Experimentální studie mechanismů proti sportovní únavě Biect Cistanche Deserticola
Mar 09, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
YANG Hong-Xin, YANG Yong², YAN Xiao-hong'
Abstraktní:Cíl Studovat účinekcistanche deserticolana laktátdehydrogenázu (LDH) isoenzym, glykogen a oxid dusnatý syntázu 3 (NOS3) jater u myší při zátěži plaváním a prozkoumat relevantní molekulární mechanismyantisportovní únava. Metoda Myši byly rozděleny do normální kontrolní skupiny, sportovní kontrolní skupiny acistanche deserticolaexperimentální skupina. Každé myši z normální kontrolní skupiny a sportovní kontrolní skupiny byl podáván fyziologický roztok 0,2 ml denně. Každá myš z experimentální skupiny cistanche deserticola dostala odvar z vodycistanche deserticola0,2 ml (3 g/kg za den. Podání bylo po dobu 15 dnů. Zátěžové plavání po dobu 90 minut bylo prováděno na myších ze sportovní kontrolní skupiny acistanche deserticolaexperimentální skupině 1 hodinu po posledním podání. Po 10 hodinách plavání byla myším odebrána játra. Jedna část jater byla fixována v neutrálním formalínu pro přípravu parafinových řezů a ostatní byly použity pro měření aktivity LDH. Struktura jater byla pozorována barvením HE a jaterní glykogen byl měřen barvením glykogenu. NOS3 byl vyšetřen imunohistochemickou metodou SP. Rei Struktura jater sportovní kontrolní skupiny byla vážně zraněna, izoenzymy LDH4 a LDH5 byly vyšší, jaterní glykogen byl slabý, NOS3 byl snížen ve srovnání s normální kontrolní skupinou (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group=""><0.05). conclusion:="">Cistanche deserticolamohl snížit LDH5, chránit játra při zátěži myší při plavání a urychlit akumulaci glykogenu zvýšením exprese NOS3 k ochraně jater a zlepšení obnovy fyzické kapacity.
Klíčová slova; cistanche deserticola;jaterní glykogen; oxid dusnatý syntáza 3; myši
Cistanche, také známý jako Dayun, je dvouletá parazitická bylina z čeledi Lydanaceae. Má suché dužnaté stonky se šupinami. Vyrábí se hlavně na písčitých půdách a polopísčitých pastvinách ve Vnitřním Mongolsku, Gansu, Xinjiang a Qinghai.Cistancheve Vnitřním Mongolsku má nejlepší kvalitu mezi produkčními oblastmi.Cistancheje sladké, slané a teplé povahy. Vstupuje do meridiánu ledvin a tlustého střeva. Jeho hlavní funkcí je povzbudit ledviny a posílit jang, vyživit esenci a krev a vyživit střeva. Často se používá k léčbě impotence, neplodnosti, slabosti v pase a kolenou, slabosti svalů a kostí, suchých střev a zácpy. . Účelem této studie je pozorovat účinkyCistanchena jaterní laktátdehydrogenázu (LDH), jaterní glykogen a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) u zátěžových plaveckých myší prostřednictvím zátěžového plaveckého testu na myších a prozkoumání jejího ochranného mechanismu na játrech. Poskytněte teoretický základ pro hloubkový výzkum, vývoj a využitíCistancheve sportovní zdravé výživě.
1 Experimentální materiál
1.1 Zvířata 3 0 samci krys Kunming, čistý stupeň, hmotnost (20±0,5) g, poskytnuto Animal Center of Inner Mongolia University.
1.2 Medicine Cistanche (Cistanche deserticolaYC Ma) se vyrábí v Ejina Banner ve Vnitřním Mongolsku a byl identifikován. Podle původního léčivého materiálu: voda=100g: 400 ml, namočte 30 minut, zahřejte a povařte, poté 30 minut vařte na teplém ohni, vylijte léčivý roztok a znovu ozdobte v poměru 100 g: 200 ml. Oba odvary smícháme, přefiltrujeme dvěma vrstvami gázy a poté zahustíme na ekvivalent 1 g původních léčivých látek na mililitr původního odvaru a uchováme v chladničce při 4 stupních. 1.3 Činidla a přístroje Polyklonální protilátka NOS3 byla zakoupena od Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Souprava SP byla zakoupena od Fujian Maixin Reagent Company. Souprava isoenzymu laktátdehydrogenázy byla zakoupena od Inner Mongolia Tongri Reagent Co., Ltd (zcela vlastněná Nissanem). Analyzátor barevných obrázků Nanjing JD{12}}. Americký systém UVP gelové analýzy obrazu.
2. Experimentální metody
2.1 Seskupování a podávání Myši Kunming byly náhodně rozděleny do normální kontrolní skupiny, kontrolní skupiny při cvičení aCistancheexperimentální skupina, každá s 10 myší. Normální kontrolní skupině a zátěžové kontrolní skupině byl podáván fyziologický roztok jednou denně, 0,2 ml/čas; aCistancheexperimentální skupině byl podáván odvar z cistanche (vezměte 3 ml původního vodného odvaru a přidejte vodu na 10 ml), jednou denně, 0 ．2ml/čas, denní dávka 3g/kg, nepřetržité podávání po dobu 15 dnů. Jednu hodinu po posledním podání byly myši v kontrolní skupině cvičení a v experimentální skupině Cistanche naloženy 1g olověným závažím na ocas a byly umístěny do bazénu o výšce 50 cm, délce 50 cm a šířka 35 cm na plavání. Teplota byla udržována na (30±0,5) stupni a udržována konstantní. Pozorujte myš, pokud zjistíte, že myš přestane plavat, pomocí dřevěné tyče stimulujte její pohyb po dobu 90 minut. Po cvičení jíst běžnou stravu, 10 hodin odpočívat a společně s normálními kontrolními myšmi usmrtit myši metodou dekrku, vyjmout játra, část zafixovat 10% neutrálním formaldehydem, dehydratovat, zprůhlednit, namočit do vosku , a vložit tak, aby vznikly 4 silné souvislé řezy, pomocí metody barvení HF pozorovat strukturu jaterní tkáně každé skupiny: druhá část byla promyta normálním fyziologickým roztokem, zmražena na 20 stupňů, rozmražena při pokojové teplotě během měření, vysušena filtračním papírem a zváží se a pak se připraví jaterní homogenát s normálním fyziologickým roztokem, 3500r centrifuguje 15 min při/min a supernatant se odebere k měření aktivity izoenzymu laktátdehydrogenázy elektroforézou.
2.2 Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy Pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu jsou izoenzymy LDH separovány podle jejich rozdílů v elektroforetické pohyblivosti. Koncentrace separačního gelu ve vzorku je 7 procent, pH 8,9, a koncentrace koncentrovaného gelu je 4 procenta, pH 6,8,10. Vzorek se smíchá s 1 kapkou glycerinu a indikátoru bromfenolové modři. Elektrodový pufr je Tris-Glycin (pH 8,7), začněte stabilizovat tlak na 1o0-150V, přidejte jej na 2o0-250V po 30 minutách a provádějte elektroforézu po dobu 4 hodin. Po elektroforéze byl obarven soupravou Lactate Dehydrogenase Isoenzyme Kit, barven při 37 stupních po dobu 30 minut, což ukazuje na modrý pruh izoenzymu laktát dehydrogenázy, poté opláchnut vodou, fixován ledovou kyselinou octovou a použit systém pro analýzu obrazu gelu UVP Provést analýzu dat .
Barvení 2,3 glykogenem Sériové řezy o tloušťce 4 um jsou konvenčně zbaveny parafinu ve vodě, vloženy do 1% roztoku kyseliny jodisté při 37 stupních po dobu 15 minut, opláchnuty tekoucí vodou, vloženy do Schiffova roztoku na 60 minut, opláchnuty tekoucí vodou, dehydratovány gradientem ethanol, xylen je transparentní, neutrální Nalepte sklíčka s gumou a pozorujte výsledky barvení pod mikroskopem.
2.4 Sekce imunohistochemického barvení byla rutinně deparafinizována na vodu a antigen byl opraven mikrovlnným pufrem s kyselinou citrónovou a endogenní peroxidáza byla odstraněna kapalinou A po dobu 10 minut a poté blokována kapalinou B (zředěné kozí sérum) po dobu 10 minut. Přidejte primární protilátku přes noc při 4 stupních ve vlhkém boxu, promyjte roztokem PBS s pH 7,4 po dobu 5 minut × 3krát druhý den, přidejte biotinem značený roztok C (pracovní roztok sekundární protilátky) po dobu 10 minut, promyjte roztokem PBS po dobu 5 minut × 3krát a přidejte roztok D značený křenovou peroxidázou byl inkubován po dobu 10 minut, promyt roztokem PBS po dobu 5 minut X3krát a nakonec vyvinut v roztoku DAB po dobu 5 minut, promyt vodou z vodovodu, kontrastně obarven HE, dehydratován gradientovým alkoholem, transparentní s xylenem a připevněné neutrální gumou. Po upevnění fólie pozorujte pod světelným mikroskopem. V každé dávce experimentů byl jako negativní kontrola místo primární protilátky použit fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS).
2.5 Analýza exprese syntázy oxidu dusnatého 3 Předběžně pozorovaný vizuální semikvantitativní metodou pod světelným mikroskopem, pozitivní produkt NOS3 je tmavě hnědý nebo hnědožlutý a pozitivní produkt se nachází v cytoplazmě hepatocytů nebo mezi hepatocyty. . V cytoplazmě endoteliálních buněk je modré pozadí negativní. Poté se systém analýzy barevného obrazu použije k měření šedé hodnoty pozitivního reaktantu a parametry 4 zorných polí jsou náhodně měřeny pro každý film pod 40-složeným objektivem a průměrná hodnota je přijato. Tento parametr se používá k vyjádření změny intenzity barviva NOS3. 2.6 Statistické metody Všechna data jsou reprezentována. Statistický softwarový balík SPSS11.{11}} se používá pro t-test a P<0.05 is="" considered="" a="" significant="">
Proti únavě
3 Výsledky
3.1 Pozorování struktury tkáně pod světelným mikroskopem U normální kontrolní skupiny je struktura jaterních lalůčků jasná, provazce buněk jsou uspořádány úhledně, sinusoidy jater jsou normální, jaterní buňky nemají žádné zjevné léze a struktura jádra je jasná. V kontrolní skupině cvičení zmizela normální tkáňová struktura, lalůčky byly nejasné, provazce buněk byly neuspořádané, většina jaterních sinusoid zmizela a hepatocyty byly rozsáhlou vakuolární degenerací, projevující se zvýšeným objemem buněk, uvolněnou cytoplazmou, světlým zbarvením, a dokonce jasné a průhledné. Některé jaterní buňky vykazovaly typickou balónovitou změnu s malým množstvím fokální nebo tečkovité nekrózy. Jaterní buňkyCistancheexperimentální skupina byly mírně zakalené, ale byly uspořádány pravidelně, v buňkách nebyly žádné zjevné vakuoly a uvolněnost, provazce buněk byly uspořádány úhledně a struktura jádra byla jasná.
3.2 Účinky na aktivitu jaterních izoenzymů laktátdehydrogenázy u myší při zátěži (viz tabulka 1)
Tabulka 1 ÚčinekCistanchena jaterní izoenzym laktátdehydrogenázy naloženého Xiaofeng (x±s)
Poznámka: Ve srovnání s normální kontrolní skupinou P<0, 05;="" compared="" with="" the="" exercise="" control="" group,=""><0.05 (the="" same="">
3.3 Pozorování barvení jaterního glykogenu světelným mikroskopem. Přestože obsah glykogenu v normální kontrolní skupině není vysoký, v každé jaterní buňce bez vakuol je glykogen rovnoměrně distribuován; kontrolní skupina cvičení má méně glykogenu, rozptýleného v jaterních buňkách, v některých oblastech se objevily vakuoly; aCistancheexperimentální skupina byla bohatá na glykogen, ale shromáždila se hodně na jedné straně buňky. 3.4 Pozorování exprese syntázy oxidu dusnatého 3 pomocí světelného mikroskopu a kvantitativní analýza obrazu. Cytoplazma normálních kontrolních hepatocytů vykazovala silnou pozitivní expresi v difuzní distribuci, zejména v binukleárních buňkách, a pozitivní expresi v endoteliálních buňkách. . Exprese v cytoplazmě hepatocytů a endoteliálních buněk v kontrolní skupině zátěže byla oslabena. Experimentální skupina cistanche prokázala pozitivní expresi v cytoplazmě hepatocytů a silnou pozitivní expresi v endoteliálních buňkách. Výsledky analýzy analyzátoru barevného obrazu jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 2 Porovnání rozdílu exprese №s3 v hepatocytech a endoteliálních buňkách (x±s)
4 Diskutujte
Že lidské tělo potřebuje energii na cvičení a tělo potřebuje energii i v procesu metabolismu. Buněčný metabolismus přímo využívá energii z rozkladu adenosintrifosfátu (ATP). Energie potřebná pro syntézu ATP je nakonec poskytována hlavně katabolismem cukru. Studie prokázaly, že po namáhavém cvičení bude tělo produkovat velké množství H', volných radikálů, kyseliny mléčné a dalších látek, které ovlivňují normální metabolismus buněk. Nedostatek glukózy v buňkách zároveň vede kúnava z cvičenía poškození buněk. Výsledky této studie ukazují, že poškození struktury jaterní tkáně je po velkém množství cvičení velmi vážné a má vliv i na syntézu buněk, jako je snížení syntézy jaterního glykogenu. Po spoustě cvičení zabírají myšiCistanchemůže pozorovat snížení poškození jater, zejména díky snížení LDH5, a obsah jaterního glykogenu je významně vyšší než u kontrolní skupiny při cvičení, což naznačuje, že Cistanche může dosáhnout ochrany jater a udržet normální fyziologii snížením funkce LDH5. Z výsledků barvení glykogenem.
Obsah glykogenu v experimentální skupině Cistanche je vyšší než u normální kontrolní skupiny. Zvyšuje Cistanche ukládání glykogenu v játrech před cvičením nebo urychluje syntézu glykogenu ve stresu po cvičení. Protože neexistuje žádná kontrola bez cvičeníCistanchev experimentu. Není možné vyvodit závěr a je třeba jej potvrdit v dalším kroku, ale ochrannýúčinek Cistanchena játra a podpora syntézy glykogenu po mnoha cvičeních jsou zřejmé. N{{0}} je látka s malou molekulou, která byla v posledních letech vysoce ceněna sportovní komunitou. NOS je hlavním faktorem omezujícím rychlost produkce N0. Bylo potvrzeno, že NOS má tři typy izoenzymů a NOSI se nazývá neuronální syntáza oxidu dusnatého.
Enzym, který existuje v neuronových buňkách, buňkách kosterního svalstva atd., se podílí hlavně na neurovývoji, neurosekreci, učení a procesech paměti: NOS2 je indukovatelná syntáza oxidu dusnatého, která se nachází hlavně v buňkách hladkého svalstva, makrofázích a lymfocytech. Tento enzym je indukován, může pokračovat v syntéze NO, dokud není vyčerpán substrát nebo buněčná smrt. V současnosti se má za to, že se podílí na poškození buněk; NOS3 je endoteliální syntáza oxidu dusnatého, která je distribuována hlavně v endoteliálních buňkách a hepatocytech a produkuje NO Podílí se hlavně na fyziologických funkcích. Výsledky této studie ukazují, že po velkém množství cvičení je exprese NOS3 v endoteliálních buňkách a hepatocytech oslabena a výsledný N0 klesá, takže krevní cévy nelze efektivně rozšiřovat, průtok krve je snížen, a suroviny pro syntézu glykogenu nemohou být transportovány do jaterních buněk, takže syntéza glykogenu je snížena. ;Cistanchemůže up-regulovat expresi NOS3 v endoteliálních buňkách a jaterních buňkách, reaktivně rozšiřovat krevní cévy, zvyšovat průtok krve, urychlovat schopnost transportu surovin pro syntézu glykogenu, urychlovat syntézu glykogenu a udržovat tělo na normální fyziologické metabolické úrovni. Proto snížení LDH5 k ochraně jater a up-regulace exprese NOS3 k podpoře glukoneogeneze kyseliny mléčné může být důležitým mechanismem proCistanchek ochraně jater a podpoře fyzického zotavení. Tento výzkum poskytuje vědecký experimentální základ pro další vývoj a využitíCistanchev oblasti sportovního lékařství a také pokládá základ pro rozvoj a čištěníCistancheův efektlátek.
