Zkoumání potenciálu extraktů islandských mořských řas produkovaných vodným pulzním elektrickým polem asistované extrakce pro kosmetické aplikace Část 2
Jul 05, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
2.4. Antioxidační schopnosti extraktů z islandských mořských řas
A.esculenta měla nejsilnější aktivitu vychytávání DPPH mezi surovými extrakty tří druhů řas (p<0.05), with="" scavenging="" effects="" higher="" than="" 90%(table="" 3).="" compared="" with="" the="" different="" standard="" solutions,="" a.esculenta="" showed="" comparable="" scavenging="" activity="" as="" 100ug/ml="" of="" ascorbic="" acid="" (87.9%),="" gallic="" acid="" (91.0%),="" and="" α-tocopherol="" (87.9%).="" our="" results="" were="" in="" agreement="" with="" recent="" studies="" [50],="" which="" also="" reported="" a="" positive="" antioxidant="" activity="" of="" a.esculenta="" extracts.="" surprisingly,="" no="" significant="" differences="" in="" antioxidant="" activity="" were="" observed="" between="" the="" different="" extraction="" methods="" tested="" (p="">0.05). Očekávalo se, že extrakty PEF budou vykazovat lepší antioxidační hodnoty než extrakty vyrobené tradiční extrakcí za horka, protože jiné studie ukázaly, že zelené techniky (jako je extrakce za pomoci mikrovlnné trouby nebo enzymatická extrakce) by mohly účinně zabránit rozkladu bioaktivních sloučenin a vykazovat vyšší antioxidační aktivity [59,60].
Byla také studována schopnost extraktů z mořských řas redukovat železitý (Fe8#) na železnatý (Fe2 plus )ion a schopnost vychytávat radikál ABTS, a to metodou FRAP a ABTS. Výsledky FRAP ukázaly podobné trendy jako DPPH, což ukazuje, že A. esculenta měla nejsilnější schopnost redukovat železité (Fe3 plus) na železnaté (Fe2 plus) ionty ze surových extraktů tří druhů řas (p<0.05). however,="" a="" different="" behavior="" was="" found="" for="" the="" abts.="" all="" seaweed="" extracts="" showed="" a="" similar="" ability="" to="" scavenge="" the="" radical="" abts="" (p="">0.05), což naznačuje, že tyto druhy pravděpodobně obsahují některé účinné sloučeniny, které jsou zodpovědné za jejich vychytávací aktivitu.
Obecně je známo, že hnědé řasy mají vyšší antioxidační potenciál ve srovnání s červenými a zelenými skupinami [61]. Naše výsledky také ukázaly, že vodné extrakty z A. esculenta vykazovaly účinné antioxidační aktivity s ohledem na vychytávání volných radikálů a snižování síly, což naznačuje, že A. esculenta by mohla být potenciálně zdrojem přírodních antioxidantů. Vysoká antioxidační aktivita pozorovaná u extraktů A.esculenta by mohla souviset s vysokým obsahem fenolických sloučenin zjištěným v extraktech z hnědých řas. V mnoha studiích byla antioxidační aktivita extraktů z řas připisována fenolickým sloučeninám, což ukazuje pozitivní korelace mezi obsahem fenolů a schopností zachycovat, většinou s DPPH [62,63]. Podobné výsledky korelace byly nalezeny v současné studii pro extrakty A.esculenta (viz lepší diskuse v části 2.6. Korelace mezi chemickými sloučeninami a bioaktivními vlastnostmi).
2.5. Enzumatické inhibiční aktivity extraktů islandských mořských řas
Extrakty z islandských mořských řas vykazovaly pozitivní inhibiční účinky vůči všem testovaným enzymům (tabulka 4), čímž se otevřely nové cesty pro využití přírodních enzymatických inhibitorů ze zdrojů řas. Podle našich nejlepších znalostí je to poprvé, co byly testovány enzymatické inhibiční aktivity extraktů z islandských mořských řas produkovaných PEF.
koupit cistanche
2.5.1. Inhibiční aktivita kolagenázy
Extrakty A.esculenta vykazovaly pozitivní inhibici kolagenázy v rozmezí od 68 do 91 procent, zatímco extrakty P. palmaria a U. Lactuca vykazovaly nevýznamné inhibiční aktivity proti kolagenáze (tabulka 4). Extrakt z horké vody A.esculenta vykazoval 71,1 procenta inhibiční aktivitu kolagenázy, což bylo vyšší než standardní roztok epigalokatechin-3-galátu (EGCG) (63,2 procenta) a srovnatelný s pozitivním standardem, který poskytuje komerční enzymatická souprava (74,9 procenta). Důležitým zjištěním bylo, že extrakty A.esculenta produkované PEF vykazovaly inhibici kolagenázy 91 procent, vykazující dokonce vyšší aktivitu než inhibitor poskytovaný komerčním kitem. Je třeba zdůraznit, že tato aktivita byla pozorována pouze ve vodních extraktech produkovaných PEF a nikoli kombinací PEF plus HW. Toto chování lze vysvětlit možností, že proces horké vody by mohl mít negativní vliv na sloučeniny odpovědné za inhibici aktivity kolagenázy. K vysvětlení těchto výsledků jsou však nutné další studie kvůli složitosti surových extraktů z řas. Výše uvedená výzkumná skupina v současné době pracuje na identifikaci inhibičních molekul v extraktech A.esculenta, aby lépe porozuměla těmto pozitivním účinkům produkovaným PEF.
Cistanche může proti stárnutí
Výsledky týkající se inhibice kolagenázy extrakty A.esculenta jsou v souladu s předchozími údaji, ve kterých je A.esculenta používána v komerčních extraktech kvůli svému účinku proti stárnutí. K degradaci kolagenu dochází stárnutím v důsledku aktivity kolagenázy, což má za následek vrásky na pokožce. Inhibice kolagenázy přirozeně se vyskytujícími sloučeninami je zajímavou příležitostí pro produkty proti stárnutí. Například SEPPIC, dodavatel přísad pro kosmetický průmysl, nabízí lipofilní extrakt z A.esculenta (Kalpariane AD) [64].
2.5.2. Aktivita inhibice elastázy
Only the crude extracts of A.esculenta inhibited elastase, exhibiting activities higher than 70% of inhibition (Table 4). However, the anti-elastase activities of A.esculenta extracts did not statistically differ among extraction methods (p>{{0}}.05). Ve srovnání s roztoky kvercetinu, dobře známého inhibitoru elastázy, který vykazoval 100% inhibici při 1 mM a 58,7 procenta při 0,5 mM, byla účinnost extraktů z A. esculenta vysoká.
Elastáza je proteinázový enzym, který může redukovat elastin rozbitím specifických peptidových vazeb. V důsledku toho lze inhibici aktivity elastázy ve vrstvě dermis využít k udržení elasticity kůže [65]. Mnoho rostlinných extraktů bylo identifikováno jako inhibitory elastázy [17]; nicméně bylo provedeno jen málo výzkumů na inhibici elastázy ze zdrojů řas. Podle literárních údajů je známo, že polyfenoly extrahované z rostlin jsou silnými inhibitory elastázy a hyaluronidázy [66]. Nedávná studie uvádí, že florotaniny, typ taninu v hnědých řasách, výtažky z mořské řasy Eisenia bicycles a hnědé řasy Ecklonia cava, prospívají pokožce tím, že významně snižují aktivitu elastázy [67]. Extrakty A.esculenta produkované v této studii vykazovaly nejvyšší hodnoty TPC a TFC ve srovnání s ostatními studovanými druhy (tabulka 4), takže to mohl být důvod, proč vodné extrakty z P. palmaria a U. Lactuca nevykazovaly anti- elastázové aktivity. Pro potvrzení této hypotézy byla provedena Pearsonova korelační analýza, která naznačovala, že antienzymatické aktivity pozitivně korelují s obsahem fenolických látek (viz další diskuse v části 2.6. Korelace mezi chemickými sloučeninami a bioaktivními vlastnostmi).
2.5.3. Inhibiční aktivita tyrosinázy
Extrakty z A.esculenta vykazovaly pozitivní inhibici tyrosinázy vyšší než 90 procent u všech použitých extrakčních metod, zatímco extrakty P.palmaria a U. Lactuca nevykazovaly inhibiční účinky na tyrosinasu (tabulka 4). Anti-tyrosinázové aktivity extraktů A.esculenta se však nelišily (str<0.05) with="" extraction="" methods.="" comparing="" the="" effect="" of="" a.esculenta="" extracts="" with="" the="" quercetin="" solutions="" tested,="" the="" crude="" extracts="" of="" the="" brown="" algae="" showed="" better="" inhibitory="" activities="" than="" these="" solutions(88="" and75%="" for="" the="" 0.5="" and="" 1="" mm="" quercetin="" solutions,="" respectively).="" based="" on="" the="" literature,anti-tyrosinase="" activities="" of="" plants,="" bacteria,="" and="" fungi="" have="" been="" reported="" by="" several="" researchers="" i68i.="" however,="" though="" different="" studies="" suggest="" that="" bioactive="" compounds="" derived="" from="" marine="" algae="" have="" a="" good="" potential="" to="" be="" utilized="" as="" skin="" whitening="" agents="" [13],="" this="" is="" still="" an="" unexplored="" domain="" and="" only="" a="" few="" studies="" have="" been="" carried="" out.="" most="" of="" the="" studies="" performed="" in="" this="" area="" have="" been="" focused="" on="" brown="" algae,="" agreeing="" with="" the="" results="" of="" the="" present="" study="" in="" which="" a.esculenta="" extracts="" exhibited="" the="" best="" anti-tyrosinase="" activities.="" for="" instance,="" phloroglucinol="" derivatives="" and="" phlorotannins,="" common="" secondary="" metabolites="" found="" in="" brown="" algae,="" have="" shown="" inhibitory="" activity="" against="" tyrosinase="" due="" to="" their="" ability="" to="" chelate="" copper="" [69].="" in="" a="" recent="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" lessonia="" trabeculate="" produced="" by="" microwave-assisted="" extraction="" inhibited="" a="" tyrosinase="" activity="" of="" 33.73%[60].in="" another="" study,="" the="" extract="" of="" the="" brown="" algae="" turbinaria="" conoides="" showed="" activity="" as="" an="" antioxidant="" and="" tyrosinase="" inhibitor,="" however,="" in="" this="" case,="" ethanol="" was="" used="" as="" solvent="" [70].="" a="" significant="" correlation="" between="" the="" inhibitory="" potency="" of="" polyphenols="" extracted="" from="" plants="" on="" mushroom="" tyrosinase="" has="" been="" reported="" in="" previous="" studies="" [68].="" likewise,="" the="" results="" of="" this="" study="" suggest="" that="" the="" inhibitory="" activity="" towards="" tyrosinase="" was="" positively="" correlated="" with="" flavonoid="" and="" phenolic="" content="" (see="" section="" 2.6.="" correlations="" between="" chemical="" compounds="" and="" bioactive="">
cistanche แอ ม เว ย์
Tyrosináza hraje důležitou roli v biosyntéze melaninového pigmentu v kůži. Melanin je zodpovědný za ochranu před škodlivým ultrafialovým zářením, které může způsobit několik patologických stavů [71]. Navíc může způsobit estetické problémy, když se melanin hromadí jako hyperpigmentované skvrny [72]. Začlenění inhibitorů tyrosinázy do kosmetických produktů tedy může být atraktivní díky bělícím a/nebo zesvětlujícím účinkům.
2.5.4. Hyaluronidázová inhibiční aktivita
Všechny extrakty z mořských řas vykazovaly významně vysokou antihyaluronidázovou aktivitu (tabulka 4), vykazující srovnatelné výsledky s roztoky kyseliny tříslové (dobře známý inhibitor hyaluronidázy). Konkrétně extrakty A.esculenta vykazovaly 100 procent inhibice pro všechny testované metody. Navíc extrakty U. Lactuca vykazovaly aktivity vyšší než 90 procent inhibice, kde inhibice extraktů produkovaných PEF (96,8 procent o) a kombinace PEF plus HW (97,3 procenta) byla vyšší než inhibice produkovaná tradičními horkými vodní metoda 93,4 procenta )(str<0.05). all="" p.palmaria="" extracts="" exhibited="" similar=""><0.05), the="" inhibition="" of="" the="" extracts="" produced="" by="" pef="" was="" (91.9="" %)and="" the="" combination="" of="" pef+hw="" (89.5%)="" and="" the="" traditional="" hot="" water="" method="">
Jiní autoři také popsali antihyaluronidázovou aktivitu různých extraktů z mořských řas, zejména extraktů bohatých na florotaniny z hnědých řas [73,74]. Nicméně, pokud je nám známo, toto je poprvé, kdy byly hlášeny inhibiční aktivity hyaluronidázy extraktů P. palmata a U. Lactuca produkovaných PEF.
Kyselina hyaluronová je hlavní složkou dermis, kde se podílí na opravě tkáně, odbourává se stárnutím, způsobuje vrásky a ztrátu pevnosti pokožky. V tomto smyslu inhibitory hyaluronidázy zvyšují hladinu kyseliny hyaluronové v dermální extracelulární matrix pro zlepšení vzhledu stárnoucí pokožky obličeje [13].cistanchVýsledky této studie by proto mohly otevřít nové cesty pro využití přírodních inhibitorů hyaluronidázy ze zdrojů řas s potenciálním využitím v kosmetických přípravcích.
V souhrnu nám získané údaje umožnily dospět k závěru, že extrakty A.esculenta vykazovaly celkově lepší inhibiční aktivity než P.palmaria a U.lactuca vůči testovaným enzymům. Jedná se tedy o nejslibnější druh mořských řas s vynikajícími antienzymatickými aktivitami, a proto byl vybrán pro další studie v naší laboratoři. Ačkoli se surové extrakty z A. esculenta zdají být dobrými kandidáty pro experimenty in vitro, je třeba provést další studie, aby se objasnila identita metabolitů odpovědných za tyto biologické účinky.
2.6. Korelace mezi chemickými sloučeninami a bioaktivními vlastnostmi
Výsledky analýzy hlavních komponent (PCA) ukázaly, že hlavní oddělení skupin bylo definováno pomocí PC1 a PC2, které představovaly 71,9 procenta a 14,5 procenta rozptylu v datech (obrázek 2). Extrakty A.esculenta se vyznačovaly vyššími obsahy flavonoidů a fenolických sloučenin, inhibičními účinky na enzymy (kolagenáza, tyrosináza a elastáza) a hodnotami DPPH a FRAP než ostatní druhy P. palmata a U.lactuca. Na druhou stranu A.esculenta měla nižší obsah sacharidů, zejména ve srovnání s P. palmitate (který se nacházel na opačné straně PC1). Rozdíly v datech podél PC2 souvisely hlavně s ABTS a inhibicí hyaluronidázy. Jak ukazuje umístění na grafu, P. palmitát měl silnější korelaci s ABTS, zatímco U. lactuca více souvisel s účinky inhibice hyaluronidázy ve srovnání s těmito dvěma druhy.
Pearsonovou korelační analýzou byla prokázána vysoká a významná pozitivní korelace mezi TPC, TFC, DPPH, FRAP a inhibičními účinky na kolagenázu, elastázu a tyrosinázu (tabulka 5).
kolik cistanche vzít
To bylo v souladu s předchozími studiemi, které uvádějí, že fenolické sloučeniny (včetně flavonoidů) jsou hlavními přispěvateli k antioxidační aktivitě různých mořských řas [75-77]. Vysoká antioxidační aktivita extraktů z hnědých makrořas souvisí se specifickou skupinou polyfenolů, florotaninů a jejich unikátní molekulární strukturou. Phlorotannis z hnědých řas má údajně až osm vzájemně propojených fenolových kruhů, které fungují jako elektronové pasti [78,79]. Očekávalo se, že ABT budou korelovat s TPC a dalšími antioxidačními parametry. Možnými důvody mohou být to, že metody jsou založeny na různých reakčních podmínkách a že reaktivita se liší jak s ohledem na čas, tak rozsah složek. Například ABTSreagent reaguje s širším spektrem antioxidantů než radikál DPPH [80]. Na druhou stranu, jedním z omezení uvedených u ABTS je dlouhá reakce a obecná reakční doba nemusí umožnit dosažení koncového bodu.
Výsledky ukazují, že existuje vysoká pozitivní korelace mezi TPC a TFC s inhibiční aktivitou kolagenázy, elastázy a tyrosinázy ({{0}}.93-0.99), zatímco vztah k inhibici hyaluronidázy nebyla tak silná (r=00,42 a 0,54, v tomto pořadí). To naznačuje, že k inhibičnímu účinku extraktů mohly přispět i jiné složky. Jiné studie uvádějí, že polysacharidy mají aktivitu inhibující hyaluronidázu, například kyselina alginová v hnědých řasách [81,82]. Další studie chemického složení druhů makrořas pro účinky izolovaných sloučenin na enzym jsou potřebné k vyhodnocení přínosu každé chemické složky, protože v této studii byl kladen důraz na surové extrakty. Zjištění byla v souladu s předchozími studiemi a uváděla, že chemické složení a úrovně biologické aktivity extraktů se významně liší mezi třemi liniemi (červená, zelená a hnědá řasa) a mezi různými druhy patřícími do stejného kmene a jsou ovlivněny věkem. a typu tkáně. Kromě toho složení a vlastnosti závisí na mnoha faktorech prostředí ovlivňujících distribuci a růst makrořas. Například světlo (UV záření), teplota, dostupnost živin, expozice vzduchu, pohyb vody, expozice vlnění a slanost. Teplota byla popsána jako faktor, který má nejsilnější vliv na tvorbu pigmentu a koncentraci živin, salinitu a UV záření jako faktory ovlivňující koncentraci TPC [83].
Distribuce různých druhů makrořas se mění s hloubkou vody. Polohy výše u břehu v přílivové nebo přímořské zóně jsou stresující, protože druhy, které tam rostou, musí odolávat mnoha změnám abiotických faktorů v důsledku slapových změn. Například vysoušení vzduchu, vysoké sluneční záření (při odlivu), změny slanosti a teploty a za podmínek nízkých teplot vzduchu včetně mrazu. Pod hranicí nízké hladiny vede rostoucí hloubka k velmi rychlému poklesu intenzity světla a menšímu vystavení záření.
co je cistanche
Řasy rostoucí v oblasti přílivu a odlivu mají nižší citlivost na UV záření a rychleji se zotavují ze slunečního stresu. Zatímco řasy rostoucí v sublitorální zóně jsou citlivější na UV záření a mají nižší zotavení ze slunečního stresu [84]. Vodní sloupec zároveň poskytuje ochranu. V této studii byla expozice slunečnímu záření pravděpodobně silnější pro P. palmitate ve srovnání s jinými druhy. Jiné studie ukázaly, že tvorba MAA přímo souvisí se slunečním zářením [85], které chrání organismy před UV-A a UV-B zářením. Navíc se ukázalo, že specifické množství MAA se snižovalo s rostoucí hloubkou sběru. Je známo, že řasy jako A.esculenta rostou v horní sublitorální zóně, ale také zasahují do nejnižšího přílivu těsně nad značkou odlivu. To znamená, že vodní sloupec poskytoval silnější ochranu než u P. palmitate. Kromě toho jsou morfologické charakteristiky odlišné, čepele A.esculenta jsou silnější ve srovnání s dalšími dvěma druhy. UI. lactuca, rostoucí hlavně v intertidalu a sublitorálu, je schopna fotosyntetizovat a růst při velmi nízkém ozáření. Bylo uvedeno, že expozice UVB světlu urychluje obnovu fotosyntetických parametrů U. lactuca z negativních účinků UVA světla. Je menší, má jednodušší strukturu a má kratší životnost (3 měsíce) než A.esculenta (5-7 let) a P. palmata, která má každý rok nový růst.
V souhrnu lze vyvodit předpoklady, že hlavní rozdíly ve vlastnostech extraktů jsou rozdíly v délce života, morfologických charakteristikách a podmínkách růstu druhů řas.
3. Materiály a metody
3.1. Materiály
Islandské mořské řasy U.lactuca (zelené řasy), A.esculenta (hnědé řasy) a P. palmitate (červené řasy) poskytly islandské modré mušle a mořské řasy, které sklízely mořské řasy v Breidafjordur (západní Island). Po sklizni mořské řasy byly vysušeny (na přibližně 90 procent suchého materiálu), rozemlety a dodány vakuově zabalené. Vzorky byly až do použití uchovávány na suchém a tmavém místě při teplotě místnosti.
Tyrosináza z hub, L-3,4-dihydroxyfenylalanin (L-DOPA), elastáza z prasečí slinivky, kyselina askorbová, N-sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (AAPVN), hyaluronidáza z bovinní varlata, kvercetin, a-tokoferol, kyselina tříslová,2,2-difenyl-1-pikrylhydrazyl(DPPH),2,4,6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ), Trolox, Folin- Ciocalteuovo činidlo, kyselina gallová a souprava pro kolorimetrický test aktivity kolagenázy (MAK293) byly zakoupeny od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Sodná sůl kyseliny hyaluronové byla zakoupena od MakingCosmetics (Redmond, WA, USA). Všechny ostatní použité chemikálie a činidla byly analytické čistoty a byly získány od VWR International, LLC. Pro extrakci a přípravu roztoků na vodní bázi byla použita deionizovaná voda (Elix Essential, Merck, Darmstadt, Německo).
3.2. Experimentální návrh
Pro hodnocení účinků islandských druhů mořských řas (U. Lactuca, A. esculenta, P. palmitate) a extrakčního ošetření (extrakce horkou vodou (HW, 95 stupňů), extrakce za pomoci PEF (PEF) a kombinace byl použit faktoriální design). obou technik (PEF plus HW), na složení extraktu a biologickou aktivitu (tabulka 6) Extrakce byla provedena trojmo pro každou skupinu a každý replikát extraktu byl analyzován trojmo.
bioflavonoid
3.3. Extrakce bioaktivních látek z islandských mořských řas
Využití biomasy makrořas na různých úrovních motivovalo vědce, aby prozkoumali ekologičtější, účinnější a nákladově efektivnější techniky extrakce založené na přístupech zelené extrakce. V této práci byla extrakce za pomoci PEF hodnocena jako nová a zelená metoda k výrobě funkčních extraktů, zatímco pro srovnání byla použita tradiční extrakce horkou vodou. Kromě toho byl studován vliv kombinace obou technik, PEF ošetření makrořas s následnou tradiční extrakcí horkou vodou, na bioaktivní obnovu. Vzhledem k očekávané elektroporaci produkované v buněčných membránách po fyzikálním ošetření by následující extrakce horkou vodou mohla dále usnadnit uvolňování intracelulárního materiálu [86] a zvětšit extrakční pole. Po ošetření je potřeba určitý čas, aby materiály difundovaly z buněk [87,88] a v tomto experimentu suspenze čekaly přes noc, dokud se kapalina (extrakt) neoddělila od buničiny.
Co se týče extrakčního média, k výrobě extraktů z mořských řas byla použita destilovaná voda, aby se překonala omezení týkající se použití toxických látek a organických rozpouštědel. Voda se ukázala jako dobré rozpouštědlo pro extrakci několika bioaktivních sloučenin z mořských řas [46,89-91] a je šetrná k životnímu prostředí. Kromě toho se voda běžně používá pro extrakci za pomoci PEF, protože je dobrým vodičem elektřiny.
3.3.1. Extrakční postupy
Pro každý replikát v každé skupině byly mořské řasy (15 g) namočené přes noc při teplotě místnosti (22 stupňů) v deionizované vodě (300 ml). Poté byla suspenze ošetřena PEF (PEF), zahřívána (HW) nebo obojím způsobem ošetřena PEF a zahřívána (PEF plus HW). Suspenze byly uchovávány přes noc v chladničce, následovala filtrace přes hrubý (20 um) filtrační papír. Poté byly filtráty (extrakty) skladovány při 4 stupních až do jejich analýz.
Extrakce za pomoci pulzního elektrického pole byla provedena pomocí vlastního pulzního generátoru. Měla kondenzátor FuGHCK-200-2000 (Fu.G.Elektronik GmbH, Rosenheim, Německo) a jiskřiště (18,5 kV OG75, Perkin-Elmer Optoelectronics, GMBH, Wiese-baden, Německo). Zařízení PEF generovalo exponenciální rozpadové pulsy o šířce 0,96 us a amplitudě 18 kV. K ošetření suspenzí elektrickým polem 8 kV/cm při 1,2 Hz po dobu 10 minut byla použita ošetřovací komora z plexiskla o rozměrech (D×V׊) 20×8×2,5 cm, přičemž nejkratší vzdálenost mezi deskovými elektrodami byla. . HW extrakty byly připraveny zahříváním suspenze v kádince v termostatické vodní lázni a udržovány při 95 stupních po dobu 45 minut. Pro kombinované ošetření pulzním elektrickým polem a ohřevem byly suspenze ošetřeny PEF a poté umístěny do kádinky, zahřáté ve vodní lázni a udržovány při 95 stupních po dobu 45 minut.
3.3.2. Měření vodivosti, pH a teploty
Elektrická vodivost a pH suspenzí mořských řas byly měřeny po namáčení a po extrakčním ošetření při pokojové teplotě pomocí pH metru (Orion StarTM A215 pH/Conductivity Benchtop Meter, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) vybaveného senzorem vodivosti a pH/ARC triodová kombinovaná elektroda. Dále byly zaznamenány teplotní změny v důsledku ošetření.
3.4. Spektrální profily extraktů z mořských řas
UV-VIS absorpční spektra různých extraktů z mořských řas byla měřena v rozsahu 200 až 450 nm pomocí dvoupaprskového spektrofotometru Thermo Scientific Evolution 350 UV-Vis (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) s 1 cm křemennými kyvetami. Pro každý extrakt z mořských řas byly provedeny tři skeny.
3.5. Stanovení celkového obsahu polyfenolů
Celkový obsah fenolů (TPC) v extraktech z mořských řas byl stanoven pomocí Folin-Ciocalteuova činidla podle mírně upravené metody popsané Zhangem [92] s použitím spektrofotometru Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA). 20 μl extraktu z mořských řas nebo sériového standardního roztoku bylo smícháno se 100 μl Folin-Ciocalteuova činidla （10 procent v destilované vodě）. Po 5 minutách bylo přidáno 80 μl 7,5% (/w) roztoku uhličitanu sodného. inkubováno při pokojové teplotě a tmě po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena při vlnové délce 760 nm. Jako slepý pokus byla použita destilovaná voda. Ke stanovení celkového obsahu fenolů byla použita standardní křivka kyseliny gallové a vyjádřena jako ug ekvivalentů kyseliny gallové（ GAE) na gram suchého materiálu (ug GAE/g do).
3.6. Stanovení celkového obsahu flavonoidů
Celkový obsah flavonoidů (TFC) v extraktech z mořských řas byl stanoven metodou popsanou Kamtekarem 【93】 a upraven pro 96-jamkové mikrodestičky. Stručně, objem 25 μl extraktu z mořských řas nebo sériového standardního roztoku byl smíchán s 100 μl dusitanu sodného （0,375 procent w/o）. Po 5 minutách bylo ke směsi přidáno 25 μL chloridu hlinitého (3 procenta w/o) a směs byla inkubována po dobu 6 minut při teplotě místnosti. Poté bylo ke směsi přidáno 100 μl hydroxidu sodného （2 procenta w/ø） a promícháno. Okamžitě byla změřena absorbance při vlnové délce 510 nm. Jako slepé vzorky byla použita destilovaná voda a ethanol. Standardní křivka kvercetinu (rozpuštěného v ethanolu) byla použita ke stanovení celkového obsahu fenolů a vyjádřena jako ug ekvivalentů kvercetinu (QE) na gram sušiny (ug QE/g do). 3.7. Stanovení obsahu sacharidů
Obsah volného cukru byl měřen podle metody popsané v [94] s mírnými úpravami. 50 μl roztoku fenolu (4 procenta) a 250 μl kyseliny sírové (96 procent) bylo přidáno do 100 μl roztoku vzorku nebo standardního roztoku. Po 10 minutách inkubace při teplotě místnosti byla odečtena absorbance směsi při 490 nm. Ke stanovení celkového obsahu sacharidů byla použita standardní křivka glukózy a vyjádřena jako mg ekvivalentů glukózy (GluE) na gram sušiny (mg GluE/g do).
3.8. Antioxidační vlastnosti extraktů z mořských řas
3.8.1.2,2 Difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) test zachycování volných radikálů
Antioxidační aktivita (DPPH) extraktů z mořských řas byla stanovena podle dříve popsané metodiky 【94】 s určitými úpravami. Stručně, 200 ul 10,825 x 10-5 M roztoku DPPH bylo přidáno ke 100 ul vzorku (1:1 v methanolu) v 96-jamkové destičce. Stejný objem DPPH byl smíchán s 50 μl standardu plus 50 μl methanolu. Poté byly vzorky a standard inkubovány na tmavém místě při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Absorbance byla měřena při vlnové délce 517 nm. Jako slepý vzorek byla použita destilovaná voda. Schopnost vychytávat radikál DPPH byla vypočtena pomocí následující rovnice: kde kontrola je absorbance kontroly (roztok DPH bez vzorku), vzorek A je absorbance testovaného vzorku (roztok DPPH plus testovaný vzorek) a A vzorek blank je absorbance pouze vzorku (vzorek bez roztoku DPPH) a Amethanol blank je absorbance pouze methanolu. Komerční antioxidanty (kyselina askorbová, kyselina gallová a -tokoferol) byly použity jako pozitivní kontroly.
3.8.2. Zkouška na snížení antioxidační síly železitých iontů (FRAP).
Aktivita FRAP byla měřena podle metody Benzieho a Straina [95]. Stručně, acetátový pufr (300 mM, pH 3,6), 2,4, 6-tripyridyl-s-triazin (TPTZ) 10 mM ve 40 mMHCI a FeCI; 6H-O (20 mM) byly smíchány v poměru 10:1, aby se získalo pracovní FRAP činidlo. Reakční směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 10 minut. 50 μl vzorku z každého extraktu bylo smícháno se 150 μl pracovního roztoku FRAP po dobu 8 minut při pokojové teplotě. Absorbance barevného produktu Ferrous-TPTZ byla měřena při vlnové délce 593 nm. Hodnoty FRAP extraktů z mořských řas byly vyjádřeny jako uM ekvivalentů Trolox (TE) na gram suchého materiálu.
3.8.3.2,2 Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonová kyselina)(ABTS)
Analýza byla provedena pomocí odbarvovacího protokolu ABTS [76] s některými úpravami. Radikálový kationt ABTS (ABTS plus) byl vyroben reakcí ABTS (66 mg) s 1 0 ml roztoku persíranu draselného (2,45 mM). Směs byla ponechána ve tmě při pokojové teplotě po dobu 12-16 h před použitím. Roztok ABTS plus byl zředěn vodou na absorbanci 0,700 při 734 nm. Reakční směs (200 ul) byla přenesena na mikrodestičku, bylo přidáno 50 μl vzorku a poté 150 μl roztoku činidla. Destička byla třepána po dobu 10 s při střední rychlosti a absorbance byla měřena při 734 nm po 5 minutách inkubace při teplotě místnosti. Standardní křivka byla připravena vynesením inhibice A734nm standardů Trolox jako funkce jejich koncentrací. Hodnota ekvivalentní antioxidační kapacity Trolox (TEAC) vzorků byla vypočtena pomocí rovnice získané z lineární regrese standardní křivky nahrazující hodnoty A734nm pro každý vzorek:
3.9. Antienzymatické aktivity extraktů z mořských řas
3.9.1. Test inhibice kolagenázy
Ke stanovení inhibice kolagenázy v extraktech z mořských řas byla použita sada pro kolorimetrický test aktivity kolagenázy (MAK293), zakoupená od Sigma-Aldrich. Souprava měřila aktivitu kolagenázy pomocí syntetického peptidu (FALGPA), který napodobuje strukturu kolagenu. Postup byl proveden podle návodu kitu.
3.9.2. Test inhibice elastázy
Inhibice elastázy v extraktech z mořských řas byla zkoumána v roztoku pufru TRIS s modifikovanou metodou, jak bylo popsáno dříve 【96】. Stručně řečeno, 100 μl 0,1 M roztoku TRISpufru （pH 8,0）, 25 μl elastázy）1 U/ml v TRIS pufru）a 25μL extraktů vzorků byly smíchány a inkubovány po dobu 15 minut při 30 C před přidáním substrátu pro zahájení reakce. Po inkubační době bylo přidáno 50 ul 2 mM roztoku AAAPVN. Poté byla absorbance při 420 nm monitorována po dobu 20 minut pomocí čtečky mikrodestiček při konstantní teplotě 30 C. Nakonec byla inhibice elastázy vypočtena v procentech pomocí rovnice: kde Abs kontrola je absorbance testu s použitím pufru namísto inhibitor (vzorek) a Absmpleje absorbance extraktů vzorku. Kvercetin byl použit jako pozitivní kontrola. Tris pufr byl použit jako slepý pokus.
3.9.3. Test inhibice tyrosinázy
Test inhibice tyrosinázy byl proveden podle metody dříve popsané v 【66】 s použitím L-DOPA jako substrátu. 20 μl vzorku, 10 μl roztoku houbové tyrosinázy （50 U/ml ve fosfátovém pufru） a 80 μl fosfátového pufru （pH=6,8） bylo smícháno na mikrotitrační destičce a preinkubováno při 37 °C 5 minut. Poté bylo přidáno 90 ul L-DOPA (2 mg/ml). Tvorba dopacromu byla okamžitě monitorována po dobu 20 minut při 475 nm ve čtečce mikrodestiček při konstantní teplotě 37 stupňů. Procento inhibice enzymu tyrosinázy bylo vypočteno pomocí rovnice: kde Abs kontrola je absorbance testu s použitím pufru místo inhibitoru (vzorku) a vzorek je absorbance extraktů vzorku. Kvercetin byl použit jako pozitivní kontrola. Fosfátový pufr byl použit jako slepý pokus.
3.9.4. Hyaluronidázový inhibiční test
Hyaluronidázová inhibiční aktivita byla měřena, jak bylo dříve popsáno v [66] s několika modifikacemi. Objem 100 ulof typu-1-hyaluronidáza bovinních varlat（2100 U/ml）rozpuštěný v 0,1 M acetátový pufr （pH 3,5） byl smíchán se 100 μl extraktu a inkubován při 37 stupních po dobu 20 minut. K reakční směsi byl přidán objem 200 ul 6mM chloridu vápenatého a poté byla směs inkubována při 37 °C po dobu 20 minut. Tato Ca2 plus aktivovaná hyaluronidáza byla ošetřena 250 ul hyaluronátu sodného (1,2 mg/ml) rozpuštěného v 0,1 M acetátovém pufru (pH 3,5) a poté inkubována ve vodní lázni při 37 stupních po dobu 40 minut. K reakční směsi bylo přidáno 50 ul 0,9 M hydroxidu sodného a 100 ul 0,2 M boritanu sodného a poté inkubováno ve vroucí vodní lázni po dobu 5 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti bylo k reakční směsi přidáno 250 ul roztoku p-dimethylaminobenzaldehydu (DAMB). Roztok DAMB byl připraven rozpuštěním 0,25 g DAMB ve 21,88 ml 100% kyseliny octové a 3,12 ml 10N kyseliny chlorovodíkové. Kontrolní skupina byla ošetřena 100 μl 5% vody místo extraktu. Absorbance byla měřena při vlnové délce 585 nm po 45 minutách. Procento inhibice enzymu bylo vypočteno pomocí následující rovnice: kde Abs kontrola je absorbance testu s použitím pufru místo inhibitoru (vzorku) a Abs vzorek je absorbance extraktů vzorku. Kyselina tříslová se používá jako referenční standard.
3.10 Statistická analýza
Byl vypočten průměr trojité analýzy každého extraktu a použit k nalezení středních hodnot a standardních odchylek pro každou skupinu (n=3). K vyhodnocení hlavních účinků a obousměrných interakcí experimentálních faktorů (druhové a extrakční metody) na měřené proměnné byly použity obecné lineární modely (GLM) pro fixní faktory. Dále byly k identifikaci signifikantních použity ANOVA a Tukey-Kramerův test (str<0.05)differences between="" the="" groups.="" pearson="" correlation="" was="" used="" to="" evaluate="" linear="" relationships="" between="" the="" variables.="" principal="" component="" analysis="" (pca)="" was="" used="" to="" detect="" structure="" in="" the="" relationship="" between="" measured="" variables="" and="" experimental="" factors.="" the="" pca="" reduces="" voluminous="" data="" to="" a="" small="" set="" of="" linear="" combinations="" of="" related="" variables(i.e.,="" factors)="" based="" on="" patterns="" of="" correlation="" among="" the="" original="" variables.="" the="" resulting="" linear="" attribute="" combinations="" can="" be="" used="" for="" profiling="" specific="" product="" characteristics="" based="" on="" the="" variables="" studied.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" ncss="" 2020="" statistical="" software="" (2020)="" (ncss,="" llc.,="" kaysville,="" ut,="">
4. závěr
Výsledky tohoto prvního screeningového experimentu ukázaly potenciál tří islandských druhů mořských řas poskytováním účinných příznivých účinků několika cestami. Zelený přístup vyvinutý pomocí vodných pulzních elektrických polí vykazoval podobné výsledky jako tradiční extrakce horkou vodou a ukázal několik výhod, jako je jeho netepelná povaha a kratší doba extrakce (10 min vs. 45 min). Mezi třemi druhy řas vykazovala hnědá makrořasa A.esculenta nejvyšší obsah TPC a TFC, která také vykazovala největší antioxidační schopnosti Navíc vodní extrakty A.esculenta vykazovaly lepší inhibiční aktivity než P. palmaria a U. Lactuca vůči kolagenáze, elastáze, tyrosináza a hyaluronidáza jsou nejslibnějším druhem mořských řas s vynikajícími antienzymatickými aktivitami pro jejich použití při bělení pokožky, proti stárnutí a zdraví pokožky. Je zajímavé, že extrakty A.esculenta vyrobené metodou PEF vykazovaly inhibici kolagenázy 91 procent, vyšší než inhibiční aktivita vykazovaná tradiční extrakcí horkou vodou a dokonce vyšší než inhibitor poskytovaný komerční soupravou. Závěrem, naše předběžná studie naznačuje, že extrakty na bázi islandských mořských řas, zejména extrakty z hnědé makrořasy A. esculenta, produkované vodnou extrakcí za pomoci pulzního elektrického pole, jsou potenciálními funkčními složkami, které by mohly být použity jako aktivní sloučeniny pro kosmetické a kosmetické přípravky. v blízké budoucnosti.
Tento článek je převzat z Mar. Drugs 2021, 19, 662. https://doi.org/10.3390/md19120662 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs
