Extrakce, fyzikálně-chemické vlastnosti, anti-aging a antioxidační aktivity polysacharidů ze zbytků průmyslového konopí, část 1

Abstraktní: Po extrakci kanabidiolu zůstává ve zbytcích průmyslového konopí (IHR) velké množství konopných polysacharidů, což vede k plýtvání zdroji. Systematické studium konopných polysacharidů je proto pro rozvoj IHR v budoucnu přínosné. V této studii byla extrakce polysacharidů z průmyslových konopných reziduí (IHRP) optimalizována jednofaktorovým experimentem a ortogonálním experimentálním designem. Optimální podmínky extrakce zahřátím byly extrakční teplota 98 ​​◦C, poměr pevná látka–kapalina 1:10, doba extrakce 1 h, počet po sobě jdoucích extrakcí 2 a pH 4. Extrakční poměr a obsah polysacharidů byly 20,12 ± 0,55 procenta a 12,35 ± 0,26 procenta za podmínek. Kromě toho nejlepší podmínky pro srážení alkoholu byly čerpání 2 l/h, nepřetržité míchání a lázeň led-voda po dobu 4 hodin. Surové IHRP byly dále purifikovány sloupcovou chromatografií a obsahy polysacharid/protein v purifikovaných IHRP byly 34,44 procent a 1,61 procent. IHRP se skládaly hlavně z deseti monosacharidů a některých necukerných složek včetně organických kyselin, flavonoidů, steroidů a glykosidů. FT-IR prokázala polysacharidový skelet IHRP. Navíc míra vychytávání DPPH a ABTS u IHRP byla 76.00 procent a 99,05 procent při koncentracích 1 mg/ml. IHRPs by mohly podporovat proliferaci epidermálních buněk a hojení buněčných škrábanců. Mezitím by IHRP mohly podporovat expresi genů souvisejících se stárnutím. Celkově by IHRP mohly být v mnoha ohledech žádoucím přírodním zdrojem antioxidantů a produktů proti stárnutí.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na výhody rou cong rong

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: průmyslové konopí; polysacharid; extrakce; antioxidační aktivita; aktivita proti stárnutí

1. Úvod

Konopí seté (Cannabis sativa L.), jednoletá bylina z čeledi Cannabis, se používá již tisíce let [1]. Obsah tetrahydrokanabinolu (THC) v průmyslovém konopí je nižší než 0,3 % hmotn., což se liší od lékařské marihuany a rekreační marihuany [2,3]. Průmyslové konopí tedy mohlo být legálně pěstováno ve velkém. Chemické složení průmyslového konopí je velmi složité, zahrnuje kanabinoidy, terpenoidy, alkaloidy a flavonoidy [4]. Nejbioaktivnějšími sloučeninami jsou kanabinoidy, které zahrnují více než 130 terpenických fenolických sloučenin, které se hromadí především ve vrcholcích květů [5]. Hlavními kanabinoidy jsou THC, kanabidiol (CBD), kanabinol (CBN), kanabigerol (CBG), kanabidivarin (CBDV), kanabidiol (CBT) a kanabicyklol (CBL) [6]. Mezi nimi, THC, psychoaktivní sloučenina omezená v různých zemích, a CBD jsou nejvíce studovanými kanabinoidy pro jejich významné biologické aktivity [7], jako jsou neuroprotektivní, antiepileptické, protirakovinné a imunoregulační aktivity [8]. Existence těchto sloučenin zvyšuje význam průmyslového konopí. V současné době je průmyslové konopí široce používáno v oblastech každodenních chemikálií, materiálů, energie a medicíny [9]. Současná úprava zbytků průmyslového konopí (IHR) je přímo vyřazuje, což nejen znečišťuje životní prostředí, ale také způsobuje plýtvání zdroji [10].

Polysacharid je polymer, který se skládá z více než 10 monosacharidů [11]. Je to jedna z nejdůležitějších biologických makromolekul. V posledních letech mnoho článků uvádí, že přírodní polysacharidy z rostlin mají dobré biologické účinky, včetně protirakovinných [12], protizánětlivých [13], antioxidačních [14], imunomodulačních [15], hypoglykemických [16] a antivirových aktivit. [17]. Molekulární složení a prostorová struktura polysacharidů má obecně významný vliv na jejich vlastnosti a aktivity [18]. S rozvojem technologie separace, čištění a strukturní analýzy polysacharidů se obecně uznává, že polysacharidy mají velké aplikační hodnoty v oblasti léčiv, kosmetiky a potravin [19]. Obsah polysacharidů ze zbytků průmyslového konopí je asi 10 až 15 procent. Konopné polysacharidy mají mnoho vynikajících fyzikálně-chemických vlastností, protože obsahují mnoho hydrofilních hydroxylů, jako je silná schopnost absorpce vody, emulgační vlastnosti a dobrá schopnost tvořit film. Mezitím konopné polysacharidy zadržují vlhkost, mají antibakteriální a netoxické účinky. Proto mají rozsáhlé vyhlídky na uplatnění v oblasti kosmetiky. Fermentované produkty konopných polysacharidů (oligosacharidy nebo některé cukerné alkoholy), o kterých se uvádí, že mají dobré antioxidační, anti-aging a anti-únavové aktivity, byly použity k vývoji funkčních nápojů [20]. Složení konopných polysacharidů je poměrně složité a pohybuje se od monosacharidů až po polysacharidy 5 × 104 Da.

Existuje jen málo zpráv o separaci a extrakci konopných polysacharidů. Hillestad a kol. izoloval dva glykoproteiny z konopí. Vazebná struktura glukosidového řetězce a spojení mezi řetězcem a proteinem byly analyzovány methylací a Smithovou degradací [21]. JW Groce a kol. měřili obsah sacharidů v konopí pěstovaném ve Spojených státech, Thajsku a Vietnamu. Bylo poukázáno na to, že existují velké rozdíly v typu a obsahu sloučenin mezi kultivary z různých oblastí [22]. Zheng a kol. analyzovali monosacharidové složení a strukturu HSP0 a HSP0.2, dvou složek polysacharidu konopných semen, pomocí HPLC a FT-IR. Bylo zjištěno, že HSP0 a HSP0.2 oba obsahovaly sulfátové radikály [23]. Bi a kol. získali dva polysacharidy konopných semen HS1 a HS2 gelovou filtrační chromatografií. Hlavními monosacharidy byly D-arabinóza, D-xylóza, D-manóza, D-galaktóza a D-glukóza a jejich molární poměry byly 0,12, 0.09 , 0.15, 0.11, respektive 0.12 [24]. Guo a kol. připravovali polysacharidy z listů průmyslového konopí a studovali účinky ultrafialového světla, teploty a pH na jejich antibakteriální aktivitu. Bylo zjištěno, že minimální baktericidní koncentrace a minimální inhibiční koncentrace polysacharidů proti S. aureus byly 6,25 a 3,125 mg/ml, v daném pořadí. Kromě toho byla antibakteriální aktivita nejvyšší, když bylo pH 7.

V této studii byl IHR po extrakci kanabidiolu použit jako surovina pro extrakci polysacharidů. Byl optimalizován proces extrakce a čištění průmyslových konopných reziduálních polysacharidů (IHRPs). Poté byla analyzována struktura a složení IHRP. Kromě toho byla hodnocena schopnost IHRPs vychytávat ABTS a DPPH. Jeho anti-aging aktivita byla také studována na buněčné úrovni. Předpokládá se, že IHRPs by mohly být široce používány v kosmetice a funkčních potravinách.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Jednofaktorové experimenty extrakce pro IHRP

2.1.1. Účinky extrakčních metod na extrakci polysacharidů

Účinky perkolační extrakce, extrakce zahřátím a extrakce za pomoci ultrazvuku na extrakci polysacharidů jsou znázorněny na obrázku 1a. Bylo vidět, že obsah polysacharidů v perkolační extrakci se blížil 0 procentům, což naznačuje, že nebyl extrahován téměř žádný polysacharid a extrakt sestával hlavně z pigmentu a dalších složek rozpustných ve vodě. Výsledky byly způsobeny tím, že perkolační extrakce byla velmi jemná a buněčná stěna IHR nebyla porušena. Polysacharidy tedy nemohly být extrahovány z buněk, což způsobilo, že obsah polysacharidů a extrakční poměr perkolační extrakce byly velmi nízké. Extrakční poměr extrakce za tepla byl vyšší než extrakční extrakce za pomoci ultrazvuku. Obsah polysacharidů při extrakci zahřátím (11,27 procenta) byl však nižší než při extrakci za pomoci ultrazvuku (13,81 procenta). Extrakce teplem je jednou z nejběžněji používaných metod extrakce kvůli jednoduchosti procesu a nízké ceně. Doba extrakce ohřevem je však poměrně dlouhá a extrakční poměr není vysoký. Extrakční teplota má obecně velký vliv na extrakční poměr. Vyšší extrakční poměr extrakce za tepla v této práci byl způsoben tím, že extrakce za tepla byla prováděna při 98 ◦C, zatímco extrakce za pomoci ultrazvuku byla prováděna při 60 ◦C. Extrakce za pomoci ultrazvuku by mohla zkrátit dobu extrakce, protože kavitační efekt a mechanický efekt by mohly zničit buněčné stěny, zlepšit penetraci rozpouštědla a urychlit přenos polysacharidů do rozpouštědla [25]. Obsah polysacharidů při extrakci za pomoci ultrazvuku byl tedy vyšší než při extrakci zahříváním. Extrakce ohřevem byla zvolena pro následující experimenty vzhledem k jednoduchosti procesu a industrializaci.

2.1.2. Účinky extrakční teploty na extrakci polysacharidů

Účinky extrakční teploty na extrakci polysacharidů jsou znázorněny na obrázku 1b, když poměr pevná látka-kapalina byl 1:10, doba extrakce byla 1 h, počet po sobě jdoucích extrakcí byl 2 a pH bylo 7. Extrakční poměr a obsah polysacharidů se zvyšující se teplotou. Při teplotě 98 ◦C byl nejvyšší extrakční poměr a obsah polysacharidů 14,99 procenta a 12,03 procenta.

2.1.3. Účinky poměru pevná látka-kapalina na extrakci polysacharidů

Když byla teplota extrakce 98 ◦C, doba extrakce byla 1 h, počet po sobě jdoucích extrakcí byl 2 a pH bylo 7, účinky poměru pevná látka-kapalina na extrakci polysacharidů byly zobrazeny na obrázku 1c. Extrakční poměr se postupně zvyšoval s poměrem pevná látka-kapalina z 1:6 na 1:10 a poté se stal hladkým. Obsah polysacharidů však nebyl téměř ovlivněn poměrem pevné látky a kapaliny. Kromě toho by roztok mohl pouze ponořit surovinu, když byl poměr pevná látka-kapalina 1:5 kvůli nízké hustotě rostlinných listů. Proto byl primárně studován poměr pevná látka-kapalina 1:6.

2.1.4. Účinky pH na extrakci polysacharidů

Když byla teplota extrakce 98 ◦C, doba extrakce byla 1 h, počet po sobě jdoucích extrakcí byl 2 a poměr pevná látka-kapalina byl 1:10, účinky pH na extrakci polysacharidů byly zobrazeny na obrázku 1d. Když byl roztok okyselován nebo alkalizován postupně, extrakční poměr se do určité míry zlepšil. Obsah polysacharidů měl však klesající trend se zvýšením pH, což naznačovalo, že kyselé podmínky byly pro extrakci IHRP prospěšné.

2.1.5. Vliv doby extrakce na extrakci polysacharidů

Když byla extrakční teplota 98 ​​◦C, pH 7, počet po sobě jdoucích extrakcí 2 a poměr pevná látka-kapalina 1:10, účinky doby extrakce na extrakci polysacharidů byly zobrazeny na obrázku 1e. Extrakční poměr se mírně snížil, když doba extrakce přesáhla 1 hodinu. Kromě toho nebyl obsah polysacharidů téměř ovlivněn různými dobami extrakce.

2.1.6. Vliv počtu po sobě jdoucích extrakcí na extrakci polysacharidů

Když byla teplota extrakce 98 ◦C, doba extrakce 1 h, pH 7 a poměr pevná látka–kapalina 1:10, účinky několika po sobě jdoucích extrakcí na extrakci polysacharidů jsou znázorněny na obrázku 1f. Při druhé těžbě suroviny klesl těžební poměr na 5,11 procenta. Kromě toho byl obsah polysacharidů velmi nízký, když byla surovina extrahována potřetí.

2.2. Ortogonální experimentální návrh extrakce pro IHRPs

It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>poměr pevná látka-kapalina > pH. Skupina 5 (poměr pevná látka-kapalina byl 1:8, počet po sobě jdoucích extrakcí 3, extrakční teplota 80 ◦C a pH 4) měla nejvyšší obsah polysacharidů (12,79 procenta), zatímco skupina 9 (poměr pevná látka-kapalina byla 1). :10, počet po sobě jdoucích extrakcí 2, extrakční teplota 98 ​​◦C a pH 4) měly druhý nejvyšší obsah polysacharidů (12,26 procenta). S ohledem na spotřebu energie a provozuschopnost byla provedena srovnávací validace mezi skupinami 5 a 9, aby se určily nejvhodnější podmínky extrakce. Jak je uvedeno v tabulce 2, ověřené experimenty ukázaly, že obsah polysacharidů mezi skupinami 5 a 9 byl velmi blízký. Z důvodu úspory energie byly tedy extrakční podmínky skupiny 9 vybrány pro extrakci IHRP pro její použití v následujících experimentech: poměr pevná látka-kapalina byl 1:10, extrakční teplota byla 98 ◦C, počet po sobě jdoucích extrakcí byl 2 a pH bylo 4.

2.3. Screen of IHRPs Alcohol Precipitation Conditions

Extrakční roztok IHRPs byl získán podle extrakčních podmínek optimalizovaných podle 2.2. Účinky různých podmínek srážení alkoholem jsou uvedeny v tabulce 3. Ve srovnání s jednorázovým přidáním a mícháním po dobu 0,5 h může kontinuální čerpání a míchání obsah polysacharidů dále zlepšit. Vliv rychlosti chlazení na obsah polysacharidů však nebyl zřejmý. Proto byly pro přípravu IHRP zvoleny podmínky srážení alkoholem skupiny 4.

2.4. Výtěžek polysacharidů a chemické složení purifikovaných IHRP

Surové IHRP byly odbarveny a purifikovány adsorpcí na aktivním uhlí, membránovou filtrací, sloupcovou chromatografií a sevage metodou. Jak je znázorněno na obrázku 2, ošetření s 8% adsorpcí aktivního uhlí mělo nejlepší odbarvovací účinek, po kterém následovalo ošetření sloupcovou chromatografií. Kromě toho metoda selvage a membránová filtrace neměly téměř žádný odbarvovací účinek. Vzhledem k industrializaci a jednoduchosti procesu byla k čištění IHRP v tomto rukopisu použita kolonová chromatografie s anexovou pryskyřicí. Kromě toho, jak je uvedeno v tabulce 4, hmotnost IHRP byla 15,26 g, když bylo čištění prováděno po srážení alkoholem, zatímco hmotnost IHRP byla 12,74 g, když bylo čištění prováděno přímo po extrakci zahřátím. Skutečná hmotnost polysacharidu u těchto dvou procesů však byla velmi blízká (4,69 g a 4,38 g). Aby se tedy ušetřily náklady, čištění pomocí kolonové chromatografie by se mohlo provádět přímo po extrakci zahřátím.

2.5. FT-IR spektroskopie IHRP

Některé strukturní charakteristiky polysacharidů lze odvodit na základě charakteristických absorpčních píku FT-IR [26]. FT-IR spektrum IHRPs je znázorněno na obrázku 3 a bylo možné pozorovat typickou absorpci polysacharidu. Vrchol kolem 3378 cm−1 byl přisuzován -OH natahovací vibraci, což ukazuje na existenci -OH [27]. Slabým vrcholem při 2932 cm−1 byla CH natahovací vibrace, včetně vibrací -CH2 a -CH3 [28]. Silný vrchol při asi 1600 cm-1 souvisel s natahovací vibrací -C=O [29] a vrchol kolem 1413 cm-1 byl označen pro natahovací vibraci CO, což ukazuje na existenci -COOH. Kromě toho relativně silný vrchol při 1080 cm−1 velmi pravděpodobně odpovídá OH ohybové vibraci. FT-IR spektrum IHRPs vykazovalo mnoho charakteristických absorpčních píku polysacharidů, demonstrujících polysacharidový skelet IHRPs.

2.6. Analýza monosacharidového složení IHRP

Bioaktivita polysacharidů často souvisí s monosacharidovými kompozicemi. V této studii bylo monosacharidové složení IHRP získáno iontovou chromatografií, jak je znázorněno na obrázku 4. Podle monosacharidových standardů byly IHRP složeny z fukózy, arabinózy, rhamnózy, galaktózy, glukózy, xylózy, ribózy, kyseliny galakturonové, kyseliny guluronové, a kyselina glukuronová. Jejich procenta kvality byla 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 a 2,37. Bylo možné zjistit, že arabinóza, rhamnóza, galaktóza a glukóza byly hlavními monosacharidy v IHRP. Glukóza byla dominantním monosacharidem v IHRP a výsledek byl v souladu s předchozí studií [30]. Obsah kyseliny uronové mohl způsobit, že polysacharidy budou záporně nabité. Tento výsledek měl významný vliv na bioaktivitu polysacharidů [31]. Kromě toho byl obsah polysacharidů v IHRP mezi 30 procenty a 35 procenty. Necukerné složky byly především organické kyseliny, flavonoidy, steroidy a glykosidy. Mezitím byl obsah každé necukerné složky relativně nízký.

2.7. Studie antioxidační aktivity

Schopnost ABTS a DPPH pohlcovat volné radikály byla rozsáhle studována za účelem hodnocení antioxidační aktivity polysacharidů [32]. Schopnost vychytávání IHRP proti ABTS a DPPH je uvedena v tabulce 5. Jak ukazuje tabulka 5, rychlost vychytávání DPPH i ABTS se zvyšovala se zvýšením koncentrace IHRPs. Když byla koncentrace IHRP 1.0 mg/ml, míra vychytávání DPPH byla 76.00 procent, zatímco míra vychytávání ABTS byla 99.{{10}}5 procent . Po výpočtu byly hodnoty EC50 ABTS a DPPH určeny jako 0,34 a 0,47 mg/ml. Pokud je nám známo, neexistuje žádná zpráva o antioxidační aktivitě IHRP. Byla studována antioxidační aktivita květenství z 12 kultivarů Cannabis sativa L. monoecious [33]. Mezi nimi měl ananas nejsilnější pohlcovací aktivitu proti DPPH (EC50=60.00 µg/mL), zatímco Kc-Virtus měl nejsilnější vychytávací schopnost proti ABTS (EC50=304,77 µg/ ml). Pokud jde o antioxidační aktivitu oleje s plným spektrem kanabidiolu, bylo uvedeno, že jeho DPPH EC50 byla 158,0 µg/ml [34]. Navíc bylo hlášeno, že DPPH EC50 CBD je 0,937 mM [35]. Byla také studována kapacita CBDV pohlcovat volné radikály, tj. ABTS EC50 byla 406,3 uM, zatímco DPPH EC50 byla 3736 uM [36]. Výše uvedené výsledky ukázaly, že IHRP vykazovaly velkou antioxidační aktivitu

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】