Exprese renálního vitaminu D a genů souvisejících s fosfatoninem u ovčího modelu osteoporózy

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Osteoporóza je významným problémem veřejného zdraví na celém světě, přičemž postmenopauzální osteoporóza způsobená nedostatkem estrogenu má za následek přibližně 3/4 případů. V této studii byly odebrány vaječníky 18 starým ovcím plemene Merino a 10 bylo kontrolám. Tři z ovariektomizovaných ovcí byly léčeny týdně 400 mg methylprednisolonu po dobu 5 měsíců a tři byly léčeny týdně po dobu 2 měsíců, po kterých následovalo 3-měsíční období zotavení. Ve 2 měsících bylo usmrceno pět kontrolních zvířat a šest zvířat s odstraněnými vaječníky. V 5 měsících byly všechny zbývající ovečky utraceny. Vzorky ledvin byly odebrány postmortem pro qPCR analýzu NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA a NCX1. Oviektomizované ovce měly významně vyšší expresi VDR ve srovnání s jinými skupinami. Ovarektomizované ovce léčené glukokortikoidy po dobu 2 měsíců s následnou eutanazií po 5 měsících vykazovaly významné rozdíly v expresi genů TRPV5, CYP24A1 a klotho ve srovnání s jinými skupinami. Rozdíly v expresi klotho byly nejmarkantnější po úpravě pro opakované míry (p=0.1). Klotho je známý jako „hormon proti stárnutí“ a podílí se na metabolismu vápníku a fosforu. Klotho se může podílet na obnově minerální denzity kostí u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 2 měsíců s následnou eutanazií po 5 měsících. Doporučuje se další výzkum role klotho.

Kliknutím sem se dozvíte více

klíčová slova:osteoporóza; ovce; Vitamín D; fosfátování; qPCR; metabolismus vápníku; metabolismus fosforu; klotho

1. Úvod

Osteoporóza je hlavním problémem veřejného zdraví pro stále stárnoucí světovou populaci, která stála Spojené státy americké v roce 205 téměř 17 miliard USD a předpokládá se, že v roce 2025 vzroste na 25 miliard USD [1,2]. Přibližně 70-75 procent zátěže osteoporózou je způsobeno postmenopauzální osteoporózou u žen [1], primární osteoporózou, kdy nedostatek estrogenu vede ke snížené tvorbě kostí a zvýšené kostní resorpci, což vede ke snížení kostní hmoty a křehkosti kostí [3]. . Osteoporóza se může také vyskytnout sekundární ze specifických příčin, jako je léčba glukokortikoidy. Ovce je dobře zavedeným velkým zvířecím modelem pro různá lidská kosterní onemocnění, včetně osteoporózy[4]. Jednou z výhod velkého zvířecího modelu, jako je ovce, je schopnost testovat ortopedické implantáty, chirurgické techniky a biomateriály [4] Navíc je ovce relativně levná, snadno se s ní manipuluje a poskytuje dostatek materiálu pro testování. [4,5].

Nejběžnějšími modely osteoporózy u ovcí jsou ovce po 12 měsících po operaci ovariektomie a ovce po 6-měsíční ovariektomii na dietě s nedostatkem vápníku a vitamínu D s glukokortikoidy[4]. Použitím kombinace známých faktorů indukujících osteoporózu, včetně ovariektomie, léčby glukokortikoidy a diety s nízkým obsahem vápníku, jsme byli schopni vytvořit model osteoporózy u ovcí za pouhých 5 měsíců [6,7], a tak snížit ustájení, porod, a náklady na krmivo spojené s vývojem modelu. V tomto modelu bylo zjištěno, že ovariektomie zvyšuje sérové ​​koncentrace C-terminálních telopeptidů kolagenu typu I (CTX-I, marker kostní resorpce) a osteokalcinu (marker kostního obratu) ve srovnání s kontrolní ovcí. Ovce, které byly léčeny glukokortikoidy po dobu 2 měsíců, měly vyšší sérové ​​koncentrace CTX-I a nižší sérové ​​koncentrace osteokalcinu. Navíc kostní denzita femorální a bederní páteře a celková a trabekulární objemová kostní denzita proximální tibie byly nižší v experimentálně léčených skupinách ve srovnání s kontrolními skupinami, zejména u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy [6]. Metabolismus aminokyselin a lipidů byl rovněž zjištěn u ovariektomizovaných ovcí a ovcí léčených glukokortikoidy [7].cistanche wirkungPodobné změny byly také zjištěny u jiných modelů osteoporózy ovcí [8].

Cistanche může proti stárnutí

Geny reagující na vitamín D a fosfátovací systém nebyly dříve prozkoumány na modelech ovariektomizovaných ovcí. Vitamin D, z nichž 1,25-dihydroxyvitamin D je aktivní formou, nakonec vede ke zvýšeným koncentracím ionizovaného vápníku a fosforu v plazmě vazbou na heterodimer receptoru vitaminu D (VDR)-retinoid X receptoru a změnou exprese řady vitaminů D-responzivní geny, jako jsou proteiny vázající vápník (calbindin D9 a 28k (CalD9k, CalD28k)) a vápníkové kanály (člen 5 a 6 podrodiny kationtových kanálů přechodného receptorového potenciálu (TRPV5, TRPV6), kalciová ATPáza plazmatické membrány (PMCA) , sodno-vápenatý výměník 1(NCX1)[9]. Produkce 1,25-dihydroxyvitamínu D je přísně regulovaný krok, přičemž renální lo hydroxyláza (CYP27B1) katalyzuje přeměnu 25-hydroxyvitamínu D na 1,25-dihydroxyvitamín D a enzym 24-hydroxyláza (CYP24A1) štěpí jak 25-hydroxyvitamin D, tak 1,25-dihydroxyvitamín D na neaktivní vedlejší produkty.cistanche UKFosfátovací systém také kontroluje koncentrace fosforu a vápníku v plazmě[10]. Základním pilířem v tomto systému je fibroblastový růstový faktor 23, který je produkován osteocyty v kosti a primárně kontroluje koncentrace plazmatického fosforu vazbou na kofaktor klotho, aby se snížila exprese kotransportérů fosforečnanu sodného (NPT1, NPT2a, NPT2c) [11]. Vzhledem k vzájemně souvisejícím účinkům parathormonu a 1,{11}}dihydroxy vitaminu D bylo stanovení účinků FGF23 na metabolismus vápníku náročné, ale existují důkazy naznačující, že může regulovat střevní absorpci vápníku a ledvin reabsorpce vápníku[12,13].

Glukokortikoidy mají četné účinky na metabolismus vápníku a fosforu, včetně inhibice střevní absorpce vápníku, snížené renální tubulární reabsorpce vápníku a snížené renální reabsorpce fosforu [14-16]. Kromě toho malý výzkum zkoumal účinek nedostatku estrogenu na geny reagující na vitamín D a fosfátovací systém [17,18].

Tento model osteoporózy ovcí s dietou s nízkým obsahem vápníku a glukokortikoidy po ovariektomii poskytl příležitost získat předběžné informace o účincích těchto léčeb na expresi genů pro fosfátování a vitamin D v ledvinách ovcí. Cíle této studie byly dvojí: (1) určit, zda ovariektomie nebo ovariektomie a léčba glukokortikoidy změnila expresi vitaminu D a genů souvisejících s fosfátováním v ledvinách; (2) určit vztahy mezi renálním vitaminem D a geny souvisejícími s fosfátováním, sérový vitamin D a markery kostního obratu v séru (CTX-I a osteokalcin).

2. Materiály a metody

Podrobné metody pro vývoj modelu osteoporózy ovcí po ovariektomii a léčbě glukokortikoidy byly již dříve publikovány [6]. Stručně řečeno, staré ovečky Merino (7-9 let staré, n=28) byly náhodně rozděleny do skupin: kontrola (n=10) ovariektomizována (OVX) (n=12), ovariektomizována a léčba glukokortikoidy (40 mg methylprednisolonu subkutánní injekcí) měsíčně po dobu 2 měsíců s následnou žádnou léčbou po dobu 3 měsíců (n=3) a léčba glukokortikoidy (400 mg methylprednisolonu) měsíčně po dobu 5 měsíců (n=3) .citrusové bioflavonoidyOvce byly ustájeny ve stáji a krmeny buď kontrolní (115 g/kg vápníku; 2,2 g/ovce za den) nebo nízkovápenatou (5 g/kg vápníku; 1 g/ovce za den) koncentrátem ovčích pelet [19]. Požadavky na údržbu u nebřezích ovečky jsou 1,2 g/ovce za den[19].

Vzorky krve byly odebrány jugulární venepunkcí 2 měsíce a 5 měsíců po operaci. Osteokalcin byl měřen pomocí soupravy pro imunoanalýzu Micro Vue Osteocalcin a CTX-I pomocí soupravy IDS Serum CrossLaps ELISA, jak již bylo uvedeno [6]Koncentrace celkového vápníku a fosforu v séru byly měřeny pomocí spektrofotometrie na analyzátoru klinické chemie AU680 (Beckman Coulter, Brea , CA, USA). Koncentrace 25-hydroxyvitaminu D v séru byla měřena pomocí izotopového ředění kapalinového chromatogramu; raphy hmotnostní spektrometrie v Endolab, Canterbury Health Laboratories, Christchurch, Nový Zéland.

V měsících bylo 5 ovcí z kontrolní skupiny a 6 ze skupiny OVX usmrceno a pitváno. V 5 měsících byly utraceny i zbývající ovce (kontrolní skupina n =5, OVX skupina n=6, OVX plus 2m glukokortikoidů n=3 a OVX plus 5m glukokortikoidů n=5 ) a pitvány. Vzorky ledvin byly odebrány do 30 minut po smrti a rozděleny do dvou, přičemž jeden vzorek byl umístěn do 10procentního neutrálního pufrovaného formalínu a zpracován pro histologii a druhý rychle zmražen v kapalném dusíku a skladován při -80 stupni až do zpracování hematoxylinu a Řezy ledvin obarvené eosinem byly vyšetřeny primárním autorem a potvrdily nepřítomnost významných lézí.

Všechny experimentální postupy byly schváleny komisí pro etiku zvířat Massey University (číslo schválení 14/103) a prováděny podle Kodexu etického chování pro použití živých zvířat pro výzkum na Massey University, Palmerston North, Nový Zéland.

Extrakce RNA a qPCR byly provedeny tak, jak bylo popsáno dříve [20,21]. Krátce, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmstadt, Německo) bylo použito k extrakci RNA podle pokynů výrobce. Genomická DNA byla odstraněna pomocí Ambion Turbo DNA free (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) podle pokynů výrobce. Koncentrace RNA byla stanovena pomocí fluorometru Qubit 2.0 a soupravy Qubit RNA širokorozsahového testu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) a kvalita RNA byla hodnocena stanovením poměru 260/280 a spuštěním na agarózovém gelu. K syntéze cDNA byla použita souprava pro syntézu cDNA prvního vlákna Transcriptor (Roche). Každých 20 μl reakční směsi obsahovalo 600 ng RNA, 2,5 μM oligo（dT）, 8 mM RT reakčního pufru, 1 mM dNTP, 10 U reverzní transkriptázy, 20 U inhibitoru RNázy a vody bez RNázy. Reakce byla prováděna při 55 stupních po dobu 30 minut, 85 stupních po 5 minut a poté byla ochlazena na 4 stupně pomocí Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). qPCR v reálném čase byla provedena pomocí zařízení StepOne Plus real-time PCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, USA). Každá PCR směs obsahovala 5 ul Power SYBR Green PCR master mix (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), dopředné a reverzní primery v koncentracích uvedených v tabulce S1, 10 ng cDNA, a poté doplněno na 10 μl s RNázou, vodou bez DNázy. Protokol PCR sestával z 95 stupňů po dobu 20 s, 40 cyklů při 95 stupních a 60 stupních a nakonec křivky tání v rozsahu od 60 stupňů do 95 stupňů s rychlostí ohřevu 0,3 stupně/15 s. Voda a reakční směs bez reverzní transkriptázy byly zahrnuty jako negativní kontroly v každém běhu PCR a všechny vzorky byly analyzovány v duplikátech. Byly hodnoceny následující geny: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA a NCX1. Již dříve bylo zjištěno, že PKG1 a SDHA jsou stabilně exprimovány v ledvinách ovcí [20] a vzorky byly normalizovány vzhledem k expresi těchto genů a genové účinnosti pomocí 2-metody AACt [22].

Statistická analýza byla provedena pomocí R Studio 1.3.1093[23] s verzí R

4.0.3 a tidyverse, nlme 3.1-150 a Gary

2.1.2 balíčky. Lineární modely byly aplikovány na data exprese log10 transformovaného genového záhybu. V prvním modelu byla výslednou proměnnou genová exprese, zatímco skupina (kontrola nebo OVX, ale s výjimkou ovcí léčených glukokortikoidy) a čas (eutanazie ve 2 nebo 5 m) byly závislé proměnné, včetně interakčního termínu (skupina: čas). Ve druhém modelu byla výslednou proměnnou genová exprese, zatímco skupina (kontrola, OVX, OVX s léčbou glukokortikoidy po dobu 2 m a OVX s léčbou glukokortikoidy po dobu 5 m) byla závislou proměnnou.výhody cynomoriumProtože bylo testováno více výstupních proměnných (genů) na rozdíly mezi skupinami, byly hodnoty p upraveny pro vícenásobné testování pomocí sekvenčního Holmova postupu [24]. Koncentrace vápníku, fosforu a 25-hydroxyvitamínu D v séru byly testovány v modelech genové exprese, ale nebyly významné a vzhledem k absenci významných rozdílů mezi skupinami byly odstraněny. Kromě toho byla použita analýza hlavních složek k posouzení, zda se data exprese log10 transformovaného genového násobku liší podle skupiny, doby eutanazie nebo koncentrace 25-hydroxyvitamínu D v séru. Spearmanova párová korelace a rozptylové grafy byly použity ke studiu korelace mezi log10 transformovanými daty násobné exprese genu a sérovými analyty.

3. Výsledky

3.1. Vliv ovariektomie, doba od ovariektomie a léčba glukokortikoidy na sérové ​​koncentrace vápníku, fosforu a 25-hydroxyvitaminu D

Úplné výsledky sérových koncentrací vápníku, fosforu a 25-hydroxyvitamínu D v každé skupině jsou uvedeny na obrázku 1." Mezi skupina s ovariektomií a dietou s nízkým obsahem vápníku a skupina bez ovariektomie s adekvátní vápníkovou dietou a doba od ovariektomie 2 měsíce a 5 měsíců. Tyto výsledky naznačují, že ovariektomie kombinovaná s dietou s nízkým obsahem vápníku neměla žádný vliv na koncentrace vápníku v séru. a léčeni glukokortikoidy po dobu měsíců, po 5 měsících následovala eutanazie, měli významně nižší koncentrace vápníku v séru (p =0.0462, adj R20.13) ve srovnání s 5 m ovariektomizováno na dietě s nízkým obsahem vápníku a 5 m ovariektomizováno dne dieta s nízkým obsahem vápníku a ovce léčené glukokortikoidy. Zkoumání údajů však naznačuje, že to může být způsobeno jedním zvířetem, které bylo hypokalcemické (1,52 mmol/l, referenční rozmezí 2.0-2 0,7 mmol/l); odstranění z toto zvíře odstranilo jakýkoli význam.pouštní hyacintVšechny ostatní ovce měly koncentrace vápníku v séru v referenčním rozmezí. Nebyly pozorovány žádné rozdíly v koncentracích fosforu nebo 25-hydroxyvitamínu D v séru u 5 m ovariektomizovaných ovcí a ovcí léčených glukokortikoidy.

3.2. Vliv ovariektomie a doba od ovariektomie na vitamin D a genovou expresi související s fosfatoninem v ledvinách

Genová exprese vitaminu D a genů souvisejících s fosfátováním nebyla spojena s ovariektomií ani s dobou od ovariektomie (obrázek 2). Výjimkou byl receptor vitaminu D (VDR), kde skupina OVX měla významně vyšší expresi VDR (p=0.05, adj R2 0.16); tento význam však po úpravě pro opakovaná opatření zmizel.

3.3. Vliv ovariektomie a léčby glukokortikoidy na expresi vitaminu D a genovou expresi související s fosfatoninem v LEDVINÁCH 5 měsíců po operaci

Úplné výsledky jsou uvedeny na obrázku 3. Exprese PTH1R byla významně vyšší u OVX ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců ve srovnání s ostatními skupinami (p=0.04, adj R40.18), zatímco TRPV5 (p{ Exprese {8}}.01, adj R20.31) a CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) byla významně vyšší u ovcí OVX léčených glukokortikoidy po dobu 2 měsíců ve srovnání s ostatními skupinami.

Exprese klotho byla významně odlišná mezi všemi skupinami (p =0.01, adj R20.48), s nejnižší expresí u kontrolních ovcí. Ovce OVX léčené glukokortikoidy po dobu 2 měsíců měly nejvyšší expresi (p =0,002), následovaly ovce OVX (p=0,008) a poté ovce OVX léčené glukokortikoidy po dobu 5 měsíců (p{ {10}}.03). Po úpravě na opakovaná měření se však genová exprese mezi těmito skupinami významně nelišila, přičemž největší rozdíl vykazoval klotho u ovcí OVX léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců (p=0.1).

Podobně byla exprese VDR mezi všemi skupinami významně odlišná (p=0.03, adj R20.38). Největší exprese VDR byla u ovcí OVX léčených glukokortikoidy po dobu měsíců (p=0.009), následovaly ovce OVX (p=0.01), poté ovce OVX léčené glukokortikoidy po dobu 5 měsíců (p=0.05) a nejnižší exprese byla přítomna u kontrolních ovcí.

3.4. PCA celkové genové exprese mezi skupinami

Analýza PCA OVX, kontroly a eutanazie po 2 a 5 měsících nedokázala oddělit různé skupiny (obrázek S1). PCL a PC2 vysvětlily 69,6 procenta variace. Podobně analýza PCA u skupin usmrcených po 5 měsících také nedokázala oddělit různé skupiny. PCL a PC2 vysvětlily 53,2 procenta variace (obrázek S2). Analýza PCA ukázala, že celkovou genovou expresi nelze vysvětlit koncentracemi vápníku a fosforu v séru 25-hydroxyvitaminu D (obrázek S3).

3.5.Párová korelace mezi všemi analyty a genovou expresí

Bez ohledu na stav ovariektomie, obsah vápníku v dietě, dobu od ovariektomie (2 nebo 5 m) nebo stav léčby glukokortikoidy byla exprese genu NPT1 významně a pozitivně korelována (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Diskuze

Výsledky této studie naznačují, že léčba ovariektomovaných ovcí glukokortikoidy měla největší vliv na genovou expresi, zatímco samotná ovariektomie a doba od ovariektomie (2 a 5 měsíců) měla na genovou expresi malý vliv. V jednorozměrné analýze byly pozorovány významné rozdíly v expresi genů TRPV5, CYP24A1 a klotho u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 2 měsíců s následnou eutanazií po 5 měsících a v PTH1R u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců. Rozdíly byly nejmarkantnější v expresi klotho po úpravě pro opakovaná měření.

Kvantitativní periferní počítačová tomografie proximální tibie těchto ovcí ukázala, že ovariektomie snížila celkovou objemovou minerální hustotu kostí (vBMD) o 8 procent, ovariektomie s léčbou glukokortikoidy po dobu 5 měsíců o 27 procent a ovariektomie s glukokortikoidy na 2 měsíce a eutanazie o 13 procent [6]. Je zajímavé, že trabekulární BMD, trabekulární plocha a minerální obsah trabekulární kosti byly podobné nebo větší než u kontrol u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 2 měsíců a usmrcených po 5 měsících, což naznačuje obnovu kostní hmoty [6]. Glukokortikoidy mají několik dobře zdokumentovaných účinků na kosti, které vedou k rozvoji glukokortikoidy indukované osteoporózy. Tyto účinky zahrnují inhibici tvorby progenitorových buněk osteoblastů a osteoblastů, zvýšení apoptózy osteoblastů a snížení produkce osteoidů, přičemž všechny tyto účinky snižují tvorbu kosti [25,26]. Glukokortikoidy zároveň zvyšují kostní resorpci snížením exprese OPG, zvýšením exprese RANKL, zvýšením tvorby osteoklastů, snížením apoptózy osteoklastů a zvýšením sekrece katepsinů a matrixových metaloproteináz osteoklasty [25,26].

Klotho je nedílnou součástí fosfátovacího systému, čímž se váže na fibroblastový růstový faktor 23 (FGF23) v ledvinách. Komplex klotho-FGF23 se poté váže na receptor FGFR1IIC, který iniciuje několik buněčných cest a v konečném důsledku vede k upregulaci exprese renální 24-hydroxylázy (CYP24A1) a downregulaci renální la-hydroxylázy (CYP27B1) a renální tubulární kotransportéry Na/P II (NPT2a a 2c) [10]. Zvýšená exprese (rozdíly, ve kterých byly nejvýraznější po úpravě na opakovaná měření) klotho u ovcí užívajících glukokortikoidy po dobu 2 měsíců a poté usmrcených po 5 měsících může vysvětlit zvýšenou expresi CYP241 pozorovanou také u této skupiny ovcí, a to i přes žádné významné rozdíly v sérové ​​koncentrace 25OHD.

Klotho je známý jako protein proti stárnutí a myši s deficitem klotho mají nízkou kostní tvorbu a kostní resorpci, což vede k osteopenii s nízkým kostním obratem [27,28]. Specifické polymorfismy genu klotho jsou navíc spojeny se sníženou minerální hustotou kostí u lidí [29,30]. Rozpustné klotho upreguluje protein 1 časné růstové odpovědi (EGR-1) a indukuje expresi kostních diferenciačních markerů v buněčné kultuře osteoblastů [31]Glukokortikoidy mohou navíc potlačit fibroblastový růstový faktor 232]. Možná, že vyšší klotho exprese u ovcí na glukokortikoidech po dobu 2 měsíců a poté usmrcených po 5 měsících je odrazem procesu obnovy pro tuto ovčí po léčbě glukokortikoidy a vzhledem k jeho úloze při tvorbě a resorpci kostí, pravděpodobně klíčovou hnací silou obnovy kostí a tudíž potenciálně cílem léčby osteoporózy u lidí.

Ovce OVX však také měly zvýšené klotho exprese ve srovnání s kontrolními ovcemi. Podobně jedna studie na myších s deficitem aromatázy ukázala, že nedostatek estrogenu zvýšil hladiny klotho proteinu a léčba estradiolem snížila expresi klotho u těchto myší[17]. U myší estrogen downreguluje NPT2a v procesu, který je nezávislý na klotho/FGF23 a PTH[18]. Tento účinek však nebyl v této studii pozorován u ovariektomizovaných ovcí. Jinak o vlivu nedostatku estrogenu na klotho je málo literatury. Další výzkum by měl prozkoumat účinky jak ovariektomie, tak glukokortikoidů na expresi klotho, vzhledem k jeho roli při stárnutí a chronickém onemocnění ledvin.

TRPV5 je epiteliální kalciový kanál exprimovaný především v distálních stočených tubulech a spojovacích tubulech ledviny [20,33]. Kanál TRPV5 je konstitutivně otevřený, ale podléhá inaktivaci závislé na vápníku ve spojení s kalmodulinem, proteinem citlivým na vápník [34]. Expresi TRPV5 lze zvýšit pomocí PTH a 1,25(OH)D3 [35]. Jedna ovce, která byla na glukokortikoidech po dobu 2 měsíců a poté byla po 5 měsících utracena, byla hypokalcemická a koncentrace vápníku v séru byly u ovcí v této skupině významně nižší ve srovnání s ostatními skupinami. Je proto pravděpodobné, že zvýšená exprese TRPV5 je výsledkem snížené koncentrace vápníku v séru u těchto zvířat. Bylo prokázáno, že glukokortikoidy snižují střevní absorpci vápníku snížením exprese TRPV6 a CalD9k [36,37] a zvýšením vylučování vápníku močí [14], ale klinicky významná hypokalcémie u zdravých jedinců není častá. Podobně ovce s nízkou koncentrací vápníku v séru nevykazovaly žádné klinické příznaky hypokalcemické tetanie. Alternativně by zvýšená exprese TRPV5 u ovcí na glukokortikoidech po dobu 2 měsíců a poté usmrcena po 5 měsících mohla odrážet proces obnovy, přičemž k nahrazení obnovené trabekulární BMD, plochy a obsahu kostních minerálů je nutná zvýšená resorpce vápníku z ledvin.

U ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců byla exprese PTH1R ve srovnání s ostatními skupinami zvýšená. Kromě toho ve srovnání s jinými skupinami existovaly malé rozdíly v expresi mezi ovcemi ve skupině. I když nebyly pozorovány žádné rozdíly v koncentracích vápníku v séru u ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců, možná by to mohlo souviset se zvýšeným účinkem PTH a jeho receptoru. Účinky glukokortikoidů na sekreci a působení PTH jsou nejasné. Některé studie u lidí zjistily, že pacienti léčení glukokortikoidy mají zvýšené sérové ​​koncentrace PTH spolu se sníženou absorpcí vápníku, zvýšeným vylučováním vápníku močí a sníženou kostní hmotou [38,39]. Většina studií však nezjistila žádné změny sérových koncentrací PTH u lidí při léčbě glukokortikoidy [38,40,41]. Jedna studie ukázala, že vliv glukokortikoidů je možná na změnu sekrece PTH se zvýšenou pulzační sekrecí PTH u jedinců léčených glukokortikoidy[4]. Jiní také prokázali zvýšenou expresi PTH1R v mezenchymálních kmenových buňkách a buňkách podobných osteoblastům v reakci na léčbu dexamethasonem [43,44]. Jako takové je zvýšení renální exprese PTH1R u ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 5 měsíců pravděpodobně způsobeno 5měsíční léčbou glukokortikoidy.

Zatímco ovariektomie kombinovaná s dietou s mírně nízkým obsahem vápníku vedla k minimálním změnám genové exprese, zdálo se, že změnila expresi VDR, přičemž ovce po ovariektomii na dietě s mírně nízkým obsahem vápníku měly vyšší expresi VDR ve srovnání s kontrolními ovcemi. To je v kontrastu se studií na krysách po ovariektomii, kdy ti, kterým byla podávána strava s normálními hladinami vápníku, vykazovali zvýšenou renální expresi VDR, zatímco ti, kteří dostávali dietu s nízkým obsahem vápníku, měli sníženou expresi VDR [45]. V této současné studii na ovcích je obtížné oddělit účinek ovariektomie na renální expresi VDR od účinku diety s nízkým obsahem vápníku. Mezi skupinami však nebyly žádné významné rozdíly v koncentracích vápníku v séru (s výjimkou skupiny s glukokortikoidy), což naznačuje, že dieta s mírným nízkým obsahem vápníku měla minimální účinek a účinky na VDR jsou pravděpodobně způsobeny ovariektomií. K prozkoumání těchto vztahů však bude zapotřebí další výzkum.

Dvě předchozí studie zkoumaly oddělené vztahy mezi geny citlivými na vitamin D a geny souvisejícími s fosfátováním v ledvinách ovcí [20,21]. Vztahy mezi vitaminem D a fosfátovacími cestami však nebyly zkoumány. Je zajímavé, že nejvýznamnější korelace mezi geny uvedené v těchto dvou dokumentech platí i pro genové vztahy v této současné studii ovcí, což naznačuje konzistenci výsledků mezi studiemi a vztahy mezi těmito geny.extrakt z cistanche salsyZe zajímavých vztahů, které nebyly dříve uvedeny, jak by se dalo očekávat vzhledem k jeho klíčové roli v metabolismu vápníku, exprese PTH1R vysoce korelovala s CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho a NPT2c. Exprese klotho silně korelovala s genovou expresí TRPV5, což je v souladu s další literaturou, která ukazuje, že klotho upreguluje TRPV5 a podporuje renální reabsorpci vápníku [46,47].

Bohužel různé skupiny nebylo možné oddělit na základě genové exprese citlivé na vitamín D a fosfátování pomocí analýzy PCA. To je pravděpodobně způsobeno hlavním omezením této studie - malou velikostí vzorku. S pouze 3-6 zvířaty v každé ze skupin to pravděpodobně omezilo schopnost detekovat rozdíly v genové expresi mezi skupinami.

5. Závěry

Výsledky této studie ukazují, že nejvýraznější rozdíly v genové expresi byly v renální klotho expresi u ovariektomizovaných ovcí léčených glukokortikoidy po dobu 2 měsíců, po nichž následovalo období zotavení 5 měsíců. Vzhledem k tomu, že klotho je hormon „proti stárnutí“ a má kritickou roli v metabolismu vápníku a fosfátů, je možné, že se tento hormon kriticky podílí na obnově hustoty a plochy trabekulárních kostí u léčených ovcí, a proto může být potenciálně léčebný cíl pro osteoporózu u lidí. Je však zapotřebí dalšího výzkumu účinků glukokortikoidů a ovariektomie na klotho.

Tento článek je převzat z Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals