Experiment 3 Účinek fenylethanolového glykosidu Cistanche Deserticola na krysí perimenopauzální model Ⅲ

Experiment 3 Účinek fenylethanolového glykosidu Cistanche deserticola na perimenopauzální model potkana

1 Experimentální materiály

1.1 Pokusná zvířata

Krysy Wistar, stupeň SPF, samice, poskytnuté společností Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., číslo certifikátu potkanů ​​pro tuto šarži: 0017216; číslo laboratorního certifikátu SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Experimentální léky

Glykosid fenylethanolu Cistanche deserticolabyl připraven podle metody experimentu 1 a obsah dosáhl 66,47 %. Gengnian'an Capsule, složení: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, pivoňková kůra, Poria cocos, perleť, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum plovoucí réva, Uncaria pšenice . Funkce a indikace:Vyživuje jin a potlačuje jang, ulevit od potížía uklidnit mysl. Používá se při menopauzálních návalech horka a pocení, závratích, tinnitu, podrážděnosti a nespavosti. Specifikace: 0,3 g na kapsli. Použití a dávkování: Perorálně, 3 kapsle najednou, 3x denně. Výrobce: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Číslo výrobní šarže: 121104. Číslo schválení: National Drug Approval No. Z14021848.

Sojové isoflavony a vitamin E měkké kapsle, seznam složek: sójové isoflavony prášek, vitamin E, slunečnicový olej, želatina, glycerin, voda, tartrazin, oxid titaničitý. Ikonické ingredience a obsah: Každých 100 g obsahuje 55,2 mg sójových isoflavonů (počítáno jako genistein) a 608,5 mg vitamínu E. Zdravotní funkce: Zvyšte hustotu kostí. Návod a dávkování: Užívejte 1 kapsli 2x denně s teplou vodou. Specifikace: 500 mg × 100 kapslí. Výrobce: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Číslo výrobní šarže: 13070302. Číslo schválení: National Food Health G20080032.

JAK DLOUHO TRVÁ, NEŽ CISTANCHE PŮSOBÍ?

1.3 Experimentální činidla

Sodná sůl karboxymethylcelulózy, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., číslo šarže: 20120418; penicilin sodný pro injekci, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikace: 4 miliony jednotek, číslo výrobní šarže: c1206807;

Roztok formaldehydu (analyticky čistý), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., číslo výrobní šarže: 20130902; 0,9% injekce chloridu sodného, ​​Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikace: 250ml, číslo výrobní šarže: 13082405B;

Chloralhydrát, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, číslo šarže 20120827; Detekční souprava Rat E2 ELISA, R&D Company, číslo šarže: 20140101A; Detekční souprava Rat T ELISA, R&D Company, číslo šarže: 20140101A; Detekční souprava Rat LH ELISA, R&D Company, číslo šarže: 20140101A; Detekční souprava Rat FSH ELISA, R&D Company, číslo šarže: 20140101A;

2 Experimentální metody

2.1 Modelování a administrace léčiv

Metoda modelování: Vezměte 1 00 krysích samic wistar s tělesnou hmotností 210~230 g, náhodně vyberte 12 krys jako prázdnou skupinu a podstupte falešnou operaci a zbývající krysy budou použity k vytvoření menopauzy modely. Poté, co byly krysy zváženy, byly krysy anestetizovány intraperitoneální injekcí 10% chloralhydrátu (0,3 ml/100 g) a břišní poloha byla fixována. Potom byly krysy oříznuty zpod posledního žebra na zádech v průsečíku střední axilární linie a asi 2 cm od laterální strany páteře a poté dezinfikovány. Kůže a zádové svaly jsou naříznuty asi 1 cm a v zorném poli řezu je vidět mléčně bílá lesklá tuková hmota a v ní je zapuštěný vaječník. Malou pinzetou jemně uchopte tukovou hmotu a vytáhněte ji z řezu, oddělte tukovou hmotu a uvidíte skupinu tenkých nepravidelných žlutočervených vaječníků. Při nástřihu nejprve podvázejte vejcovod (včetně tuku) pod vaječníkem tenkou nití, levý vaječník zcela vyjměte a pravý vaječník odstraňte z 80 %. Po operaci byly děložní rohy vloženy zpět do dutiny břišní, sešity svaly a kůže a stejným způsobem byly odstraněny oba vaječníky. Po operaci byla zvířata opatrně chována a intramuskulárně jim bylo jednou denně po dobu 3 po sobě jdoucích dnů injikováno 200,000 u/kg penicilinu (0,1 ml každé), aby se zabránilo infekci. 5 dní po operaci bylo zahájeno vyšetření vaginálního stěru u potkanů ​​jeden po druhém, jednou denně po dobu 5 po sobě jdoucích dnů. Krysy s estrálními reakcemi v nátěru byly vyřazeny. Bylo vybráno 72 kompletně kastrovaných potkanů, které byly náhodně rozděleny do 6 skupin. Pro experimentální účely jsou to modelová skupina, skupina Gengnianan, skupina sójových isoflavonů a skupina glykosidů fenylethanolu z velké, střední a malé dávky Cistanche deserticola.

Způsob přípravy: Způsob přípravy: {{0}}.5% CMC Způsob přípravy: Odvažte 4 g sodné soli karboxymethylcelulózy a smíchejte s destilovanou vodou, abyste získali 800ml. Dávky velkých, středních a malých dávek fenylethanolglykosidové skupiny Cistanche deserticola byly 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg a 33,33 mg/kg (objem podání 1 ml/100 g). Způsob přípravy: Navažte 1333,3 mg, 666,7 mg a 333,3 mg celkových malinových flavonoidů, rozpusťte je v malém množství 0,5 % CMC, poté upravte objem na 100 ml, dobře promíchejte a je to. Gengniangan Capsules (450 mg/kg, smíchané s destilovanou vodou na 45 mg/ml, 1 ml/100 g, ekvivalentní 10násobku klinické dávky); Způsob přípravy: Vezměte 15 tobolek Gengniangan, nejprve je rozpusťte v malém množství 0,5% CMC, poté upravte objem na 100 ml a dobře promíchejte, což je dávka suspenze Gengnianan Capsule (450 mg/kg). Měkké kapsle sojového isoflavonu Vitamin E (166,67 mg/kg, použijte destilovanou vodu k výrobě 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, což odpovídá 10násobku klinické dávky); Způsob přípravy: Vezměte 4 měkké tobolky sojových isoflavonů vitaminu E, nejprve rozpusťte v malém množství 0,5 % CMC, poté upravte objem na 120 ml a dobře promíchejte, abyste získali dávku suspenze měkkých tobolek sojového isoflavonu vitaminu E (16,67 mg/kg ).

Způsob podání: Zvířatům v každé skupině byly 1. den po operaci podány odpovídající léky. Slepé skupině a modelové skupině byl podán žaludeční sondou stejný objem 0,5% roztoku CMC (objem žaludeční sondy byl 1 ml/100 g) a skupině Gengnianan byla podána žaludeční sondou suspenze tobolek Gengnianan (450 mg/kg, což odpovídá 10násobku klinické dávky ). ), skupině se sójovým isoflavonem byla perorálně podávána suspenze sójového isoflavonu vitaminu E v měkkých kapslích (166,67 mg/kg, což odpovídá 10násobku klinické dávky), a velká, střední a malá dávkaGlykosid fenylethanolu Cistanche deserticolaskupiny byly podávány perorálně podle skupiny. Velké, střední a malé dávky fenylethanolglykosidu Cistanche deserticola (dávky jsou 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg a 33,33 mg/kg, objem dávky je 1 ml/100 g), podávané jednou denně intragastrickou aplikací, kontinuálně . lék na 30 dní.

2.2 Pozorované položky a metody detekce

Skóre horizontálního a vertikálního pohybu krys v každé skupině bylo měřeno 29 dnů po podání. 2 hodiny po posledním podání do žaludku (15 hodin nalačno) odstraňte oční bulvy, abyste odebrali krev, oddělili sérum aplazmaa změřte obsah E2, T, LH, FSH, GnRH a BGP v séru a obsah -EP v plazmě; krysy byly pitvány. Odstraňte brzlík, slezinu, dělohu a zbývajících 20 % ovariální tkáně, zvažte jejich mokré hmotnosti a vypočítejte orgánový index brzlíku, sleziny a dělohy (orgánový index=vlhká hmotnost orgánu mg/hmotnost potkana g) , a poté odebrat mozek Pro hypotalamus a hypofýzu byly připraveny tkáňové homogenáty z hypotalamu, hypofýzy a 1/2 dělohy a obsah estrogenových receptorů v hypotalamu, hypofýze a děložní tkáňové homogenáty a androgen byl stanoven obsah receptoru v homogenátech hypotalamické tkáně. Brzlík, slezina, děloha a vaječník byly fixovány v 10% roztoku formaldehydu, zality v parafínu, nařezány a obarveny HE. Thehistomorfologické změnyv každé skupině byly pozorovány pod světelným mikroskopem.

2.2.1 Test metodou otevřeného pole

Experimentální zařízení je krychlový otevřený box o výšce 40 cm a délce a šířce 80 cm. Okolní stěny a dno jsou černé. Dno je složeno z 25 bloků stejné plochy, rozdělených bílými čarami. Během experimentu byla krysa umístěna do čtverce ve středu otevřeného boxu a bylo zjištěno skóre horizontální aktivity počtu bloků, které krysa překročila na dně během 5 minut (lze spočítat čtverce se všemi čtyřmi zadanými tlapkami), a kolikrát stály zadní končetiny vzpřímeně (dvě přední tlapky byly ve vzduchu). (nebo přilnutí ke zdi) skóre vertikální aktivity. Po každém experimentu musí být výkaly zcela odstraněny a každý potkan se měří jednou 2 hodiny po podání. Tento experiment byl proveden v tiché místnosti.

2.2.2 Metoda stanovení soupravy

Získání vzorků séra: Použijte zkumavky, které neobsahují pyrogeny a endotoxiny. Během operace se vyvarujte jakékoli buněčné stimulace. Po odebrání krve ji odstřeďujte při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut, abyste rychle a opatrně oddělili sérum a červené krvinky. Získejte vzorky plazmy: antikoagulované pomocí heparinových antikoagulačních zkumavek. Centrifugujte při 3000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut a odeberte supernatant. Získejte vzorky tkáňového homogenátu: Přidejte do tkáně vhodné množství fyziologického roztoku a rozmačkejte ji. Centrifugujte při 3000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut a odeberte supernatant.

Metoda stanovení soupravy ELISA krysího (krysího) estradiolu (E2) je stejná jako v experimentu 2. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 4, 8, 16, 32 a 64 pmol/l.

Metoda testu soupravy Rat (Rat) Testosterone (T) ELISA Kit je stejná jako testovací metoda soupravy Estradiol ELISA Kit. Koncentrace standardů (S{{0}}S5) jsou {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 a 320 pg /ml. Metoda stanovení detekční soupravy krysího (Rat) luteinizačního hormonu (LH) ELISA je stejná jako metoda stanovení soupravy pro detekci estradiolu ELISA. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 3, 6, 12, 24 a 48 ml/ml. Metoda testu soupravy ELISA krysího (krysího) folikuly stimulujícího hormonu (FSH) je stejná jako testovací metoda soupravy ELISA s estradiolem. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 0,75, 1,5, 3, 6 a 12 IU/L. Metoda stanovení krysího (Rat) gonadotropin-releasing hormonu (GnRH) ELISA detekční soupravy je stejná jako metoda stanovení detekční soupravy estradiol ELISA. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 5, 10, 20, 40 a 80 mlU/ml.

Metoda stanovení detekční soupravy potkaního (krysího) osteokalcinu (BGP/OCN) ELISA je stejná jako metoda stanovení soupravy pro detekci estradiolu ELISA. Koncentrace standardů (S{{0}}S5) jsou 0, 0,75, 1,5, 3, 6 a 12 ng/ml. Metoda stanovení krysí (Rat) -endorfin ( -EP) ELISA detekční soupravy je stejná jako metoda stanovení estradiolové ELISA detekční soupravy. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 3, 6, 12, 24 a 48 pg/ml. Metoda stanovení detekční soupravy potkaního (Rat) estrogenového receptoru (ER) ELISA je stejná jako metoda stanovení soupravy pro detekci estradiolu ELISA. Koncentrace standardů (S{{20}}S5) jsou 0, 4, 8, 16, 32 a 64 pg/ml. Metoda stanovení detekční soupravy ELISA krysího (Rat) androgenního receptoru (AR) je stejná jako metoda stanovení soupravy pro detekci estradiolu ELISA. Koncentrace standardů (S0-S5) jsou 0, 25, 50, 100, 200 a 400 pg/ml.

2.3 Metody statistického zpracování

Pro analýzu dat byl pro statistické zpracování dat použit lékařský statistický balíček SPSS17.0. Data měření byla vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (-x±s). Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu. K testování homogenity rozptylů byla použita metoda LSD. , test Games-Howell byl použit pro nerovnoměrné rozptyly a test Ridit byl použit pro data o známkách.

Z tabulky 11 a obrázku 14 je vidět, že ve srovnání s prázdnou skupinou byly indexy brzlíku, sleziny a děložní index u potkanů ​​v modelové skupině významně sníženy (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Účinky na hladiny krevního biochemického indexu u perimenopauzálních modelových krys

Obsahy E2, T, LH, FSH, GnRH a BGP v séru a obsahy -EP v plazmě krys v každé skupině jsou uvedeny v tabulkách 12 až 13 a na obrázcích 15 až 17.

Z tabulek 12~13 a obrázků 15~18 je vidět, že ve srovnání se slepou skupinou byly hladiny E2 a T v séru potkanů ​​v modelové skupině významně sníženy (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tabulka 14 Účinek fenylethanolového glykosidu Cistanche deserticola na hladiny GnRH v séru a plazmatické hladiny -EP u potkaního perimenopauzálního modelu (-x±s)

Z tabulky 14 a obrázků 19-20 je vidět, že ve srovnání s prázdnou skupinou byla hladina GnRH v séru potkanů ​​v modelové skupině významně zvýšena a hladina -EP v plazmě byla významně snížena (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Účinky na obsah ER a AR v tkáních perimenopauzálních modelových krys

Obsahy ER a AR v relevantních tkáních krys v každé skupině jsou uvedeny v tabulkách 16-17 a na obrázcích 22-23.

Z tabulky 17 a obrázku 23 je vidět, že ve srovnání se slepou skupinou byla hladina AR v hypotalamu u modelové skupiny významně nižší (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Účinky na morfologii orgánové tkáně u perimenopauzálních krys

Výsledky patologického a histologického pozorování dělohy, brzlíku a sleziny krys v každé experimentální skupině jsou následující. Patologické fotografie jsou uvedeny v příloze 1 pro patologické fotografie perimenopauzálních modelových krys.

5.1 Účinek na morfologii děložní tkáně u perimenopauzálních krys

Podle různého stupně změn v endometriu, žlázách a myometriu potkanů ​​v každé experimentální skupině byly použity semikvantitativní standardy k rozdělení patologické morfologie tkáně do čtyř úrovní a dělohy potkanů ​​v každé experimentální skupině byly měřeno. Výsledky pozorování jsou uvedeny v tabulce 18.

"-" Endometriální epiteliální buňky, žlázy, myometrium a seróza jsou všechny normální; "+" endometriální epiteliální buňky a žlázy jsou atrofované a myometrium a seróza jsou normální; "++" endometriální epitel Buňky a žlázy jsou částečně atrofovány, svalová vrstva je mírně atrofována a seróza je normální; Endometriální epiteliální buňky a žlázy "+++" jsou významně atrofovány a seróza je normální.

Po Riditově testu je z tabulky 18 vidět, že ve srovnání se slepou skupinou vykazovala děloha krys v modelové skupině významné patologické tkáňové léze (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Účinek na morfologii ovariální tkáně u perimenopauzálních krys

Podle různého stupně změn folikulů, žlutého tělíska, granulózních buněk a krevních cév ve vaječnících krys v každé skupině experimentů byly použity semikvantitativní standardy k rozdělení patologické morfologie tkáně do čtyř úrovní. Vaječníky krys v každé skupině experimentů byly měřeny a pozorovány. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19.

Tabulka 19 Účinek fenylethanolového glykosidu Cistanche deserticola na ovariální patologické změny u perimenopauzálních modelových potkanů ​​Jednotka: pouze

"-" může zobrazovat rostoucí folikuly, zralé folikuly a žluté tělísko na všech úrovních. Žluté tělísko je dobře vyvinuté, s mnoha vrstvami granulózních buněk, bohatou folikulární tekutinou a bohatými krevními cévami; „+“ může zobrazovat rostoucí folikuly, zralé folikuly a žluté tělísko, ale počet zralých folikulů a žlutého tělíska je malý. , folikuly jsou menší a granulózní buňky jsou méně vrstvené; „++“ může zobrazovat zralé folikuly a žluté tělísko s větším počtem žlutých tělísek, méně granulózních buněk a méně krevních cév; "+++" nemá žádné folikuly, více žlutého tělíska a vaječník je atrofický, avaskulární.

Po Riditově testu je z tabulky 19 vidět, že ve srovnání se slepou skupinou vykazovaly vaječníky modelové skupiny potkanů ​​významné patologické tkáňové léze (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Účinky na morfologii tkáně brzlíku a sleziny u perimenopauzálních modelových potkanů

Pomocí mikrometru změřte tloušťku nejtlustších a nejužších částí kůry brzlíku každé krysy v každé experimentální skupině, abyste získali průměr; Použijte základní linii mikrometru, abyste dopadli na uzliny sleziny, změřte tloušťku uzlin sleziny na obou stranách s centrální tepnou jako středem a vypočítejte průměr. Naměřené výsledky jsou uvedeny v tabulce 20 a na obrázku 24.

Z tabulky 20 a obrázku 24 je patrné, že v porovnání se slepou skupinou byla tloušťka kůry brzlíku a objem slezinných uzlů v modelové skupině významně sníženy (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).