Experimentální studie o ochranném účinku celkových glykosidů Cistanche (CTG) na ischemické reperfuzní poškození ledvin
Mar 09, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
ZHU Jun, ZHAO Xi
Abstraktní:Cíl Vytvořit potkaní model hemoragického šoku a resuscitace tak, aby bylo možné pozorovat ochranný účinekcistanche celkové glykosidy(CTG)na ledvinovéischemicko-reperfuzní poškození. Metody SD krysy byly náhodně rozděleny do falešné operační skupiny, šokové a resuscitační skupiny (experimentální skupina) a CTG skupiny, v každé bylo 10 krys. Po modelování dostali potkani ve skupině CTG intraperitoneální injekci CTG 400 mg/kg. V experimentální skupině a skupině s falešnou operací byl injikován fyzikální fyziologický roztok 3 ml. Pro detekci funkce ledvin v každé skupině byly stanoveny hladiny Cr, BUN a Cys – C. Průtoková cytometrie byla použita k detekci rychlosti apoptózy renálních buněk. ELISA byla použita k detekci exprese XIAP v ledvinové tkáni. Výsledky Ve srovnání s experimentální skupinou byly hladiny Cr, BUN a Cys – C zjevně sníženy vCTGskupina (P ＜ {{0}}.01) a apoptóza renálních buněk byla snížena (P ＜ 0,01). CTG významně zlepšilo expresi XIAP (P<0.05). conclusion="">CTGpřináší ochranný účinekischemická reperfuzepoškození ledvin u potkanů, které pravděpodobně souvisí s podporou exprese XIAP.
【Klíčová slova】 Ledviny; ischemické reperfuzní poranění; celkové glykosidy Cistanche; XIAP; Buněčná apoptóza
Ischemicko-reperfuzní (I/R) poškozeníje běžným patofyziologickým jevem poškození ledvin v procesu hemoragického šoku, těžkého traumatu, transplantace ledviny a operaci nádoru ledvin. Studie ukázaly, že apoptóza je důležitým článkem v poškození funkce ledvin způsobené I/R poraněním [1]. X-chromozomově vázaný inhibitor proteinu apoptózy (XIAP) je jedním z nejsilnějších dosud nalezených endogenních inhibitorů apoptózy [2]. Existuje jen málo studií o antiapoptotickém účinku XIAP v renální tkáni po poranění I/R.Celkové glykosidy Cistanche(CTG) jsou ze seznamu fenylethanolových glykosidových sloučenin extrahovaných zCistanchemají různé biologické funkce. Existuje jen málo studií o jeho renální ochraně po I/R poranění. V tomto experimentu byl založen krysí model resuscitace hemoragického šoku a byl vytvořen model systémového I/R poranění, aby se prozkoumal ochranný účinek CTG předléčení na ledvinu před I/R poraněním a prozkoumal se jeho možný mechanismus.
Účinky cistanche: zabránitIschemicko-reperfuzní (I/R) poškození
1 Materiál a metody
1.1 Experimentální materiály
1.1.1 Laboratorní zvířata 30 zdravých samců SD potkanů čistého stupně, poskytnutých Experimentálním centrem Šanghajské univerzity tradiční čínské medicíny, číslo zvířecího certifikátu: SYXK (Shanghai) 2009-0069, tělesná hmotnost (320 ± 30) g.
1.1.2 Experimentální činidloCTG(zakoupeno od Zhejiang Hangzhou Xinghui Tianli Pharmaceutical Co., Ltd., číslo šarže: 20081516); pentobarbital sodný (číslo šarže: P3761), propidium jodid (PI), Rhodamin123 (oba zakoupené (od Sigma, USA); Kit pro stanovení potkaního XIAP ELISA Kit (zakoupen od Shanghai Kemin Biotechnology Co., Ltd., číslo šarže CSB-ELO26172MO) .
1.1.3 Laboratorní přístroj Čtečka mikrodestiček (American Thermo Company); Víceparametrový fyziologický detektor (zakoupen od NIHON KOHDEN Company, Japonsko); průtokový cytometr (zakoupen od Becton-Dickinson Company, USA); 24 G trokar (Shandong Jierui Medical Equipment Company).
1.2 Experimentální metody
1.2.1 Příprava zvířecího modelu SD potkani byli nalačno 12 hodin před experimentem a anestetizováni intraperitoneální injekcí pentobarbitalu sodného (50 mg/kg). Krysy byly fixovány v poloze na zádech a byl proveden 3 cm řez v levém podbřišku a oddělen. Do a. femoralis se zavede trokar 24 G, připojí se multiparametrový fyziologický tester, heparinizuje se 20ml injekční stříkačka a krevní tlak klesne na 40 mm Hg. Krevní tlak klesne na 40 mm Hg. Má se za to, že šok začal a krevní tlak je udržován po dobu 90 minut. Je to (13 ± 3) ml a poté se pomalu vrací autologní krev ve stříkačce. Obnovení krevního tlaku na více než 90 procent základní hodnoty trvá asi 30 minut. Má se za to, že resuscitace je úspěšná [3]. Vytáhněte jehlu trokaru, podvázejte femorální tepnu a zašijte řez. Poté, co se krysy probudily, byly vráceny do klece k pozorování a měly volný přístup k potravě a vodě. 24 hodin po resuscitaci byly krysy anestetizovány pentobarbitalem sodným (50 mg/kg) intraperitoneální injekcí, laparotomií a bylo jim odebráno 5 ml krve z dolní duté žíly. Krysy byly okamžitě usmrceny a levá a pravá ledvina byly odebrány pro použití.
1.2.2 Seskupování zvířat a podávání 30 krys bylo náhodně rozděleno do skupiny s předstíraným chirurgickým zákrokem, skupiny s šokovou resuscitací (experimentální skupina) a CTG skupiny, s 10 krysami v každé skupině.
Experimentální skupině byly intraperitoneálně injikovány 3 ml normálního fyziologického roztoku 2 hodiny před odběrem krve. VCTGskupině bylo CTG podáno 2 hodiny před odběrem krve krysám a dávka byla injikována do břišní dutiny v dávce 400 mg/kg. Skupina s falešnou operací podstoupila pouze anestezii, laparotomii a separaci umístění trokaru femorální arterie a řezy suturou atd., prokrvení a resuscitace nebyly prováděny a zbytek byl stejný jako u experimentální skupiny.
1.3 Ukazatele a metody testování
1.3.1 Stanovení krevního kreatininu (Cr), močovinového dusíku (BUN), cystatinu C Cr, BUN a cystatinu C stanovuje laboratoř naší nemocnice. Cystatin C je endogenním markerem změn rychlosti glomerulární filtrace. Při poruše funkce ledvin se rychlost glomerulární filtrace snižuje a koncentrace cystatinu C v krvi se může zvýšit více než 10krát. Diagnostická přesnost cystatinu C je výrazně lepší než u sérového kreatininu.
1.3.2 Stanovení rychlosti apoptózy buněk K detekci rychlosti apoptózy ledvinových buněk byla použita průtoková cytometrie. Vezměte ledvinu a nasekejte ji ostřím, přidejte trochu PBS a přeneste do zkumavky. Přidejte 0,3 procenta trypsinu pro trávení ve 37stupňové vodní lázni a inkubujte 20 min. Když se látka ve zkumavce zakalí, přidejte dvakrát PBS, abyste zastavili štěpení, přefiltrujte přes nylonovou síťku 300 mesh, odstraňte nečistoty a použijte nízkoteplotní odstředivku Centrifugu při 1500 g/s pro 5 minut, odstraňte supernatant, upravte koncentraci buněk na 1 × 106 ~ 1,5 × 106 / ml, odeberte 0,4 ml výše uvedené buněčné suspenze a přidejte 10 ul / ml Rhodamin123 0 ．4 ml, inkubujte v 37° vodní lázeň chráněná před světlem, zkumavku uzavřete, po 30 minutách dvakrát opláchněte PBS, poté odstřeďujte při 1500 g/s po dobu 5 minut, odstraňte supernatant a znovu opláchněte stejným způsobem. Přidá se PI 0,4 ml, barví se 15 minut a zkontroluje se procento normálních, nekrotických a apoptotických buněk v ledvině. Podle afinity těchto dvou barviv v různých typech buněk je známo, že pouze PI zbarvené buňky jsou mrtvé buňky, pouze Rhodamin123 barevné buňky jsou živé buňky a obě barevné buňky jsou apoptotické buňky.
1.3.3 Enzyme-linked immunoassay (ELISA) byl použit k detekci exprese XI-AP v tkáních potkaních ledvin. Z každé skupiny byly odebrány ledviny a čerstvé ledvinové tkáně byly ošetřeny tkáňovým lyzátem. Centrifugujte při 1500 g/s v nízkoteplotní odstředivce po dobu 5 minut. Odeberte supernatant a postupujte podle pokynů soupravy XI-AP ELISA Kit. Za testování odpovídá Shanghai Jiaoda Fenghe Technology Co., Ltd.
1.4 Statistické zpracování
Všechna data byla statisticky analyzována pomocí softwaru SPSS17.0 a data byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (x ± s) a P<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">
cistanche celkové glykosidy
2 výsledky
2.1 Funkční indexy ledvin Cr, BUN, Cystatin C Srovnání Cr, BUN, cystatinu C v experimentální skupině byly významně vyšší než ve skupině s falešnou operací (P<0.01), indicating="" that="" the="" rat="" kidney="" i/r="" model="" was="" prepared="">
Ve srovnání s experimentální skupinou byly hodnoty Cr, BUN a cystatinu CCTGskupině byly významně sníženy a rozdíl byl statisticky významný (P<0.01). the="" results="" are="" shown="" in="" table="">
Tabulka 1 Srovnání indexů renálních funkcí Cr, BUN a cystatinu C u potkanů v každé skupině (x ± s)
Poznámka: Ve srovnání se skupinou falešných operací je P＜{{0}}.01; ve srovnání s experimentální skupinou, bP <>
2.2 Rychlost apoptózy renálních buněk a exprese XIAP v renální tkáni. Pouze několik buněk v renální tkáni ze skupiny s falešnou operací podléhá apoptóze.
Počet apoptóz v experimentální skupině byl významně zvýšen a rozdíl byl statisticky významný ve srovnání se skupinou s falešnou operací (P<0.01); the="" number="" of="" apoptosis="" in="" the="" ctg="" group="" was="" decreased="" compared="" with="" the="" experimental="" group,="" and="" the="" difference="" was="" statistically="" significant="" (p=""><0.01)>
Skupina falešné operace měla pouze slabou expresi XIAP, zatímco experimentální skupina měla signifikantní zvýšení exprese XIAP (P<0.01). compared="" with="" the="" experimental="" group,="" the="" ctg="" group="" can="" significantly="" increase="" the="" expression="" of="" xiap=""><0.05). the="" results="" are="" shown="" in="" table="">
Tabulka 2 Srovnání rychlosti apoptózy a exprese XIAP ledvinových buněk potkana v každé skupině (x± s)
Poznámka: Ve srovnání se skupinou falešných operací aP＜{{0}}. 01; Ve srovnání s experimentální skupinou, b P＜0. 05, cP<0.>
3 Diskuse
Mechanismus I/R poškození ledvin je velmi komplikovaný. Jedná se o patologický proces, který probíhá mnoha cestami za působení různých faktorů, jako je přetížení vápníkovými ionty, poškození peroxidací lipidů, apoptóza a nekróza, mezi nimiž jsou endogenní kaspázy Kaspáza-dependentní apoptóza je jednou z hlavních forem renálního tubulárního epitelu. poškození buněk vyvolané I/R poškozením ledvin [4]. Inhibitor rodiny proteinů apoptózy (IAP) je jediným inhibitorem kaspázy, který se dosud v savčích buňkách nachází a který může účinně zabránit výskytu apoptózy. XIAP je nejsilnější inhibitor kaspázy z rodiny IAP, který může inhibovat buněčnou apoptózu způsobenou řadou patologických podnětů a má ochranný účinek na poškozené orgány [5].
V současnosti je metodou stanovení zvířecích modelů poškození ledvin I/R většinou odstranění jedné strany ledviny a sevření druhé strany ledvinového pediklu nebo renální tepny [6], aby se simuloval stav transplantace ledviny. Autor v této studii použil model hemoragického šoku/resuscitace, který je bližší patofyziologickému procesu systémové ischemie-reperfuze, ke které dochází u klinického traumatického šoku. V tomto experimentu se krevní BUN, Cr a cystatin SD potkanů významně zvýšilo množství C a renální funkce je vážně narušena. Je to ideální zvířecí model pro studium I/R poškození ledvin.
CTG je důležitou léčivou složkou tradiční čínské medicínyCistanche. Cistanche, který je svou povahou teplý, sladký i slaný, patří do meridiánu ledvin a tlustého střeva a byl původně obsažen v Shennongově Materia Medica. "Ben Jing," říká: "Udržuje pět porodů a sedm zranění, vyživuje střed, vyživuje pět vnitřních orgánů, posiluje jin a vyživuje esenci a čchi." Taky."Cistanchese v mé zemi používá již dva tisíce let. V minulosti se řadí na první místo ve složení zvyšujících sílu a na druhém místě za ženšenem ve výživných vzorcích.Cistancheumětzlepšit sexuální funkce, regulovat neuroendokrinní a zlepšit imunitní funkce těla. Antioxidanty, podporují látkovou výměnu, chrání ischemický myokard a další funkce. Jako hlavní léčivá složkaCistanche, CTG má mnoho funkcí. Výzkum cerebrálníchischemie-reperfuzeModelka
Studie to zjistilyCTGmůže redukovat excitační aminokyseliny v mozkové tkáni po ischemicko-reperfuzi a chránit mozkovou tkáň SD potkanů [7]. CTG má antioxidační účinek na tkáně myší a má určitý ochranný účinek na akutní mozkovou hypoxii u myší a poškození srdečního svalu u myší [8]. CTG může významně zlepšit neurobehavior parkinsonského modelu myší a inhibovat pokles počtu dopaminových neuronů v substantia nigra [9]. Zvýšením aktivity enzymů pohlcujících volné radikály, prevencí peroxidace lipidů, inhibicí ukládání -amyloidního peptidu v mozku a inhibicí apoptózy mozkových buněk CTG významně zvýšilo -amyloidním peptidem indukovanou Alzheimerovou chorobu u myší Schopnost učení a paměti [10]. Tato studie ukázala, že po aplikaci předléčby CTG se obsah BUN, Cr a cystatinu C v krvi u SD potkanů významně snížil a poškození renálních funkcí se snížilo. CTG zvýšilo apoptózu-inhibující protein XIAP v renálních tkáních I/R poškození a blokovalo buňky. Výskyt apoptózy hraje ochrannou roli při poškození ledvin.
Reference
[1] Cassis P, Azzollini N, Solini S, et al. Darbepoetin alfa i karbamylovaný erytropoetin zabraňují dysfunkci ledvinového štěpu v důsledku ischemie/reperfuze u potkanů ［J］］. Transplantace, 2011, 92 (3): 271-279.
[2] West T, Stump M, Lodygensky G, et al. Nedostatek X-vázaného inhibitoru proteinu apoptózy vede ke zvýšené apoptóze a ztrátě tkáně po novorozeneckém poranění mozku［J］］. ASN Neuro, 2009, 1 (1). PII: e00004. doi: 10. 10421AN20090005.
[3] Fu X, Tian H, Wang D, a kol. Mnohočetná poranění orgánů a selhání způsobená šokem a reperfuzí po střelných poraněních［J］［. J Trauma, 1996, 40 (3 Suppl): S135-139.
[4] Padanilam BJ. Buněčná smrt vyvolaná akutním poškozením ledvin: pohled na příspěvky apoptózy a nekrózy［J］］. Am J Physiol Renal Physiol, 2003, 284 (4): F608-F627.
[5] Galbán S, Hwang C, Rumble JM, et al. Cytoprotektivní účinky IAP odhalené antagonistou s malou molekulou［J］［. Biochem J, 2009, 417 (3): 765-771.
[6] Wu Jianguo, Zhang Dan, Wu Xinsheng atd., Zavedení a zkušenosti s modelem akutního ischemicko-reperfuzního poškození ledvin u myší [J]. Lékařské informace: Handbook of Surgery, 2007, 20 (12): 1103-1105.
[7] Zhu Zheng. Účinky glykosidů Cistanche na excitační aminokyseliny v mozkové tkáni potkanů po mozkové ischemii a reperfuzi [J]. Anhui Medicine, 2010, 14 (12): 1393 -1394.
[8] Julia Y, Wang XW, Wubuli AS a kol. Ochranný účinek celkových glykosidů cistanche deserticola na nedostatek kyslíku ［J］］. Rep Chin Pharm, 2003, 20 (1): 73-76.
[9] Li Wenwei, Yang Ru, Cai Dongfang a kol. Ochranný účinek celkových glykosidů cistanche na dopaminergní neurony v substantia nigra myší s modelem MPTP Parkinsonovy choroby
[10] Liu Fengxia, Wang Xiaowen, Luo Lan atd. Účinek a mechanismus celkových glykosidů cistanche na učení a paměť myšího modelu Alzheimerovy choroby indukované -amyloidním peptidem [J]. Chinese Pharmacology Bulletin, 2006, 22 (5): 595-599.
