Experimentální studie mechanismů účinku proti sportovní únavě u Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

YANG Hong-xin1, YANG Yong2, YAN Xiao-hong1 (1. Katedra cytobiologie, Inner Mongolia Medical College, Hohhot 010059, Čína; 2. Katedra onkologie, Nemocnice autonomní oblasti Vnitřní Mongolsko, Huhhot 010017, Čína)

Abstraktní:Cíl Studovat účinekcistanche deserticolana isoenzym laktátdehydrogenázy (LDH), glykogen a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) jater u myší zatěžujících plavání a prozkoumat relevantní molekulární mechanismy proti sportovní únavě. Metody Myši byly rozděleny do normální kontrolní skupiny, sportovní kontrolní skupiny acistanche deserticolaexperimentální skupina. Každé myši z normální kontrolní skupiny a sportovní kontrolní skupiny byl podáván fyziologický roztok 0,2 ml denně. Každá myš z experimentální skupiny cistanche deserticola dostala odvar z vodycistanche deserticola0,2 ml (3 g/kg) za den. Administrace trvaly 15 dní. Zátěžové plavání po dobu 90 minut bylo prováděno na myších ze sportovní kontrolní skupiny a experimentální skupiny cistanche deserticola 1 hodinu po posledním podání. Po 10 hodinách plavání byla myším odebrána játra. Jedna část jater byla fixována v neutrálním formalínu pro přípravu parafinových řezů a ostatní byly použity pro měření aktivity LDH. Struktura jater byla pozorována barvením HE a jaterní glykogen byl měřen barvením glykogenu. NOS3 byl vyšetřen imunohistochemickou metodou SP. Výsledky Struktura jater sportovní kontrolní skupiny byla vážně zraněna, izoenzymy LDH4 a LDH5 byly vyšší, jaterní glykogen byl slabý, NOS3 byl snížen ve srovnání s normální kontrolní skupinou (P<0.05). the="" liver="" structure="" of="" the="" cistanche="" deserticola="" experimental="" group="" was="" good,="" ldh5="" isoenzyme="" was="" low,="" the="" glycogen="" was="" rich="" and="" expression="" of="" nos3="" was="" upregulated="" compared="" with="" the="" sport="" control="" group="" (p=""><0.05). conclusions="">Cistanche deserticolamohl snížit LDH5, chránit játra myší při zátěži plaváním a urychlit akumulaci glykogenu zvýšením exprese NOS3 k ochraně jater a zlepšením obnovy fyzické kapacity.

klíčová slova:cistanche deserticola;jaterní glykogen;syntáza oxidu dusnatého 3;myši.

Obrázek Cistanche

Cistanche,také známý jako Dayun, je dvouletá parazitická bylina z čeledi Ledanaceae. Má suché dužnaté stonky se šupinami. Vyrábí se především na písčitých půdách a polopísčitých pastvinách ve Vnitřním Mongolsku, Gansu, Xinjiang, Qinghai a dalších místech. vnitřní MongolskoCistanchemá nejlepší kvalitu ze všech výrobních oblastí.Cistancheje sladké, slané a teplé povahy. Vstoupí doledvinya meridián tlustého střeva. Jeho hlavní funkcí je vyživovat ledviny a posilovat jang, vyživovat esenci a krev a zvlhčovat střeva. Často se používá k léčbě impotence, neplodnosti, slabého pasu a kolen, slabosti svalů a kostí, suchých střev a zácpy. Tato studie si klade za cíl sledovat účinkyCistanchena zátěžových plaveckých myších jaterní laktátdehydrogenázu (LDH), jaterní glykogen a syntázu oxidu dusnatého 3 (NOS3) pomocí zátěžového plaveckého testu u myší a prozkoumat její ochranný mechanismus na játrech. Proto může poskytnout teoretický základ pro hloubkový výzkum, vývoj a využitíCistanche ve sportovní zdravé výživě.

1 Experimentální materiály

1.1 Zvířata

3 0 samci krys Kunming, čistý stupeň, tělesná hmotnost (20±0,5) g, poskytnuto Animal Center of Inner Mongolia University.

1.2 Léky

Cistanche deserticolaYCMa, vyráběný v Ejina Banner, Vnitřní Mongolsko a byl identifikován. Podle původního léčivého materiálu: voda=100 g: 400 ml, nejprve namočte na 30 minut, zahřejte a povařte a poté 30 minut vařte na teplém ohni. Tekutý lék vylijte a znovu rozvařte v poměru 100 g: 200 ml. Tyto dva odvary byly smíchány dohromady a zfiltrovány dvěma vrstvami gázy a poté zakoncentrovány na ekvivalent 1 g původního léčivého materiálu na mililitr zásobního roztoku pro odvar vody, skladovaného v chladničce při 4 stupních.

1.3 Reagencie a nástroje

NOS3 polyklonální protilátka byla zakoupena od Wuhan Boster Bioengineering Co., Ltd. Sada SP byla zakoupena od Fujian Maixin Reagent Company. Souprava izoenzymu laktátdehydrogenázy byla zakoupena od společnosti Inner Mongolia Tongri Reagent Company (výhradně vlastněná Nissanem). Analyzátor barevných obrázků Nanjing JD-80. Americký systém UVP gelové analýzy obrazu.

2 Experimentální metoda

2.1 Seskupování a dávkování

Myši Kunming byly náhodně rozděleny do normální kontrolní skupiny, kontrolní skupiny při cvičení aCistancheexperimentální skupina s 10 myší v každé skupině. Normální kontrolní skupině a cvičební kontrolní skupině byl podáván fyziologický roztok jednou denně, 0,2 ml/čas; aCistanchebyla dána experimentální skupinacistancheodvar (vezměte 3 ml původního vodného odvaru a přidejte vodu na 10 ml). Jednou denně, 0,2 ml/čas, denní dávka je 3 g/kg a 15 dní v řadě. Jednu hodinu po poslední dávce se myši v kontrolní skupině při cvičení aCistancheexperimentální skupina byla naložena 1g olověným závažím na ocas a byla umístěna do bazénu o výšce 50 cm, délce 50 cm a šířce 35 cm, aby plavali při teplotě (30±0,5) stupně , Neustále myši pozorujte, pokud zjistí, že přestaly plavat, použijte dřevěnou hůl ke stimulaci jejich pohybu po dobu 90 minut. Po cvičení snězte normální stravu, odpočívejte 10 hodin a poté myši usmrtíte normálními kontrolními skupinami myší. Vyjměte játra, fixujte část 10% neutrálním formaldehydem a po dehydrataci, průhlednosti, ponoření do vosku a zalití vytvořte tloušťku 4 µm. Použijte metodu barvení HE k pozorování struktury jaterní tkáně každé skupiny. Druhá část byla promyta normálním fyziologickým roztokem a skladována zmrazená při -20 stupních a během měření byla rozmražena při pokojové teplotě. Namočte do sucha filtračním papírem a zvažte, poté připravte jaterní homogenát s normálním fyziologickým roztokem, odstřeďujte při 3 500 ot./min po dobu 15 minut. Odeberte supernatant a elektroforézou změřte aktivitu izoenzymu laktátdehydrogenázy.

2.2 Stanovení aktivity laktátdehydrogenázy

Pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu jsou izoenzymy LDH separovány podle jejich rozdílů v elektroforetické pohyblivosti. Koncentrace separačního gelu ve vzorku je 7 procent, pH 8,9, a koncentrace koncentrovaného gelu je 4 procenta, pH 6,8. 10 ul vzorku se smíchá s 1 kapkou glycerolu a indikátoru bromfenolové modři. Elektrodový pufr je Tris-glycin (pH 8,7), začněte stabilizovat napětí na 100-150 V, po 30 minutách přidejte na 200-250 V a elektroforéza po dobu 4 hodin. Po elektroforéze byla obarvena soupravou Lactate Dehydrogenase Isoenzyme Kit a barvena při 37 stupních po dobu 30 minut, přičemž se ukázal modrý pruh izoenzymu laktát dehydrogenázy, poté opláchnuta vodou a fixována ledovou kyselinou octovou. Nakonec použijte pro analýzu dat systém UVP gelové analýzy obrazu.

2.3 Barvení glykogenem

Sériové řezy o tloušťce 4 µm jsou běžně deparafinizovány vodou. vložte do 1% roztoku kyseliny jodisté ​​při 37 stupních po dobu 15 minut. opláchnout tekoucí vodou. vložit do Schiffova roztoku na 60 min. opláchnuta tekoucí vodou, dehydratována gradientem ethanolu, transparentním xylenem a upevněna neutrální gumou. Poté pozorujte výsledky barvení pod mikroskopem.

2.4 Imunohistochemické barvení

Řezy jsou rutinně zbaveny parafinu ve vodě a antigen je opraven pomocí mikrovln s citrátovým pufrem. Působte s roztokem A po dobu 10 minut k odstranění endogenní peroxidázy a blokujte roztokem B (zředěné kozí sérum) po dobu 10 minut. Přidejte primární protilátku do zvlhčeného boxu při 4 stupních přes noc a druhý den promyjte roztokem PBS s pH 7,4 po dobu 5 minut × 3krát. Poté přidejte biotinem značený roztok C (pracovní roztok sekundární protilátky) a inkubujte 10 minut, promyjte roztokem PBS po dobu 5 minut × 3krát. Přidejte roztok D značený křenovou peroxidázou a inkubujte 10 minut, promyjte roztokem PBS 5 minut × 3x. Nakonec byl vyvolán v roztoku DAB po dobu 5 minut, promyt vodou z vodovodu, kontrastně obarven HE, dehydratován gradientem ethanolu, transparentní xylenem a upevněn neutrální gumou. Po upevnění filmu pozorujte pod světelným mikroskopem. V každé dávce experimentů byl jako negativní kontrola místo primární protilátky použit fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (PBS).

2.5 Analýza exprese syntázy 3 oxidu dusnatého

Předběžné pozorování vizuální semikvantitativní metodou pod světelným mikroskopem, NOS3 pozitivní produkt je tmavě hnědý nebo hnědý. Pozitivní produkt se nachází v cytoplazmě hepatocytů nebo endoteliálních buněk mezi hepatocyty a modré pozadí je negativní. Poté použijte systém analýzy barevného obrazu k měření hodnoty šedé pozitivního reaktantu. Pod čočkou objektivu 40x se u každého filmu náhodně změří parametry 4 zorných polí a vezme se průměrná hodnota. Tento parametr se používá k vyjádření změny intenzity barvení NOS3.

2.6 Statistické metody

Všechna data jsou vyjádřena jako x-±s a SPSS11.0 Statistický softwarový balík se používá pro t-test a P<0.05 is="" considered="" as="" significant="">

3 Výsledky

3.1 Pozorování struktury tkáně pod optickým mikroskopem

Struktura jaterních lalůčků u normální skupiny je jasná, provazce buněk jsou uspořádány úhledně, sinusoidy jater jsou normální, jaterní buňky nemají žádné zjevné léze a struktura jádra je jasná. Normální tkáňová struktura kontrolní skupiny cvičení zmizela, hranice laloků byly nejasné a buněčný provazec byl neuspořádaný, většina jaterních sinusoid zmizela a rozsáhlá vakuolární degenerace hepatocytů se projevuje zvýšeným objemem buněk. Cytoplazma je volná, lehce zbarvená, dokonce čirá a průhledná a některé jaterní buňky vykazují typickou balónkovou změnu s malým množstvím fokální nebo tečkovité nekrózy. Jaterní buňkyCistancheexperimentální skupina byly mírně zakalené, ale byly pravidelně uspořádány. V buňkách nebyly žádné zjevné vakuoly a uvolněnost, buněčné provazce byly uspořádány úhledně a struktura jádra byla jasná.

3.2 Účinky na aktivitu jaterních izoenzymů laktátdehydrogenázy u myší při zátěži (viz tabulka 1)

3.3 Pozorování barvení jaterního glykogenu pod optickým mikroskopem

Přestože obsah glykogenu v normální kontrolní skupině není vysoký, glykogen je v každé jaterní buňce, distribuce je rovnoměrná a nedochází k jevu vakuoly. Kontrolní skupina při cvičení měla méně glykogenu, rozptýleného v jaterních buňkách a v některých oblastech se objevily vakuoly; experimentální skupina Cistanche byla bohatá na glykogen, ale shromáždila se hodně na jedné straně buňky.

3.4 Pozorování exprese syntázy oxidu dusnatého 3 optickým mikroskopem a kvantitativní analýza obrazu

Existuje silná pozitivní exprese v cytoplazmě hepatocytů v normální kontrolní skupině, která je difúzně distribuována, zejména v binukleárních buňkách, a pozitivní exprese v endoteliálních buňkách. Exprese v cytoplazmě hepatocytů a endoteliálních buněk v kontrolní skupině zátěže byla oslabena.Cistancheexperimentální skupina měla pozitivní expresi v cytoplazmě hepatocytů a silnou pozitivní expresi v endoteliálních buňkách. Výsledky analýzy analyzátoru barevného obrazu jsou uvedeny v tabulce 2.

4. Diskuze

Pohyb lidského těla potřebuje energii a tělo potřebuje také energii v procesu metabolismu Buněčný metabolismus přímo využívá energii z rozkladu adenosintrifosfátu (ATP) a energie potřebná pro syntézu ATP je nakonec poskytována především katabolismem cukru . Studie prokázaly, že po namáhavém cvičení bude tělo produkovat velké množství H plus, volných radikálů, kyseliny mléčné a dalších látek, které ovlivňují normální metabolismus buněk. Nedostatek glukózy v buňkách zároveň vede k únavě ze cvičení a poškození buněk. Výsledky této studie ukazují, že poškození struktury jaterní tkáně je velmi vážné po velké zátěži a ovlivňuje také buněčný anabolismus, jako je snížení syntézy jaterního glykogenu. U myší užívajících Cistanche lze pozorovat, že snižují poškození jater po velké námaze, zejména díky snížení LDH5, a obsah jaterního glykogenu je výrazně vyšší než u kontrolní skupiny při cvičení.Cistanchemůže dosáhnout ochrany jater a udržet normální fyziologii snížením funkce LDH5. Z výsledků barvení glykogenem se zjistí obsah glykogenuCistancheexperimentální skupina je vyšší než u normální kontrolní skupiny. anoCistanchezvýšit zásoby jaterního glykogenu před cvičením nebo urychlit syntézu glykogenu ve stresu po cvičení? Nelze učinit žádný závěr, protože neexistuje žádná kontrolní skupina, která by necvičilaCistanchev experimentu. Ještě to musí být potvrzeno v dalším kroku, ale ochranný účinek Cistanche na játra a podpora syntézy glykogenu po velkém cvičení jsou zřejmé.

NO je látka s malou molekulou, která je v posledních letech vysoce ceněna sportovní komunitou. NOS je hlavním faktorem omezujícím rychlost produkce NO. Bylo potvrzeno, že NOS má 3 typy izoenzymů. NOS1 se nazývá neuronální syntáza oxidu dusnatého. Existuje v neuronových buňkách, buňkách kosterního svalstva atd. a podílí se především na neurovývoji, neurosekreci, procesech učení a paměti. NOS2 je indukovatelná syntáza oxidu dusnatého, která se nachází hlavně v buňkách hladkého svalstva, makrofázích a lymfocytech. Jakmile je tento enzym indukován, může pokračovat v syntéze NO, dokud není substrát vyčerpán nebo buňka nezemře. V současné době se předpokládá, že se podílí na poškození buněk; NOS3 je endoteliální syntáza oxidu dusnatého, která je distribuována hlavně v endoteliálních buňkách a hepatocytech. Produkovaný NO se podílí především na fyziologických funkcích. Výsledky této studie ukazují, že exprese NOS3 v endoteliálních buňkách a hepatocytech je po velkém cvičení oslabena a výsledný NO je snížen, takže krevní cévy nelze účinně rozšířit, průtok krve je snížen a suroviny pro syntetický glykogen nemůže být transportován do jaterních buněk, takže syntéza glykogenu je snížena.

Funkce proti únavě Cistanche

Cistanchemůže upregulovat expresi NOS3 v endoteliálních buňkách a jaterních buňkách. Reaktivně rozšiřte krevní cévy. Zvyšte průtok krve, urychlete schopnost transportu surovin pro syntézu glykogenu. Urychlit syntézu glykogenu a udržovat tělo na normální fyziologické metabolické úrovni. Proto snížení LDH5 k ochraně jater a up-regulace exprese NOS3 k podpoře glukoneogeneze kyseliny mléčné může být důležitým mechanismem proCistanchek ochraně jater a podpoře fyzického zotavení. Tento výzkum poskytuje vědeckou experimentální základnu pro další vývoj a využitíCistanchev oblasti sportovního lékařství a také pokládá základy pro rozvoj a čištěníCistancheův efektlátek.

Článek z: "Experimentální studie mechanismů účinku proti sportovní únavě Cistanche Deserticola" od YANG Hong-xin1 atd.

-----Čínský žurnál informací o TCM Apr. 2008 Vol.15 No.4