aktivity aktivity lipoxygenázy, nebo mohou sloužit jako vychytávač reaktivních volných radikálů, které vznikají při kyselině arachidonové. [63]. Výsledky získané BenSaadem a kol. ukazují, že kyselina ellagová, kyselina gallová a punicalagin A&B izolované z P. granatum inhibovaly produkci oxidu dusnatého (NO), prostaglandinu E2 (PGE2) a interleukinu 6 (IL-6) v lipopolysacharidem (LPS) indukovanou RAW 267.4 makrofágy. Zda tyto sloučeniny fungují jako jediné látky nebo mají synergický účinek, stále zůstává otázkou [64]. Vzhledem k tomu, že mnoho flavonoidů vykazuje protizánětlivé vlastnosti v důsledku jejich přirozeného antioxidačního chování, jsou zapojeny do různých zánětlivých poruch.metoda extrakce flavonoidů pdf,Zejména kvercetin je nejzajímavější molekulou, protože zasahuje do specifických biologických drah. Studie navíc naznačují, že může snížit zánětlivý proces zahrnutý v několika modelech prostřednictvím různých mechanismů[65]. Konkrétně AMP-aktivovaná proteinkináza a dráha histon/protein deacetylázy (AMPK/SIRT1) vede k zajímavějšímu managementu zánětu. Aktivátory AMPK tedy mohou snížit zánět makrofágů. Kvercetin a další flavonoidy jako aktivátory AMPK a SIRT1 mohou snižovat zánět zásahem do této dráhy [66]. Bylo také prokázáno, že kvercetin a monoglukosidy kvercetinu vykazují vyšší potenciál inhibice LOX [67]Nair et al. prokázali protizánětlivé vlastnosti extraktu KTE vyhodnocením přítomnosti flavonolů s kvercetinovou skupinou, jako je manghaslin Qu 3-[2G] rhamnosylrutinosid, Qu 3-O-dirhamnosid a rutin. Tyto molekuly prokázaly silnou inhibici aktivity COX{11}} a částečnou supresi ROS. Obecně platí, že polyfenoly přítomné v CTE vykazovaly protizánětlivé vlastnosti u LPS-indukovaného zánětu v makrofágových buňkách RAW 264.7[68].

Kliknutím sem se dozvíte více

2.5. Hodnocení cytotoxicity

Při vytváření nových kosmetických surovin je jednou z nejdůležitějších vlastností jejich bezpečnost použití. Látky určené pro použití v kosmetice musí být netoxické, zejména ve vztahu ke kožním buňkám, jako jsou keratinocyty a fibroblasty. Ke stanovení toxicity analyzovaných extraktů na HaCaT a BJ buňkách byly použity dva typy testů.flavonoidyPrvní studie využívající test neutrální červené absorpce nám umožňuje posoudit životaschopnost buněk ošetřených analyzovanými extrakty. Toto barvivo se dostává do lysozomů živé buňky a uvolňuje se do cytoplazmy mrtvých buněk. Bylo pozorováno (obrázek 6), že extrakt CTE má nejvyšší schopnost zvýšit proliferaci jak HaCaT, tak BJ buněk. Ve srovnání s kontrolou dosáhl tento extrakt asi o 20 procent a 40 procent vyšších hodnot než testovaný parametr při koncentraci 250 μL/mL (HaCaT a B】) a 500 μL/ml (BJ buňky). Extrakt GGE v koncentracích 100 a 250 μL/ml a extrakt KTE v koncentraci 500 μL/ml byly charakterizovány mírně toxickým účinkem na BJ buňky. Další extrakty měly pozitivní vliv na životaschopnost těchto buněk. Extrakty PRE a PGE v koncentraci 100 μL/ml se významně nelišily od kontroly a zvýšily proliferaci BJ buněk asi o 10-15 procent ve srovnání s kontrolou v koncentraci 250 a 500 μL/ ml. V případě keratinocytů nebyl pozorován žádný pokles životaschopnosti buněk. U extraktů PGE, PRE a CTE bylo zaznamenáno zvýšení proliferace se zvyšující se koncentrací, zatímco bylo prokázáno snížení životaschopnosti buněk se zvyšující se koncentrací extraktů KTE a GGE.

Druhým testem pro stanovení cytotoxicity testovaných extraktů byl resazurinový test (Alamar Blue). Ukázalo se (obrázek 7), že životaschopnost buněk závisí na koncentraci extraktu, se kterým byly buňky inkubovány. V případě fibroblastů způsobují extrakty PRE, PGE a CTE vyšší proliferaci buněk se zvýšením jejich koncentrace. Při nejvyšší analyzované koncentraci （500 μL/ml） byla pozorována asi o 20 procent vyšší proliferace ve srovnání s kontrolou.používá hesperidinV případě extraktů KTE a GGE byl pozorován pokles životaschopnosti buněk se zvýšením koncentrace extraktů. Tyto extrakty vykazovaly malý toxický účinek na BJ v koncentracích 250 a 500 μL/ml. V případě keratinocytů byl pozorován podobný účinek analyzovaných extraktů na kožní buňky, ale jejich schopnost proliferace nebyla tak silná jako v případě fibroblastů. Nejvyšší schopnost zvýšit proliferaci keratinocytů byla pozorována u extraktu CTE v celém rozsahu analyzovaných koncentrací. Podobné hodnoty byly získány pro extrakt PRE v koncentraci 250 μL/mL a pro extrakt PGE v koncentraci 500 μL/mL. Extrakt KTE vykazoval výrazně vyšší toxický účinek na buňky HaCa než extrakt GGE.

Analyzované extrakty nebyly dříve rozsáhle testovány na jejich toxicitu pro kožní buňky. Existuje pouze několik studií cytotoxicity extraktů nebo jejich hlavních účinných látek, zejména vůči rakovinným buňkám. Autoři předchozích studií uvedli, že tyto extrakty obecně nemají toxický účinek na kožní buňky a jejich schopnost zvýšit buněčnou proliferaci je nejčastěji připisována vysokému obsahu polyfenolů, antokyanů a flavonoidů [45,69-73 ]. Někteří autoři také uvedli, že jednotlivé složky obsažené v extraktech mohou vykazovat toxický účinek na kožní buňky, zatímco extrakt jako celek nikoli. Ali Hijazi a kol. [69] ukázali, že alkaloidy extrahované z Punica granatum jsou toxické pro normální a rakovinné buněčné linie, zatímco celý extrakt je méně toxický. Studie Nasiri et al. [70] naznačuje, že extrakt z květu Punica granatum může být užitečný při urychlení procesu hojení ran díky své schopnosti zvýšit proliferaci kožních buněk. V našem předchozím výzkumu [45] bylo prokázáno, že vodně-ethanolické extrakty získané z analyzovaných rostlin se vyznačovaly vyšší schopností zvýšit proliferaci BJ buněk a extrakty KTE a GGE vykazovaly nižší toxický účinek na tyto buňky. .ztracená říše cistancheÚčinek vodně-ethanolových extraktů na HaCaT buňky byl podobný jako u čistých vodných extraktů, ale v případě extraktů získaných s ethanolem byly pozorovány mírně příznivější proliferační vlastnosti než v případě vodných extraktů. Rozdíly ve složení obou typů analyzovaných extraktů mohou způsobit rozdíly v jejich toxicitě. Jak je ukázáno, vodní extrakty nejsou tak bohaté na bioaktivní složky jako extrakty voda-ethanol. Největší rozdíly jsou pozorovány v obsahu rutinu a isoquercitrinu.

Cistanche může proti stárnutí

2.6. Stanovení ochranného slunečního faktoru

Nepříznivé účinky UV záření na kůži se mohou projevit jak krátce po expozici, tak i po letech. Sluneční záření má imunosupresivní účinek, který urychluje proces stárnutí kůže se všemi důsledky s tím spojenými, včetně zvýšené karcinogeneze[74]. V současnosti pozorované trendy naznačují rostoucí potřebu vyvíjet produkty, které se vyznačují nejen velmi vysokou mírou bezpečnosti při používání, ale také multifunkčností v tom smyslu, že produkty budou mít protiradiační ochranu pokožky s širším záběrem než doposud používané. Neocenitelnou roli v tomto aspektu hrají některé rostlinné látky, které jsou schopny nejen poskytnout sluneční ochranu, ale také neutralizovat již existující negativní účinky slunečního záření na pokožku [75-77]. Provedený výzkum ukázal, že analyzované rostlinné extrakty PRE, PGE, KTE, CTE a GGE se vyznačují vysokými koeficienty SPF.

Analýza koeficientů (SPF) byla provedena pro získané vodní extrakty z výše uvedených rostlin v koncentracích 10 a 50 mg/ml. U každé zkoumané rostliny vedla vyšší koncentrace extraktu k významně vyšší hodnotě SPF.mikronizovaná purifikovaná flavonoidní frakce 1000 mg používáSrovnání mezi extrakty ukazuje, že nejvyšší hodnoty SPF byly pozorovány u extraktu KTE, což platí pro obě zkoumané koncentrace. Dalším zajímavým pozorováním je, že i v nižších ze zkoumaných koncentrací KTE extrakt stále vykazoval vysoké SPF, zatímco hodnoty pro ostatní extrakty znatelně poklesly. To je jasné, když analyzujeme, o kolik byl výsledek pro KTE vyšší než u jiných extraktů. Pro koncentraci 50 mg/ml bylo SPF vyšší o faktor 1,2 (ve srovnání s PGE, CTE) až o faktor téměř 1,9 (ve srovnání s PRE, GE). Stejný výpočet pro koncentraci 10 mg/ml poskytne faktory od 1,4 (ve srovnání s PGE) po faktory v rozsahu 2-3 (ve srovnání s CTE, GGE), dokonce až po faktory jako 10 ve srovnání s PŘED. Když se zaměříme na extrakt KTE, lze si všimnout, že snížení koncentrace extraktu faktorem 5 (z hodnoty 50 mg/ml na hodnotu 10 ml/ml) má za následek snížení hodnoty SPF faktorem 3,4 , což znamená, že SPF klesá pomaleji než koncentrace. Výše uvedené ukazuje, že extrakt KTE může být účinný i při aplikaci v nízkých koncentracích (obrázek 8).

2.7. Transepidermální ztráta vody (TEWL) a měření hydratace pokožky

Vzhledem k širokému spektru biologické a farmakologické aktivity rostlinných surovin mají rostlinné látky obsažené v extraktech významný vliv na stav pokožky. Zejména zde hovoříme o vlivu sekundárních metabolitů na stav naší kůže [78,79].

V další fázi výzkumu byly provedeny analýzy hydratace a TEWL. Byl hodnocen účinek testovaných extraktů na pokožku. Měření byla prováděna ve dvou časových intervalech 60 a 360 minut pro koncentraci extraktu 10 mg/ml. U měření TEWL byl největší procentuální pokles vykázán u extraktu PGE, kde kontrolní hodnota 13,9 klesla na 8,71, což vedlo k procentuálnímu poklesu o 37 procent. Z tohoto pohledu také stojí za to analyzovat extrakt KTE, protože to byl ten, který vykazoval nejvyšší hodnoty SPF. U extraktu KTE se kontrolní hodnota TEWL snížila na hodnotu 10,22, což znamená pokles o 26 procent (obrázek 9A).

V případě druhého přístrojového měření se však ukázalo, že analyzované extrakty způsobují zvýšení hydratace oproti kontrolnímu vzorku, a to jak po 60, tak i po 360 minutách.

Výsledkem analýz bylo zjištěno, že analyzované extrakty PRE, PGE, KTE, CTE a GGE zvyšují hydrataci pokožky (obrázek 9B). Bylo pozorováno zvýšení hydratačních vlastností spolu se zvýšením koncentrace extraktu v přípravcích. Nejsilnější hydratační vlastnosti byly pozorovány u extraktů PRE a PGE, které se rovnají 32 procentům a 29 procentům po 60 minutách a 21 procentům a 22 procentům po 360 minutách. Nejnižší úroveň hydratace pokožky však byla zjištěna u extraktu KTE, který se rovná 18 procentům po 60 minutách a téměř 3 procentům po 360 minutách.

2.8. Analýza aplikací

2.8.1. Stanovení barevných parametrů extraktů

Aktivní složky rostlinných květů lze díky jejich přirozené barvě použít jako přírodní barviva v mnoha komerčních produktech, jako je kosmetika a potraviny. U získaných extraktů byla provedena barevná analýza (tabulka 5).

Bylo zjištěno, že extrakty PRE, KTE a CTE mají nejvyšší potenciál jako přírodní kosmetické pigmenty. Nejvyšší hodnoty sytosti (C*) však byly pozorovány pro CTE. Na základě hodnoty parametru h stupně bylo zjištěno, že právě žlutá barva tohoto extraktu je pozorovatelná a viditelná pouhým okem. V případě extraktů KTE a PRE je i přes nízkou hodnotu C* (2,8) barva těchto extraktů jasně viditelná pouhým okem a byla specifikována jako červenofialová pro extrakt PRE a modrofialová pro extrakt KTE. Vodní extrakty PGE a GGE byly načervenalé a mírně oranžové barvy a získané hodnoty sytosti byly na úrovni 1,3. U této barvy nebyly tyto hodnoty pouhým okem výrazně rozeznatelné.

2.8.2. Stanovení barevných parametrů kosmetiky na základě extraktů

V posledních letech vyvstala silná potřeba vyvíjet nová barviva přírodního původu, zejména v potravinářském a kosmetickém průmyslu. Ve srovnání s barvivy získanými synteticky mohou mít nižší negativní dopad na lidské zdraví a životní prostředí [80]. Získané extrakty byly použity při formulaci modelového micelárního odličovače make-upu. V každé formulaci byly použity v koncentraci 1 procento. Výsledky barevných parametrů modelové kosmetiky jsou uvedeny v tabulce 6.

Bylo pozorováno, že přidání 1% vodních extraktů z PRE, PGE, CTE a GGE významně ovlivnilo barvu odličovače. Každý vzorek byl jasně viditelný pouhým okem v barvě. Extrakt PRE změnil barvu kosmetiky na oranžovou a extrakt PGE, CTE a GGE ji změnil na žlutou.

Možnost použití analyzovaných extraktů jako potenciálních barviv potvrzují poměrně vysoké hodnoty △Odličovač s extraktem/základový odličovač, což ukazuje na výraznou změnu barvy modelové kosmetiky s přídavkem extraktu oproti porovnání k základnímu vzorku (bez přidání extraktů). Literární údaje [73] ukazují, že pokud jsou hodnoty AE vyšší než 5, je barva vnímána nahou Evou a vnímána jako barevný efekt. Pro odličovače obsahující extrakty PRE, KTE a CTE byly získány hodnoty AE 8,83, 9,17 a 8,14. V případě produktů s extrakty PGE a GGE nebyl pozorován žádný významný vliv extraktu na barvu přípravku. Hodnoty AE jsou v rozsahu 2.{12}}.82. To znamená, že rozdíl v barvě je rozeznatelný pouze zkušeným pozorovatelem [80,81].

3. Materiály a metody

3.1. Rostlinný materiál a postup extrakce

Rostlinným materiálem použitým při výzkumu byly suché květy P. rhoeas L., P. granatum L., C.ternatea L., C.tinctorius L. a G.globosa L., které byly získány z místního bylinkářství. . Proces extrakce byl proveden v ultrazvukové lázni (Digital Mgtrasonic Cleaner, Berlín, Německo), která byla provedena metodou popsanou Yangem et al.[82]. K přípravě vodních extraktů testovaných rostlin bylo použito 10 gramů suchých květů a 100 g vody. Proces byl prováděn po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Získané extrakty byly poté shromážděny a třikrát zfiltrovány přes filtrační papír Whatman č. 1. Po filtraci byly extrakty odpařeny za sníženého tlaku při 40 °C. Zásobní roztok o koncentraci 100 mg/ml byl připraven ze sušených extraktů a byl skladován ve tmě při 4 stupních až do další analýzy. Používají se tyto zkratky: PRE – extrakt z Papaver rhoeas, PGE – extrakt z Punica granatum, GGE – extrakt z Gomphrena globosa, CTE – extrakt z Carthamus tinctorius, KTE – extrakt z Clitoria ternatea.

3.2. Stanovení bioaktivních sloučenin pomocí HPLC-UV-ESI-MS

Získané extrakty byly analyzovány za účelem stanovení jejich hlavních bioaktivních sloučenin pomocí HPLC (DionexUltiMate 300{{20}} RS Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, USA), spojené s hmotnostním spektrometrem (4000 QTRAP, AB Sciex, Concord, ON, Kanada), vybaveným elektrosprejovým ionizačním zdrojem (ESI) a trojitým kvadrupólovým lapačem iontů analyzátor. Chromatografické separace bylo dosaženo gradientovým systémem s reverzní fází. Kromě toho byla od společnosti Phenomenex zakoupena 100×4,6 mm chromatografická kolona Kinetex 3,5 μm XB-C18 100 A s iso-butylovými postranními řetězci a se stacionární fází s koncovým uzávěrem TMS použitá s ochrannou kolonou s podobným složením a byla udržována při 30 stupních . Binární systém rozpouštědel obsahující 0,1 % (o/v) vodnou kyselinu mravenčí jako rozpouštědlo A a methanol jako rozpouštědlo B byl použit v gradientovém režimu během 19,1 min doby běhu. Použité eluční podmínky byly následující: 0.{19}},0 min 25-100 procent B,15.0-17,0 min 100 procent B,17.0-17,1 min. 100-25 procent B,17.1-19,1 min 25 procent B. Průtok mobilní fáze byl 0,6 ml/min a objem nástřiku byl 10 μl. Eluent byl monitorován elektrosprejovým iontovým hmotnostním spektrometrem (ESI-MS) v režimu negativních iontů a skenován od m/z 20 do 1000 Da. Pro kvantifikační analýzu pracoval trojitý kvadrupólový MS detektor ve skenovacím režimu sledování více reakcí (MRM). Experimentálně byly stanoveny optimální podmínky hmotnostního analyzátoru a výběr produktových iontů pro jednotlivé sloučeniny. Pro tento účel byly zavedeny standardní roztoky zkoumaných sloučenin (1 ng/ml) v mobilní fázi pomocí infuzního čerpadla pracujícího při konstantním dodávání vzorku. Poté, co bylo zajištěno, že byl vybrán správný prekurzorový iont, byly pro každý přechod MRM optimalizovány deklastrační potenciál (DP), vstupní potenciál (EP), výstupní potenciál kolizní buňky (CXP) a kolizní energie (CE) (tabulka S1). Byly sledovány dva přechody MRM, jeden pro kvantifikaci a jeden pro potvrzení. MS parametry byly nastaveny následovně: kapilární teplota 600 °C, clonový plyn při 35 psi, nebulizační plyn při 60 psi a sušící plyn při 50 psi. Zdrojové napětí v záporném ionizačním módu -4500 V bylo použito pro stanovení bioaktivních látek. Jako clonový a srážkový plyn byl použit dusík. Analýza dat byla zpracována softwarem Analyst 1.5.1. Identifikace vybraných sloučenin byla provedena pomocí molekulové hmotnosti a fragmentu aniontových vstupů každé jednotlivé sloučeniny a potvrzena MS2 fragmentací. Identita devíti sloučenin byla stanovena spolu s jejich chemickým vzorcem, deprotonovanými molekulárními ionty a charakteristickými fragmentovými ionty pro každý jednotlivý pík. Šest sloučenin bylo kvantifikováno na základě kalibrační křivky vytvořené pomocí ploch píku nejintenzivnějších MRM přechodů analytických standardů. Linearita odezvy detektoru pro kvantifikované sloučeniny byla demonstrována injekcí kalibračních standardů v osmi koncentračních úrovních v rozmezí od 0,01 ug/ml do 2 ug/ml. Kalibrační křivky byly lineární s koeficienty korelace (R) většími než 0,99. V případě, že vzorky nespadaly do lineárního rozsahu CMS detektoru, byly vzorky naředěny.

Analytické standardy kyseliny chinové, kyseliny gallové, kyseliny kávové, kyseliny caffeoylchinové (CQA, dva izomery:3- a 5-CQA) a kvercetinu byly zakoupeny od společnosti Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ). Všechny použité standardy byly analytické čistoty (2 Čistota větší nebo rovna 99 %).

Standardní zásobní roztoky byly připraveny přesným odvážením a rozpuštěním 20 mg každého standardu v 10 ml methanolu čistoty pro LC-MS za vzniku koncentrace 2 mg/ml. Sériová ředění 2.{{10}} ug/mL, 1,5 ug/mL, 1.{14}} ug/mL, 0,5ug/ml,0 0,1 ug/ml, 0,05 ug/ml, 0,02 ug/ml a 0,01 ug/ml pak byly vyrobeny za použití methanolového roztoku stupně LC-MS. Limit kvantifikace (LOQ) byl definován jako 0,01 ug/ml.

LC-MS/MS test byl proveden trojmo. Získaná data byla prezentována jako průměr ± standardní odchylky.

3.3. Stanovení antioxidačních vlastností

3.3.1.ABTS· plus Scavenging Assay

Nejprve byl roztok ABTS připraven smícháním 19,5 mg ABTS a 3,3 mg persíranu draselného se 7 ml fosfátového pufru (pH =7 0,4) a rozpuštěn po dobu 16 hodin ve tmě. Poté byl roztok zředěn na absorbanci na úroveň přibližně 1.0. Absorbance byly měřeny při vlnové délce 入=734 nm. Dále bylo 20 ml extraktů KTE, PGE, PRE, CTE a GGE (10 100 250 500 ug/ml) smícháno s 980 ml zředěného roztoku ABTSe ​​plus a poté inkubováno 10 minut ve tmě. V dalším kroku byla měřena absorbance připravených vzorků při 入=734 nm pomocí UV/VIS spektrofotometru Aquamate Helion (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Jako slepý vzorek byla použita destilovaná voda. ABTS plus úklid byl vypočten z rovnice (1):

kde: As—absorbance vzorku; Ac—absorbance kontrolního vzorku. Měření byla provedena trojmo pro každý extrahovaný vzorek. Postup popsal Gawel-Beben et al. [83].

3.3.2. DPPH Radical Scavenging Assay

Schopnost extraktů zachycovat volné radikály byla provedena za použití metody popsané Brand-Williamsem a kol. [84]. Je založen na použití 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazylového （DPPH） radikálu. Nejprve bylo 33 μl vodných roztoků extraktů v koncentracích 100 ug/ml smícháno se 167 μl methanolového roztoku DPPH（4 mM） a přeneseno do 96-jamkové destičky, poté promícháno třepáním. Poté byla měřena absorbance vzorků při vlnové délce 517 nm. Měření byla prováděna každých 5 minut po dobu 30 minut na spektrofotometru UV-VIS Filter Max入=5 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Pro každý extrakt byly provedeny tři nezávislé replikáty. Jako kontrola byla použita voda s roztokem DPPH. Antioxidační kapacita byla vyjádřena jako procento inhibice DPPH pomocí rovnice (2):

kde: As—absorbance vzorku; Ac—absorbance kontrolního vzorku. Měření byla provedena trojmo pro každý extrahovaný vzorek.

3.3.3. Detekce intracelulárních hladin reaktivních druhů kyslíku (ROS)

Ke stanovení schopnosti analyzovaných extraktů generovat intracelulární produkci reaktivních forem kyslíku v buňkách HaCaT a BJ bylo použito fluorogenní barvivo H, DCFDA. Tato sloučenina má schopnost vstupovat do buněk pasivní difúzí, kde je deacetylována intracelulárními esterázami na nefluorescenční sloučeninu. Pokud jsou v buňce přítomny reaktivní formy kyslíku, tato sloučenina se přemění na vysoce fluorescenční DCF. Pro stanovení intracelulární hladiny ROS v HaCaT a BJ byly buňky nasazeny do 96-jamkových destiček. Poté byly buňky kultivovány v inkubátoru po dobu 24 hodin. Médium DMEM bylo odstraněno a nahrazeno 10 uM H2DCFDA（Sigma Aldrich, St.Louis, MO, USA） rozpuštěným v médiu DMEM bez séra. Buňky HaCaT a BJ byly inkubovány v H, DCFDA po dobu 45 minut a poté inkubovány s extrakty v koncentracích∶ 100, 250 a 500 ug/ml. Buňky ošetřené 1 mM peroxidem vodíku (H202) byly použity jako pozitivní kontroly. Kontrolní vzorky byly buňky neošetřené testovanými extrakty. Fluorescence DCF byla měřena každých 90 minut pomocí čtečky mikrodestiček FilterMax F5 (Thermo Fisher Scientific) při maximální excitaci 485 nm a emisním spektru 530 nm [85].

3.4. Hodnocení inhibice matricových metalopeptidáz

3.4.1. Stanovení antielastázové aktivity

Pro stanovení možnosti inhibice matrix metaloproteinázy, neutrofilní elastázy (NE), byla použita fluorometrická souprava (Abcam, ab118971). Test byl proveden v souladu s instrukcemi připojenými k soupravě a s postupem popsaným Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analýzy byly prováděny na standardní 96-jamkové destičce s čirým plochým dnem. Pro analýzu byly použity rostlinné extrakty v koncentraci 100 a 250 ug/ml. Zpočátku byly roztoky enzymu NE, substrát NE a kontrola inhibitoru (SPCK) připraveny podle pokynů. Zředěný roztok NE byl přidán do všech jamek a poté byly do následujících jamek přidány testovací vzorky, kontrola inhibitoru a kontrola enzymu (testovací pufr). Poté byly vzorky smíchány a inkubovány při 37 stupních po dobu 5 minut. Mezitím byla připravena reakční směs smícháním testovacího pufru a NE substrátu. Směs byla přidána do každé jamky a důkladně promíchána. Fluorescence byla měřena okamžitě při excitační vlnové délce 入=400 nm a emisi 入=505 nm pomocí čtečky mikrodestiček (FilterMax F5, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) Schopnost inhibovat NE aktivitu analyzovaných vzorky byly vypočteny z rovnice (3):

Konečným výsledkem byl aritmetický průměr tří nezávislých měření.

3.4.2. Stanovení anti-kolagenázové aktivity

Pro hodnocení schopnosti získaných extraktů inhibovat aktivitu kolagenázy byla použita fluorometrická souprava (Abcam, Cambridge, UK, ab211108). Test byl proveden v souladu s instrukcemi připojenými k soupravě a s postupem popsaným Niziol-Lukaszewska et al. [86]. Analýzy byly provedeny na standardní 96-jamkové destičce s čirým plochým dnem. Pro analýzu byly použity rostlinné extrakty v koncentraci 100 a 250 ug/ml. Nejprve byla kolagenáza (COL) rozpuštěna v pufru pro analýzu kolagenázy (CAB). Poté byly analyzované vzorky přidány do COL a CAB. Kontrolní vzorky inhibitoru byly připraveny smícháním kolagenázového inhibitoru (1,10-fenantrolinu (80 mM) s kolagenázou a CAB pufrem. Enzymové kontrolní jamky byly připraveny smícháním zředěného COL s CAB. CAB pufr byl použit jako kontrola pozadí Poté byly vzorky inkubovány při pokojové teplotě po dobu 15 min.. Reakční směs byla připravena smícháním kolagenázového substrátu s CAB. Takto připravená reakční směs byla přidána ke všem analyzovaným vzorkům a důkladně promíchána.Poté byla měřena fluorescence při excitační vlnová délka 490 nm a emise 520 nm Měření probíhalo v kinetickém režimu po dobu 60 minut při 37 C. Schopnost inhibovat aktivitu COL získaných extraktů byla vypočtena pomocí rovnice (4):

3.5. Stanovení protizánětlivých vlastností

3.5.1. Inhibice denaturace proteinů

Proteinázová inhibiční aktivita extraktů PRE, PGE, KTE, CTE a GGE byla provedena podle metody Sakat et al.[87], kterou upravili Gunathilake et al.[88]. Stručně řečeno, reakční roztok (2 ml) sestával z 1 ml 1% trypsinu v 2{{10}} mM Tris-HCl pufru (pH 7,4) a 1 ml testovaného vzorku ({{17} },02 ml extraktu 0,980 ml vody). Roztok byl inkubován (37 stupňů po dobu 5 minut) a poté byl přidán 1 ml 0,8% (w/v) kaseinu a směs byla dále inkubována po dobu 20 minut. Na konci inkubace se k dokončení reakce přidaly 2 ml 70% kyseliny chloristé. Směs byla odstředěna a absorbance supernatantu byla měřena při 210 nm proti pufru jako slepému pokusu. Jako kontrola byl použit roztok fosfátového pufru. Procento inhibice denaturace proteinu bylo vypočteno pomocí následujícího vzorce:

kde A1= absorpce kontrolního vzorku a A2= absorpce testovacího vzorku.

3.5.2. Inhibice aktivity lipoxygenázy

Schopnost získaných extraktů inhibovat aktivitu lipoxygenázy byla stanovena pomocí metody popsané Sarvesvaranem et al. 【89】. Nejprve bylo 10 μl rostlinných extraktů v různých koncentracích (100, 250 a 500 ug/ml) smícháno v 96-jamkové destičce se 160 μl 100 mM PBS a 20 μl roztoku sójové lipoxygenázy (167 U/ ml). Vzorky byly inkubovány při 25 stupních po dobu 10 minut a po této době bylo přidáno 10 ul sodné soli kyseliny linolové pro zahájení reakce. Poté byla měřena absorbance vzorků při 234 nm po dobu 3 minut každou minutu za použití čtečky FilterMax F5microplate (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Jako pozitivní kontrola byl použit diklofenak. Procento inhibice aktivity lipoxygenázy bylo vypočteno z rovnice (6):

kde: Stejně jako je absorbance testovaného vzorku, Ac je absorbance negativní kontroly.

Konečným výsledkem byl aritmetický průměr tří nezávislých měření.

3.6. Analýza cytotoxicity

3.6.1. Buněčná kultura

V této studii byly použity dvě kožní buněčné linie: normální lidské keratinocyty (HaCaT) a fibroblasty (BJ). HaCaT byly získány od CLSCell Lines Service (CLS Cell Lines Service GmbH, Eppelheim, Německo) a BJ z American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). Buňky byly pěstovány v Dulbeccově modifikaci Eagleova média (DMEM, Biological Industries, Cromwell, CO, USA) s pyruvátem sodným, L-glutaminem a vysokým obsahem glukózy (4,5 g/l). Médium bylo také obohaceno o 10 procent fetálního bovinního séra (Gibco, Waltham, MA, USA) a 1 procento antibiotiky (100 U/ml penicilinu a 1000 ug/ml streptomycinu, Gibco), aby se zabránilo mikrobiální kontaminaci. Buňky byly pěstovány v inkubátoru při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 95 procent vzduchu a 5 procent oxidu uhličitého.

3.6.2. Alamar Blue Assay

Poté, co kultivované buňky (HaCaT a BJ) dosáhly požadované konfluence, bylo médium DMEM odsáto v kultivačních lahvích. Buňky připojené ke dnu byly dvakrát promyty sterilním fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. Buněčná vrstva byla oddělena trypsinem a poté byly buňky umístěny do čerstvého média DMEM. Buňky byly umístěny na 96-jamkové destičky s plochým dnem (VWR, Radnor, PE, USA) a po připojení ke dnu destiček byly buňky ošetřeny extrakty (100, 250 a 500 ug/ml). Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin.

Test cytotoxicity byl proveden pomocí testu Alamar Blue (Sigma, R7017, Life Technologies, Bleiswijk, Nizozemsko). Po inkubaci byl do jamek přidán roztok resazurinu o koncentraci 60 uM, pak byly destičky umístěny do inkubátoru při 37 stupních po dobu 2 hodin. Po této době byla změřena fluorescence（入=570nm）. Každá koncentrace extraktu byla provedena ve třech replikacích.

3.6.3. Test vychytávání neutrální červené

Neutral Red Abtake Assay je druhý test používaný ke stanovení cytotoxicity PRE, PGE, KTE, CTE a GGE. Nejprve byly 96-připraveny destičky s plochým dnem, jak je popsáno v předchozí části. Po 24 hodinách expozice buněk extraktům byly buňky odsáty a nahrazeny neutrálním červeným barvivem (40 ug/ml) a inkubovány po dobu 2 hodin. Po této době byly buňky promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem. V dalším kroku byl do jamek přidán odbarvovací pufr (150 μl). Poté byl stanoven příjem neutrální červené dvě měřením optické hustoty (OD) při 540 nm. Každá koncentrace extraktu byla provedena ve třech replikacích.

3.7. Stanovení ochranného slunečního faktoru (in vitro)

Ochranný sluneční faktor (SPF) byl stanoven měřením absorbance vodného roztoku extraktů v koncentracích 10 ug/ml a 50 ug/ml, v rozsahu vlnových délek od 290 do 320 nm v 5-nm intervalech. Ze získaných výsledků bylo SPF vypočteno z Mansurovy rovnice [90]: kde∶ EE（λ） – spektrum erytémového účinku, I（入） – spektrum sluneční intenzity, ABS（入） – absorbance opalovacího přípravku, CF – korekční faktor（=10）, E（N）×I（λ） – byly použity hodnoty určené Sayrem [91].

3.8. Transepidermální ztráta vody (TEWL) a měření hydratace pokožky

Měření TEWL a hydratace pokožky bylo provedeno pomocí sondy TEWAmeter TM 300 a sondy Corneometer CM 825 připojené k adaptéru MPA (Courage plus Khazaka Electronic, Köln, Německo）. Studie se zúčastnilo pět dobrovolníků. Na předloktí kůže, bylo označeno šest oblastí (velikost 2 × 2 cm), na pět míst bylo aplikováno množství 0,2 ml testovaných rostlinných extraktů, šesté místo byla kontrola (neošetřena žádnými vzorky) po 60 a 360 min. Konečným výsledkem byl aritmetický průměr (od každého dobrovolníka) z pěti nezávislých měření (hydratace pokožky) a 20 měření (TEWL).

3.9. Příprava modelové kosmetiky (odstraňovač make-upu) obsahující výtažky

Byla připravena modelová kosmetika (odstraňovač make-upu). Všechny použité komponenty byly v souladu s požadavky EcoCert a COSMOS. Formulace je uvedena v tabulce 7.

Produkt byl vyroben smícháním složek (od položky 1 do položky 6) při teplotě místnosti, dokud nebyla získána homogenní kapalina. V posledním kroku bylo upraveno pH formulace. Odličovač byl rozdělen na porce. Do každé dávky bylo přidáno množství 1 procenta zásobních roztoků extraktu a důkladně promícháno.

3.10. Stanovení barevných parametrů výtažků a kosmetiky (odstraňovače make-upu) obsahující výtažky

Vzorky extraktů a kosmetiky s extrakty byly testovány při pokojové teplotě, 48 hodin po jejich přípravě. K vyhodnocení barevných parametrů (souřadnic CIELAB) byl použit CHROMA METER CR-400 (Konica Minolta, Sensing Inc., Tokio, Japonsko). Systém CIELAB byl definován Mezinárodní komisí pro osvětlení v roce 1978. Je založen na třech barevných atributech: L*, a*,b, kde L* je proměnná jasu úměrná hodnotě v Munsellově systému a a* a b* jsou chromatické souřadnice. Souřadnice a* a b* označují pozice na červené/zelené a žluté/modré ose (plus a=červená, -a=zelená; plus b=žlutá, - b =modrá).

Na základě získaných dat: L*, a* a b* byly vypočteny následující barevné parametry: sytost (C*) a odstín (h). Byly použity následující rovnice:

4. závěr

Na základě získaných výsledků lze konstatovat, že testované rostlinné extrakty vykazují několik pozitivních vlastností, díky kterým je lze použít při výrobě kosmetiky jako jejich bezpečná a bioaktivní složka. Bylo prokázáno, že tyto rostliny jsou bohatým zdrojem polyfenolů, které jim propůjčují antioxidační vlastnosti. Nejlepší schopnost vychytávat volné radikály vykazovala PRE, což je pravděpodobně tím, že obsahuje nejvíce polyfenolů ve srovnání s jinými rostlinami. Nejlepší schopnost snížit produkci ROS v buňkách prokázaly PGE a PRE. Kromě toho rostliny nevykazují žádnou cytotoxickou aktivitu. Všechny testované extrakty vykazovaly inhibiční účinek na enzymy elastázu a kolagenázu, přičemž největší inhibiční účinek měly P. granatum a GGE. To může naznačovat, že tyto rostliny mohou být použity v kosmetice jako látky, které zpomalují procesy stárnutí. Získané výsledky navíc ukazují, že tyto rostliny mají protizánětlivé vlastnosti. V tomto případě se jako nejlepší jevily CTE a KTE. KTE a PGE prokázaly ochranný účinek proti UV záření i při nízkých koncentracích. Při vyšších koncentracích měly všechny rostliny ochranný účinek proti UV záření. Dále měly rostliny pozitivní vliv na hydrataci pokožky a snižovaly transepidermální ztráty vody. Extrakty PRE, KTE a CTE lze použít jako účinná barviva v kosmetických produktech. Modelová kapalina na odličování obsahující výše uvedené extrakty se vyznačovala intenzivní a stálou barvou v čase. Barvu kosmetiky s extrakty PGE a GGE si všimnou pouze zkušení pozorovatelé a nijak se výrazně neliší od slepého vzorku kosmetiky, bez přídavku extraktu. Vzhledem ke všem získaným výsledkům lze konstatovat, že Papaver rhoeas, Clitoria ternatea a Carthamus tinctorius mohou být úspěšně použity jako zdroje žlutých, oranžových, modrých a fialových barviv při výrobě kosmetiky, která bude bezpečná pro použití, a co víc, bude mít pozitivní vliv na pokožku.

Tento článek je extrahován z Molecules 2022, 27, 922. https://doi.org/10.3390/molecules27030922 https://www.mdpi.com/journal/molecules