Inhibitor farnesyltransferázy LNK-754 zmírňuje axonální dystrofii a snižuje amyloidní patologii u myší, část 2

Živé zobrazování neuronů

Pro experimenty se živým zobrazováním byly neurony připraveny tak, jak je uvedeno výše, a umístěny do misek se skleněným dnem o průměru 35 mm (MatTek # P35G-1.5-14C) po dobu 7 dnů v kultuře. 10 nM LNK-754 nebo lonafarnib byl poté přidán do upraveného média, kontrolní kultury byly ošetřeny DMSO jako vehikulem. Po 48 hodinách působení bylo médium nahrazeno upraveným médiem z neošetřených paralelních destiček neuronů. 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (č. L7526, Invitrogen) bylo přidáno do upraveného média a neurony byly inkubovány po dobu 30 minut při 37 stupních.

Neurony jsou důležitou součástí nervového systému, schopné přijímat, zpracovávat a přenášet informace a jsou materiálním základem lidské inteligence a chování. Imunita je pro lidské tělo důležitou zárukou odolnosti vůči nemocem. Dokáže identifikovat a zničit patogeny a abnormální buňky a udržovat zdraví těla.

Výzkumy ukazují, že mezi neurony a imunitním systémem existuje silné spojení. Neurony mohou ovlivňovat imunitní systém uvolňováním různých neurotransmiterů, jako je norepinefrin, adrenalin atd. Tyto neurotransmitery mohou změnit aktivitu imunitních buněk, posílit proliferaci a funkci imunitních buněk a zlepšit imunitu těla. Imunitní systém přitom může různými cestami ovlivňovat i funkci neuronů. Imunitní buňky mohou vylučovat různé cytokiny a hormony, které ovlivňují růst, vývoj a funkci neuronů prostřednictvím imunitních cest.

Imunitu a funkci neuronů mohou navíc ovlivnit psychologické a sociální faktory. Negativní emoce, jako je stres, úzkost a deprese, mohou nepříznivě ovlivnit imunitní systém a neurony a snížit obranyschopnost těla. Pozitivní emoce, pozitivní sociální vztahy a zdravý životní styl mohou podpořit zdravý vývoj imunity a neuronů.

Suma sumárum, mezi neurony a imunitou existuje interaktivní a vzájemně se podporující vztah. Udržování duševního zdraví, pozitivní přístup k životu a osvojení si dobrých životních návyků může podpořit imunitu těla a zdravý vývoj neuronů. Je vidět, že potřebujeme zlepšit paměť. Cistanche deserticola může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche deserticola může také regulovat rovnováhu neurotransmiterů, jako je zvýšení hladiny acetylcholinu a růstových faktorů. Tyto látky jsou velmi důležité pro paměť a učení. Kromě toho může maso také zlepšit průtok krve a podporovat dodávku kyslíku, což může zajistit, že mozek dostane dostatek živin a energie, a tím zlepší mozkovou vitalitu a vytrvalost.

Klikněte na možnost poznat způsoby, jak zlepšit funkci mozku

Časosběrné zobrazování neuronů bylo prováděno pomocí širokoúhlého mikroskopu Ti2. Zobrazování začalo okamžitě po 30 minutách a nepokračovalo déle než 30 minut. Expozice 1-s byly pořizovány každou minutu a během 30 minut bylo nasnímáno 20–30 samostatných oblastí na misku. Kvantifikace vzdálenosti a rychlosti částic LysoTracker a analýzy kymografu byly provedeny pomocí softwaru NIS Elements a podrobně popsány níže. V samostatných experimentech byl do upraveného média přidán 1μM Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen) a zachycené snímky živých neuronů byly pořizovány ne déle než 15 minut pomocí konfokálního mikroskopu Nikon A1 s objektivem 60X (NA 1.4) a software NIS Elements.

Živé zobrazování mozkových tkání

{{0}}měsíčním 5XFAD myším byla ip injikována denně po dobu 3 týdnů a po dokončení léčby byly myši anestetizovány a perfundovány roztokem obsahujícím 1M KCl, 1M MgCl2, 0,1mM kynurenát , 0,01mM DL-2-amino-5-fosfonopentanová kyselina, 5mM glutathion, 25mM glukóza, 125mM NaCl, 1,4mM NaH2P04 a 25mM NaHC03.

Mozky byly poté rychle vypreparovány v ledově chladném okysličeném ACSF obsahujícím 2,5 mM KCl, 85 mM NaCl, 1,25 mM NaH2P04, 25 mM NaHC03, {{10}}}, 5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM glukóza, 2 mM sukrosa 50uM C6H7NaO6, 0,1mM kynurenát, 0.01mM DL-2-amino-5-fosfonopentanová kyselina a 5mM glutathion. 300μm koronální řezy byly získány pomocí vibračního mikrotomu Compresstome VF-200 (Precision Instruments) a ponechány odpočívat 30 minut pro zotavení při 32 stupních v okysličeném roztoku ACSF obsahujícím následující 2,5mM KCl, 85mM NaCl, 1,25mM NaH2PO4, 25 mM NaHC03, 0,5 mM CaCl2, 4 mM 4 MgCl2, 75 mM sacharóza, 25 mM glukóza, 50 uM C6H7NaO6, 0,1 mM kynurenát, 0,01 mM DL2-kyselina aminofosforečnan, glutanonpentanonová{59.}}

Plátky byly poté přeneseny do 35mm skleněných misek (MatTek # P35G-1.5-14C) obsahujících okysličený ACSF s 25nM LysoTracker-Green a 1:10,000 ředění 1 mg/ ml Tiazine Red (#S570435, Sigma Aldrich), která byla jinak identická s ACSF použitým během období zotavení. Životaschopnost řezů byla potvrzena pomocí časosběrného zobrazování tkání. Řezy byly inkubovány s LysoTracker-Green a Tiazine Red po dobu 15 minut při pokojové teplotě a poté byly kortikální oblasti mozku okamžitě zobrazeny ve stejném roztoku při 32 stupních na konfokálním mikroskopu Nikon A1 s objektivem 60X (NA 1.4) a softwarem NIS Elements pro ne déle než 30 minut.

Extrakce mozku a imunoblotování

Myši byly anestetizovány intraperitoneální injekcí xylazinu (15 mg/kg) a ketaminu (100mg/kg), perfundovány fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (1XPBS) s fenylmethylsulfonylfluoridem (20 ug/ml), leupeptin (0,5 ug/ml), orthovanadičnan sodný (20 μM) a dithiothreitol (0,1 mM) s následným odstraněním mozku. Všechny pufry použité pro extrakci proteinů obsahovaly koktejl inhibitorů proteázy III (#535140, Millipore) a inhibitor Halt fosfatázy (#78420, Thermo Fisher Scientific). Tkáně hemimozku byly zváženy a manuálně homogenizovány za použití homogenizéru Dounce 1:10 (w/v) v 1XPBS.

Po homogenizaci byly lyzáty centrifugovány při 20,8{{10}}0g po dobu 30 minut při 4 stupních. Rozpustná frakce (supernatant) byla odstraněna a peleta byla resuspendována pipetováním v pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) [50 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1 % oktylfenoxypolyethoxyethanol (IGEPAL), 1 mM EDTA, 1 mM EGDS, 0,1 % S. % deoxycholátu sodného při pH 8] k inkubaci na ledu po dobu 30 minut.

Vzorky byly sonikovány (Misonix XL{{0}}) po dobu 20 sekund na ledu a poté centrifugovány při 20 800 g po dobu 30 minut při 4 stupních. Frakce rozpustná v RIPA (supernatant) byla odstraněna a peleta byla resuspendována v 5M guanidinu (pH 8,0) pro analýzu nerozpustných proteinů. Každý vzorek byl sonikován po dobu 20 sekund na ledu, rotován po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a poté centrifugován při 20 800 g po dobu 30 minut při 4 stupních. Pro měření koncentrace proteinu každého vzorku byl použit test s kyselinou bicinchonovou (BCA) (č. 23225, Thermo Fisher Scientific).

Pro western bloty bylo 20 ug proteinu z každého vzorku naneseno na 4–12% NuPAGE (Invitrogen) gely a separováno pomocí MOPS pufru za redukovaných a denaturovaných podmínek. Proteiny byly přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu a vyvinuty pomocí Pierce ECL (enhanced chemiluminescence; Thermo Fisher Scientific). Vyvinuté signály byly vizualizovány pomocí ProteinSimple FCR (FluorChem R) a následné chemiluminiscenční signály byly kvantifikovány pomocí softwaru AlphaView (ProteinSimple). Všechny bloty byly analyzovány pomocí nástroje Local Background Correction s výjimkou blotu HDJ-2, který byl analyzován pomocí nástroje Background Link ve spojení s Multi-regional Background Correction (software AlphaView).

A 42 ELISA

K měření A42 v homogenátech hemimozku z myší 5XFAD byl použit komerčně dostupný enzymový imunosorbentní test (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) podle pokynů výrobce k analýze guanidinu a A42 rozpustného v PBS v hemimozcích. K měření A42 v mozcích hAPP/PS1 myší byla použita komerčně dostupná ELISA (h amyloid 42 ELISA vysoce senzitivní, Te Genetics Company, Zurich, Švýcarsko). ELISA byla provedena podle protokolu výrobce.

Imunofluorescence mozkové tkáně myši

Po perfuzi byly mozky extrahovány a hemimozky byly fixovány v 10% formalínu s následnou kryokonzervací ve 30% roztoku sacharózy v 1XPBS. Ke sběru 30-μm koronálních nebo sagitálních řezů byl použit mrazicí posuvný mikrotom. Řezy byly sériově umístěny do 12-jamkové destičky v kryoprotektivním roztoku (1xPBS, 30% sacharóza a 30% ethylenglykol) a skladovány při -20 stupních až do použití. Imunofluorescenční barvení bylo provedeno nejprve promytím řezů třikrát v 1XTBS a poté inkubací řezů v 16 mM glycinu v 1XTBS po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po 3 dalších promytích v 1XTBS byly řezy blokovány v 5% kozím séru v 0,25% Tritonu X-100 v 1XTBS po dobu 2 hodin při teplotě místnosti.

Řezy byly poté přes noc inkubovány v primárních protilátkách v roztoku 0,25% Triton X-100, 1% hovězího sérového albuminu a 1XTBS při 4 stupních. Sekundární imunobarvení bylo poté provedeno s oslími sekundárními protilátkami značenými AlexaFluor v koncentraci 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) byl použit k montáži řezů před zobrazením na širokoúhlém mikroskopu Ti2 nebo laserovém skenovacím konfokálním mikroskopu Nikon A1 pro kvantifikaci obrazu pomocí softwaru Nikon NIS Elements pro získání.

Všechna nastavení akvizice zůstala mezi genotypy stejná a všechny snímky byly pořízeny v rámci stejného zobrazovacího období pro jednotlivé experimenty (Northwestern University Center for Advanced Microscopy a Nikon Imaging Centre).

Kvantifikace obrazu

Myší mozky

Imunofluorescenční kvantifikace imunobarvení mozkové tkáně myší byla provedena na 3–5 řezech na zvíře, od souřadnic Bregma přibližně −0,94 až −2,55 mm, které byly zobrazeny pomocí 10X objektivu na širokoúhlém mikroskopu Ti2. Kvantifikační analýzy, včetně prahů velikosti a intenzity, byly provedeny pomocí softwaru Nikon NIS-Elements Software (Northwestern University Nikon Imaging Center).

V závislosti na signálu byly nastaveny prahové hodnoty pomocí nástroje General Analysis na základě velikosti objektu, tvaru a kontrastu a poté byly vytvořeny binární masky pro každý kanál a oblast zájmu. Prahování bylo prováděno samostatně na každém kanálu, aby se izolovaly sledované signály optimalizací poměru signálu k šumu a eliminací nespecifických signálů pozadí. Pro výpočet oblasti pokryté LAMP1, BACE1 nebo LysoTracker-Green, stejně jako měření intenzity fluorescence LAMP1 a Lysosensor v primárních neuronech, byly oblasti zájmu ručně trasovány pomocí NIS-Elements a pro každou oblast zájmu byla vytvořena binární vrstva.

Pro výpočet poměru LAMP1 k A42 byla plocha LAMP1 v dystrofických neuritech normalizována na plochu A42 na základě jednotlivých plaků a byly kvantifikovány průměrné poměry na myš mezi léčebnými skupinami. Analýza Pearsonova korelačního koeficientu pro BACE1 a LAMP1 byla provedena pomocí NIS-Elements na bázi plaku na projekcích maximální intenzity 30μm Z-stack snímků pořízených pomocí laserového skenovacího konfokálního mikroskopu Nikon A1 s velikostí kroku 1μm.

Pro výpočet poměru LysoTrackerGreen k Tiazinové červeni byla plocha LysoTracker-Green v dystrofických neuritech normalizována na plochu Tiazine Red na základě jednotlivých plaků a mezi léčebnými skupinami byl kvantifikován průměrný poměr na myš. Pro výpočet plochy nebo intenzity každého signálu v každé příslušné oblasti mozku pro každou myš byly použity čtyři koronální řezy z Bregma souřadnic přibližně -1,70 až -2,55 mm. Analýza oblasti pokryté plakem a velikosti plaku byla provedena s použitím průměru pěti řezů na myš z Bregma souřadnic přibližně -0,94 až -2,55 mm. Výběr řezů, získání obrazu, sledování obrazu a kvantifikace byly prováděny osobou zaslepenou vůči léčebným skupinám a genotypům.

Primární neurony

Pro kvantifikaci imunobarvení LAMP1 ve fixních myších primárních neuronech byly somas ručně vysledovány na základě morfologie pomocí NIS-Elements a pro každou oblast zájmu a kanál byla vytvořena binární maska. Prahování bylo použito k optimalizaci signálů LAMP1 a rozlišení LAMP1 v neuritech, včetně dendritů a axonů, izolací pixelů LAMP1 pozitivních na tubulinové pixely.

Buněčné signály soma LAMP1 byly vyloučeny z celkové oblasti LAMP1 pro analýzu vezikul LAMP1 v neuritech. Pro analýzu LysoTracker-Green motility v neuronech byly obrázky kvantifikovány pomocí NISElements. Rychlost a vzdálenost všech částic LysoTrackerGreen v každém snímku byly sledovány pomocí funkce automatického sledování pohybu v NIS-Elements. Pro eliminaci šumu na pozadí byl nastaven práh a aplikován na všechny filmy na základě velikosti a intenzity fluorescence částic LysoTracker-Green.

Pro generování kymografu bylo provedeno časosběrné zobrazování jednotlivých neuronů na 60X konfokálním mikroskopu a axony byly identifikovány morfologicky. Procento frekvence částic pohybujících se v anterográdním nebo retrográdním směru nebo stacionárních bylo kvantifikováno vydělením počtu částic pro každou skupinu celkovým počtem částic. Pro analýzy kymografu byly pohybující se částice definovány jako mající rychlost vyšší než 0,1 μM/s.

Statistická analýza

Software GraphPad Prism v8 byl použit k provádění statistických analýz, včetně analýzy rozptylu (ANOVA) s posthoc testy při porovnávání více než dvou vzorků a nepárových t-testů, kdy byly srovnávány pouze dva vzorky. Konkrétní podrobnosti testu včetně počtu replikátů, typu posthoc testů a hodnot P jsou uvedeny v legendách obrázků. Všechny kvantifikace jsou vyneseny jako průměr ± SEM. Významnost byla stanovena, když hodnota P byla nižší než 0,05, indikováno *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com