Hodnocení účinku na slizniční imunitu podjednotkové vakcíny E2Fc a E2Ft viru bovinního virového průjmu

Abstraktní:

Bovinní virový průjem/slizniční onemocnění, klasifikované jako infekční onemocnění třídy B Světovou organizací pro zdraví zvířat (OIE), je akutní, vysoce nakažlivé onemocnění způsobené virem bovinního virového průjmu (BVDV). Sporadické endemity BVDV často vedou k obrovským ekonomickým ztrátám v mlékárenském a hovězím průmyslu. Abychom osvětlili prevenci a kontrolu BVDV, vyvinuli jsme dvě nové podjednotkové vakcíny expresí E2 fúzních rekombinantních proteinů viru bovinního virového průjmu (E2Fc a E2Ft) prostřednictvím suspendovaných buněk HEK293. Hodnotili jsme také imunitní účinky vakcín. Výsledky ukázaly, že obě podjednotkové vakcíny vyvolaly intenzivní slizniční imunitní odpověď u telat. Mechanicky se E2Fc vázal na Fc receptor (Fc RI) na buňkách prezentujících antigen (APC) a podporoval sekreci IgA, což vedlo k silnější imunitní reakci T-buněk (typ Th1). Titr neutralizačních protilátek stimulovaný slizničně imunizovanou vakcínou s podjednotkou E2Fc dosáhl 1:64, což bylo vyšší než u vakcíny s podjednotkou E2Ft a u intramuskulární inaktivované vakcíny. Dvě nové podjednotkové vakcíny pro slizniční imunitu vyvinuté v této studii, E2Fc a E2Ft, mohou být dále použity jako nové strategie pro kontrolu BVDV posílením buněčné a humorální imunity.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Klíčová slova: BVDV; podjednotková vakcína; slizniční očkování; molekulární adjuvans; Fc receptor; ferritin

1. Úvod

Virus bovinního virového průjmu (BVDV) patří spolu s virem hraniční choroby (BDV) a virem moru prasat (CSFV) do rodu Pestivirus z čeledi Flaviviridae [1]. Kombinace perzistující infekce (PI) a cytopatické infekce u telat často vede k závažnému onemocnění sliznice s mortalitou až 100 % [2]. BVDV se ve světě široce distribuuje s relativně vysokou mírou pozitivních protilátek. V Číně převládají typy 1B, 1M a 1Q typu-1 BVDV [3–5]. Fylogenetická analýza odhalila, že virus bovinního virového průjmu typu 1 byl do Číny dovezen v 60. letech 20. století a že v Číně je v oběhu nejméně osm genotypů BVDV{12}}. Mezi nimi jsou hlavní genotypy 1B a 1m [6]. To je v souladu s naším epidemiologickým šetřením BVDV v Tibetu. Sférický virion BVDV má průměr přibližně 40–60 nm a je obalený pouzdrem. Jednovláknový genom virové RNA BVDV má délku přibližně 12,5 KB. Virový polyprotein je následně štěpen kombinací hostitelských a virových proteáz na čtyři strukturální (C, E0, E1, E2) a osm nestrukturálních (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) proteiny [7, 8]. BVDV-E2 má silnou imunogenicitu a důkazy ukázaly, že neutralizační protilátky (NAbs) indukované u infikovaných zvířat se zaměřují hlavně na E2 [9]. Mezitím multivalentní E2 podjednotkové vakcíny zaměřené na hlavní cirkulující kmeny BVDV mohou poskytnout částečnou ochranu proti homologním kmenům. Rekombinantní vakcína proti herpesviru zkonstruovaná s proteinem BVDV E2 a proteinem bovinního herpesviru 1 (BoHV-1) D indukovala u hostitele specifické imunitní reakce na oba viry po intranazální nebulizaci [10]. Proto může být dobrou strategií kontrolovat BVDV použitím imunodominantního proteinu BVDV E2 jako podjednotkové vakcíny. Nosní dutina je bohatá na lymfocyty a buňky prezentující antigen, poskytuje vhodné mikroprostředí pro slizniční imunizaci a chrání proteinové vakcíny před destabilizací kyselinami a zásadami. Navíc intranazální vakcínou indukovaný imunoglobulin A (IgA) a rezidentní paměťové B a T lymfocyty v horních cestách dýchacích jsou schopny účinně blokovat replikaci viru [11]. Imunizace přes nosní dutinu nejen navozuje slizniční imunitu, ale také stimuluje systematické imunitní reakce, které mají imunitní ochranné účinky. Předchozí studie zjistily, že antigeny by mohly být zcela doručeny do slizničního epitelu zacílením podjednotkových vakcín na neonatální Fc receptor (FcRn) M buněk na slizničním epitelu, a tím účinně stimulovat specifické imunitní reakce [12–14]. Imunizační účinky nosního spreje jsou významně zesíleny použitím rozpustné rekombinantní vakcíny vytvořené fúzí molekulárního adjuvans a imunitního antigenu [15]. IgGFc interaguje s FcRn na povrchu imunitních buněk a účastní se transportu IgG přes slizniční povrchy, čímž zlepšuje imunogenicitu Fc-fúzovaných proteinů u savců [16]. Bylo popsáno, že IgGFc fúzní proteiny tvoří stabilní dimery prostřednictvím disulfidových vazeb v Fc pantové oblasti, aby se zvýšil poločas a stabilita rekombinantních proteinů, čímž se zlepšila buněčná, slizniční a humorální imunitní odpověď [17,18]. Nové vakcíny zprostředkované IgGFc byly úspěšně aplikovány na virus chřipky A (HA-HuFc) [19] a virus moru prasat (CSFV-E2Fc) [20].

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Vhodná povrchová úprava umožňuje nanočásticím stabilně pobývat v krevním oběhovém systému [21]. Feritin (Ft), charakterizovaný velkou povrchovou plochou a dutou sférickou strukturou, tvoří nanočástice 24 identických polypeptidů tím, že se samosestaví s řadou exprimovaných fúzních proteinů, což podporuje rozpoznání antigenu a jeho příjem buňkami prezentujícími antigen. navození silné imunitní odpovědi [22,23]. Feritin je široce používán při vývoji vakcín. Kovalentní integrace antigenu domény vázající receptor (RBD) spike proteinu SARS-CoV-2 a samosestaveného nehemového feritinu Helicobacter pylori vede k silné produkci neutralizačních protilátek. Feritinové proteinové nanočástice mají také silnou schopnost zlepšit stabilitu antigenu, překonat biologické bariéry a dosáhnout cíleného doručení. Protože nanovakcíny mohou být účinně zachyceny dendritickými buňkami a makrofágy [24], feritinové nanočástice jsou novou a slibnou platformou pro dodávání antigenu. V současné době jsou hlavními dostupnými vakcínami proti BVDV inaktivované vakcíny a podjednotkové vakcíny, přičemž obě vyžadují časově a pracovně náročnou vakcinaci intramuskulární injekcí. Mezitím inaktivované vakcíny produkované prostřednictvím buněk MDBK jsou náchylné k indukci bovinní neonatální pancytopenie (BNP) [25]. Podjednotkové vakcíny však prokázaly vynikající bezpečnostní profily [26]. Ukázalo se, že intranazální imunizace cílí antigeny na FcR receptor, což způsobuje slizniční a systémové imunitní reakce [15,16]. Imunitní účinky intranazální imunizace vakcínami BVDV a účinnost BVDV-E2 v kombinaci s molekulárními adjuvans (IgGFc a Ft) však zůstávají nedostatečně studovány. Proto je vývoj slizničních vakcín s proteinem BVDV-E2 pro zlepšení jejich imunitní účinnosti nejvyšší prioritou v této oblasti. V současné studii byly vakcíny podjednotky Fc nebo Ft fúzované s E2 proteinem vytvořeny v buňkách HEK293. Zjištění ukázala, že nazální vakcinace s podjednotkovou vakcínou BVDV E2Fc byla účinnější než nazální vakcinace s podjednotkovou vakcínou E2Ft, což dále podporuje náznaky, že fúzní protein E2Fc je účinnější variantou podjednotkové vakcíny.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

2. Výsledky

2.1. Exprese rekombinantních proteinů v suspendovaných buňkách HEK293

Strukturní diagramy E2, E2Ft a E2Fc jsou znázorněny na obrázku 1A. Nepřímé imunofluorescenční testy byly nejprve provedeny s použitím konzervované monoklonální protilátky (mAb) BVDVE2 pro ověření imunoexprese rekombinantních fúzních proteinů. Buňky transfekované plazmidy obsahujícími geny E2, E2Ft nebo E2Fc emitovaly fluorescenční signál, zatímco falešně ošetřené buňky fluorescenční signál nevykazovaly (obrázek 1B). To ukazuje na silnou expresi E2, E2Ft a E2Fc v buňkách HEK293. Aby se určilo, zda byly tyto proteiny sekrečně exprimovány, byly po 6 dnech shromážděny supernatanty buněk HEK293 transfekovaných plazmidy obsahujícími geny E2, E2Ft nebo E2Fc. Hladiny imunoexprese každého proteinu byly analyzovány Western blotem s protilátkou BVDV-E2. Výsledky ukázaly, že buňky transfekované plazmidy obsahujícími geny E2, E2Ft a E2Fc exprimovaly odpovídající proteiny s molekulovou hmotností 45 kDa, 60 kDa a 80 kDa, v daném pořadí (obrázek 1C). Výsledky barvení SDS-PAGE a Coomassie blue ukázaly, že pruhy každého vzorku byly konzistentní s výsledky blotu (obrázek 1D). Pro zajištění specifičnosti a přesnosti detekce proteinové imunoexprese byly nejprve provedeny pre-absorpční testy BVDV-E2 mAb a poté následovaly virové replikační testy a Western blot, aby se potvrdila specificita BVDV E2 mAb. Výsledky odhalily, že protilátka může reagovat pouze na protein BVDV-E2 (obrázek S1). Dohromady důkazy ukázaly, že rekombinantní proteiny E2, E2Fc a E2Ft byly hojně exprimovány v buňkách HEK293.

Obrázek 1. Imunoexprese a identifikace proteinů E2, E2Ft a E2Fc v buňkách HEK293. (A) Konstrukční diagramy BVDV-E2, BVDV-E2Ft a BVDV-E2Fc. (B) Detekce imunoexprese rekombinantních proteinů pomocí IFA; 48 hodin po transfekci E2, E2Fc nebo E2Ft byly buňky HEK293 fixovány na IFA. BVDV E2 monoklonální protilátka a FITC-kozí anti-myší IgG byly aplikovány jako primární a sekundární protilátka, v daném pořadí. Jádro bylo obarveno DAPI (modrá). Lišta měřítka představuje 20 µm. (C) Detekce purifikovaných rekombinantních proteinů pomocí Western blotu. (D) Identifikace purifikovaných rekombinantních proteinů pomocí SDS-PAGE.

2.2. Aktivace APC-Fc RI pomocí BVDV-E2Fc

Antigenové rozpoznání BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) makrofágy hraje důležitou roli v aktivaci imunitní odpovědi. Aby bylo možné detekovat aktivační účinek fúzního proteinu na imunitní systém, byla in vitro ověřena rozpoznávací funkce a fagocytární aktivita fúzního proteinu bovinními alveolárními makrofágy (BAM). Výsledky ukázaly, že CD64 (Fc RI), detekovaný Cy3-značenými kozími anti-králičími IgG protilátkovými (červenými) markery, byl lokalizován v cytoplazmě a buněčné membráně u bovinních makrofágů. E2Fc byl detekován pomocí kozího anti-myšího IgG (zelená fluorescence). Snímky byly sloučeny pro analýzu společné lokalizace CD64 (Fc RI) a E2Fc v bovinních alveolárních makrofázích (žlutá barva; obrázek 2A). Naproti tomu CD64 se nelokalizoval společně s E2 nebo E2Ft. Výsledky ukázaly, že translokace E2Fc fúzního proteinu přes slizniční bariéru byla zprostředkována FcRI.

Obrázek 2. Aktivace APC-Fc RI pomocí BVDV-E2Fc. (A) Ko-lokalizační analýza CD64 (Fc RI) s E2Fc proteinem na BAM byla detekována konfokální mikroskopií. CD64 (Fc RI) na BAM byl obarven králičí anti-CD64 a Cy{10}}značenou kozí anti-králičí IgG jako primární a sekundární protilátkou.

Fagocytóza, příjem částic makrofágy, byla měřena jako rychlost fagocytózy. Míra fagocytózy mikrokuliček konjugovaných s FITC, proteinu E2, E2Ft a E2Fc u hovězích alveolárních makrofágů byla 28,9 %, 55,6 %, 57,1 % a 65,6 %. Jinými slovy, rychlost fagocytózy E2Fc byla vyšší než u E2Ft, což dále prokázalo, že záchyt antigenů monocyty byl dokončen vazbou specifického receptoru na jeho povrchu s odpovídajícími ligandy. Bovinní alveolární makrofágy však neměly žádné receptory pro proteiny E2 a E2Ft a cizí tělesa odstraňovaly pouze fagocytózou, což je nejzákladnější obranná metoda těla (obrázek 2B).

2.3. Silné slizniční a humorální imunitní odpovědi indukované E2Fc in vivo

Postup imunizace telat je znázorněn na obrázku 3A. Hladiny IgA a SIgA produkované telaty imunizovanými fúzním proteinem byly detekovány nepřímou ELISA. Vzorky séra, stolice a nosní sliznice byly odebrány a detekovány komerční soupravou ELISA. Skupina imunizovaná E2Fc vykazovala nejvyšší hladiny IgA a SIgA v séru a sliznici, a to jak u intramuskulárně, tak slizničně imunizovaných zvířat (p < 0.01) (obrázek 3B, C). Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v hladinách IgA mezi E{7}}E{8}}imunizovanou skupinou a E2Ft imunizovanou skupinou, ale lišily se v hladinách SIgA (p < 0,05). Závěrem lze říci, že fúzní protein E2Fc byl schopen vyvolat silnější slizniční a humorální imunitní reakce než jiné proteiny.

2.4. E2Fc může vyvolat silnější imunitní odpověď T-buněk (Th1 typ) proti BVDV ve srovnání s E2Ft in vivo

Cytokin IFN- typu Th{{0}} exprimovaný T buňkami a NK buňkami zprostředkovává buněčnou imunitu, která je nezbytná pro odstranění viru. K detekci distribuce CD4+ a CD8+ T buněk exprimujících IFN u telat byly 35 dní po imunizaci izolovány lymfocyty z PBMC telat. Lymfocyty byly stimulovány inaktivovaným BVDV a následně byla aplikována průtoková cytometrie k identifikaci IFN- -sekrečních CD4+ a CD8+ T buněk. Skupiny imunizované sliznicí s E2Fc a E2Ft vykazovaly významně vyšší podíly IFN- -sekretujících CD4+ a CD8+ T-buněk ve srovnání se skupinou E2. Skupina, která byla sliznicí imunizována E2Fc, měla vyšší hladinu IFN- -sekretujících CD3+ odvozených CD8+ T buněk než skupina imunizovaná inaktivovaným BVDV (p < 0,05) (obrázek 4). Mezi skupinami s E2Fc imunizovaným sliznicí a s inaktivovaným BVDV však nebyl pozorován žádný významný rozdíl v IFN- -vylučujících CD3+ odvozených CD4+ T buňkách. V souhrnu jak intramuskulární injekce, tak slizniční imunizace pomocí E2Fc indukují silnější imunitní reakce T-buněk (typ Th1) proti BVDV ve srovnání s E2Ft.

Obrázek 3. Vývojový diagram experimentů s imunizací telat a slizniční a humorální imunitní reakce indukované E2Fc in vivo. (A) Vývojový diagram konstrukce podjednotkové vakcíny BVDV a experimentální imunizace telat. (B, C) Měření hladin (B) IgA a (C) sekrečního IgA v nosních výtěrech, stolici a vzorcích séra odebraných 14. den po sekundární imunizaci pomocí ELISA. n=5, * p < 0.05 a ** p < 0,01

Obrázek 4. Imunitní reakce T-buněk proti BVDV in vivo. Procento (A) CD4+ IFN- + T buněk a (B) CD8+ IFN- + T buněk po stimulaci v bovinních mononukleárních buňkách periferní krve. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 a ** ** p < 0,0001.

2.5. Imunizace rekombinantními podjednotkovými vakcínami zvyšuje obsah cytokinů typu Th1-

Abychom ověřili účinek rekombinantní podjednotkové vakcíny na buněčné imunitní odpovědi, analyzovali jsme hladiny proliferace lymfocytů a cytokinů v periferní krvi imunizovaných telat. Nejprve byla telatům odebrána antikoagulancia 49 dní po imunizaci. Lymfocyty byly po separaci stimulovány ultrafialovým zářením inaktivovaným BVDV a byly měřeny korelační indexy. Ve srovnání se skupinou PBS byly indexy stimulace lymfocytů (SI) skupin imunizovaných podjednotkovými vakcínami (E2, E2Fc a E2Ft) všechny zvýšeny v různé míře, s nejvyšším indexem stimulace lymfocytů (p < 0). 001) ve skupinách imunizovaných E2Fc a inaktivovaných vakcínách (obrázek 5A). Kromě toho byly pro detekci hladin cytokinů typu Th1- a Th2- v periferní krev imunizovaných telat. Ve srovnání s telaty ošetřenými PBS byly hladiny IFN- a IL-2 exprimované u imunizovaných telat významně vyšší než IL-4 49 dní po imunizaci. Hladiny IFN- byly vyšší ve skupině IN-E2Fc než ve skupině s inaktivovanou vakcínou (p < 0,05), ale nebyl žádný rozdíl v IL-2 a IL-4 mezi IM-E2Fc a skupiny s inaktivovanou vakcínou (obrázek 5B–D). Tyto výsledky naznačují, že podjednotková vakcína IN-E2Fc významně podporuje buněčnou imunitní odpověď typu Th1- u telat.

Obrázek 5. Zvýšení obsahu cytokinů typu Th1- po imunizaci rekombinantními podjednotkovými vakcínami. (A) Buněčná proliferace lymfocytů periferní krve telat po imunizaci 49 dnů byla detekována soupravou pro stanovení proliferace lymfocytů. (B–D) Th1 a Th2 cytokiny v supernatantech lymfocytů byly detekovány bovinní IFN-, IL-2, IL-4 dvojitou protilátkou sendvičovou ELISA soupravou. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01 a *** p < 0.00

2.6. Protilátky specifické proti BVDV mohou být silně indukovány rekombinantními podjednotkovými vakcínami E2Ft a E2Fc in vivo

BVDV-specifické protilátky byly detekovány pomocí ELISA, aby se prozkoumala humorální imunitní odpověď indukovaná E2, E2Ft a E2Fc podjednotkovými vakcínami. BVDV-specifické protilátky nemohly být detekovány u všech telat před imunizací. Hladiny protilátek indukovaných E2Ft a E2Fc podjednotkovými vakcínami byly významně vyšší než hladiny ve skupině E2 21 dní po zahájení (první dávce) imunizace (p < 0.00 1). Hladiny protilátek pro slizniční imunitu po 35 dnech (14 dnů po druhé dávce) a 49 dnech (14 dnech po třetí dávce) se významně lišily mezi skupinami E2Ft a E2 (p < 0,05). Navíc E2Fc byl významně vyšší než E2 (p < 0,001). Hladina protilátek u slizniční imunizované skupiny (skupiny IN-E2Ft a IN-E2Fc) byla vyšší než u skupiny s intramuskulární injekcí (skupiny IM-E2Ft a IM-E2Fc) a hladina protilátek ve skupině s inaktivovanou vakcínou nebyla významně odlišné od skupiny IN-E2Fc (obrázek 6). Celkově vzato, rekombinantní E2Ft a E2Fc podjednotkové vakcíny byly schopny vyvolat silné humorální imunitní reakce a slizniční imunita byla lepší než u intramuskulární injekce, což ukazuje, že rekombinantní E2Fc a E2Ft podjednotkové vakcíny byly vysoce antigenní.

Obrázek 6. Detekce protilátek ve vzorcích séra imunizovaných telat metodou ELISA v den 0, 21., 35. a 49. den po imunizaci. n=5, * p < 0.05 a *** p < 0,001

2.7. Neutralizační protilátky proti BVDV indukované rekombinantními podjednotkovými vakcínami in vivo

Vzorky krve byly odebrány z jugulární žíly telat v 0, 21., 35. a 49. den po první imunizaci. Vzorky séra byly separovány asepticky a inaktivovány ve vodní lázni při 56 °C po dobu 30 minut. Pro stanovení hladin protilátek v separovaném séru byly provedeny neutralizační testy. Neutralizační protilátky proti BVDV byly detekovány ve skupinách imunizovaných sliznicí pomocí rekombinantních podjednotkových vakcín, s titrem E2Fc neutralizační protilátky až 1:64. To je srovnatelné s inaktivovanou vakcínou a lepší než u intramuskulárně injikovaných E2Ft a E2Fc rekombinantních podjednotkových vakcín (obrázek 7).

Obrázek 7. Detekce neutralizačních protilátek ve vzorcích séra imunizovaných telat v den 0, 21., 35. a 49. den po imunizaci. Vzorky inaktivovaného séra byly naředěny na poměr a preinkubovány s 200 TCID50 BVDV XZ02 po dobu 1 hodiny. Vzorky séra byly následně přidány k buňkám v 96-jamkových destičkách a inkubovány po dobu 72 hodin. Králičí anti-E2 protilátka a FITC-konjugovaný kozí anti-králičí IgG byly použity jako primární a sekundární protilátky. n=5, * p < 0,05 a ** p < 0,01

3. Diskuse

Bylo publikováno, že protein E2 exprimovaný v savčích buňkách je účinnější při neutralizaci ochrany proti BVDV než protein E2 získaný z bakulovirového hmyzího expresního systému (brE2) [27]. Suspenzní kultura savčích buněk se vyznačuje jednodušším procesem a vyšším výtěžkem [28]. Suspendované buňky HEK293 jsou schopny růstu za bezsérových podmínek a počet buněk je mnohonásobně vyšší než u adherentní kultury, kterou lze použít pro produkci protilátek ve velkém měřítku [29]. Účinnost exprese pcDNA3.1 v kombinaci s eukaryotickým suspenzním buněčným přechodným expresním systémem použitým v této studii byla relativně vysoká a rekombinantní protein mohl být shromážděn šest dní po transfekci, s koncentrací až 30 mg·l −1, což byla dostatečná pro následnou aplikaci zvířatům.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Virus bovinního virového průjmu napadá hlavně horní cesty dýchací a trávicí trakt, což způsobuje výtok z nosu, kašel, dušnost, zvýšení tělesné teploty a leukopenii a po vstupu viru do krve následuje virémie. Inhalační intranazální očkování by proto mohlo poskytnout účinnější ochranu než vakcíny, které jsou dodávány přímo do míst virové infekce. Nedávno se ukázalo, že intranazální imunizace může prezentovat antigeny receptorům FcR a vyvolat slizniční a systematické imunitní odpovědi [16]. Kromě toho byl bovinní IgG1Fc schopen vázat se na bovinní FcR, vysokoafinitní receptor pro IgG [30]. Naše výsledky poskytly důkaz, že Fc z hovězího IgG1 by se mohl vázat s Fc RI na bovinních alveolárních makrofázích (BAM) pro dosažení transmukózního transportu. To by mohlo prodloužit životnost fúzního proteinu v těle a podpořit produkci specifických protilátek. Naše výsledky odhalily, že hladina SIgA indukovaná slizničně imunizovaným E2Fc byla významně vyšší než hladina slizničně imunizovanou E2 (p < 0.{{30}}1). Byl však pozorován pouze malý rozdíl mezi skupinou E2Fc s intramuskulární injekcí a skupinou E2 imunizovanou sliznicí. To může být způsobeno skutečností, že jak sliznice tenkého střeva, tak mezenterické lymfatické uzliny uvolňují malé množství SIgA v reakci na intramuskulární injekci E2Fc s adjuvans 1313VG. Hladiny IFN- vyvolané slizniční imunizací s E2Fc byly významně vyšší než hladiny slizniční imunizace s E2 (p < 0,01), intramuskulární imunizace s E2Fc a slizniční imunizace s E2Ft. Hladiny IL-2 vyvolané slizniční imunizací s E2Fc byly významně vyšší než hladiny slizniční imunizace s E2 a intramuskulární imunizace s E2Ft (p < 0,01). V dalším kroku byly detekovány celkové hladiny protilátek po třetí imunizaci. Výsledky ukázaly, že slizniční imunizace pomocí E2Fc indukovala významně vyšší hladiny celkových protilátek ve srovnání se slizniční imunizací s E2 (p < 0,001), zatímco hladiny protilátek indukované intramuskulárně injikovaným E2Fc a slizničně imunizovaným E2 byly srovnatelné s intramuskulárně injikovaným E2Ft skupina. Celkové imunitní účinky slizniční imunizace E2Fc podjednotkové vakcíny byly lepší než účinky intramuskulární imunizace. Slizniční imunizace E2Fc nejen indukovala sekreci SIgA, ale také vyvolala specifickou buněčnou imunitní odpověď typu Th1- a humorální imunitní odpověď.

Bylo publikováno, že CSFV E2 glykoprotein vystavený na povrchu feritinových nanočástic indukoval silnou expresi vrozených imunitních cytokinů IL-4 a IFN- u králíků [31]. Bylo také prokázáno, že nanočásticová vakcína vyvinutá kovalentní vazbou samosestaveného feritinu na receptorovou vazebnou doménu (RBD) SARS-CoV-2 vyvolává silnou humorální a buněčnou imunitní odpověď [24]. Nosní dutina je bohatá na lymfoidní tkáň asociovanou se sliznicí a ukázali jsme, že hladiny SIgA indukované slizničně imunizovaným E2Ft byly vyšší než hladiny E2 (p < 0.05). CD4+ a CD{15}} T buňky byly významně vyšší ve skupině E2Ft imunizované sliznicí než ve skupině E2 (p < 0,01). CD4+ a CD8+ T buňky hrají zásadní roli v obraně proti virové infekci [32]. Výsledky neutralizačního testu a testu protilátek také ukázaly, že slizniční imunizace pomocí E2Ft byla účinnější než imunizace intramuskulárními E2Ft a E2. Bylo to pravděpodobně proto, že systém rozpoznávání a prezentace antigenu organismu účinně fagocytoval feritin (E2Ft) s 24 podjednotkovými polymery, což vedlo k citlivé a účinné protilátkové odpovědi in vivo. Protilátky jsou vylučovány plazmatickými buňkami a hladiny neutralizačních protilátek jsou důležitým indikátorem pro detekci imunitních účinků. Když je potence neutralizačních protilátek vakcíny proti BVDV vyšší než 1:24, znamená to, že vakcína je imunogenní [33].

V této studii byly provedeny neutralizační testy k vyhodnocení hladin neutralizační protilátky indukované E2 rekombinantními proteiny. Proto byla odebrána jugulární žilní krev imunizovaných telat, aby se detekovala hladina IgG protilátek v séru. Výsledky ukázaly, že všechna imunizovaná telata produkovala různé stupně neutralizačních protilátek 14 dní po druhé imunizaci. Hladiny neutralizačních protilátek u telat slizničně imunizované skupiny E2Fc a skupiny s inaktivovanou vakcínou významně vzrostly a zůstaly na 1:64 14 dní po třetí imunizaci (titry neutralizačních protilátek byly detekovány až do šestého týdne). Nicméně stojí za zmínku, že hladiny neutralizačních protilátek slizničně imunizovaných E2 a E2Ft a intramuskulárně imunizovaných E2Fc a E2Ft skupin byly udržovány mezi 1:8 a 1:16. Usuzujeme, že antigeny E2Fc rekombinantní vakcíny jsou pomalu uvolňovány Fc receptorem, což způsobuje prodloužené humorální a buněčné imunitní reakce. Naproti tomu další čtyři podjednotkové vakcíny se v těle nacházejí krátce kvůli nedostatku odpovídajícího receptoru. K dosažení očekávaných imunitních účinků tedy může být zapotřebí přeočkování nebo změna adjuvans.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

4. Materiály a metody

4.1. Virus a buňky

Typ lb kmen BVDV XZ02 (přírůstkové číslo GenBank: MF278652) byl izolován z Tibetu a kultivován s použitím buněk hovězí ledviny Madin-Darby (MDBK). V naší laboratoři byl zachován virus prasečí epidemické diarey (PEDV). Buňky MDBK byly zakoupeny od ATCC (ATCC-CCL-22) a udržovány v DMEM (kat. č. SH302403.01, HyClone, Shanghai, Čína) a bovinní alveolární makrofágové buňky (BAM) byly udržovány v RPMI{ {8}} (kat. č. SH30027, Cytiva, Šanghaj, Čína); všechna média obsahovala 10 % tepelně inaktivovaného koňského séra (kat. č. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA) a byla inkubována při 37 ◦C ve zvlhčeném inkubátoru s 5 % CO2. Suspendované buňky HEK293 byly zakoupeny od ATCC (ATCC CRL-1573) a kultivovány v médiu KOP293 bez séra (kat. č. M21201121A, KAIRUI-biotech, Zhuhai, Čína).

4.2. Protilátky a testovací soupravy

V této studii byly použity následující protilátky a testovací soupravy: anti-BVDV E2 protilátka (kat. č. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); HRP-kozí anti-myší protilátka (kat. č. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-kozí anti-myší protilátka (kat. č. AS008, ABClonal, Boston, MA, USA); FITC-kozí anti-myší protilátka (kat. č. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (Fc RI) protilátka (kat. č. abs135850, Absin, Shanghai, Čína); Alexa Fluor® 488 kozí anti-myší IgG protilátka (kat. č. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-kozí anti-králičí IgG protilátka (kat. č. ab6939, Abcam, Cambridge, UK); FITC konjugované mikrokuličky (kat. č. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); protilátka FITC-CD4 (kat. č. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8 protilátka (kat. č. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN- protilátka (kat. č. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); FITC-kozí anti-králičí IgG protilátka (kat. č. AS011, ABClonal, Boston, MA, USA). Soupravy a činidla zahrnují soupravu pro detekci protilátek BVDV-E2 (kat. č. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, Čína); IgA detekční souprava (kat. č. 177090b, CAMILO, Nanjing, Čína); Detekční souprava SIgA (kat. č. 177053b, CAMILO, Nanjing, Čína); IFN-detekční souprava (kat. č. 177020b, CAMILO, Nanjing, Čína); detekční souprava IL-2 (kat. č. 177028b, CAMILO, Nanjing, Čína); detekční souprava IL-4 (kat. č. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Čína); transfekční činidlo TA-293 (kat. č. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Čína); Médium pro separaci lymfocytů (kat. č. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Konstrukce plazmidů

Zkrácená E2 (dále označovaná jako E2) byla vytvořena odstraněním transmembránové oblasti E2 (přírůstkové číslo sekvence genu: MF278652) pomocí webového nástroje TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ přístupný dne 12. ledna 2023) a přidání histidinové značky na C-konec (obrázek 1A). Genová sekvence je uvedena v doplňkovém materiálu S1. E2Fc plazmid byl zkonstruován přidáním Fc fragmentu obsahujícího pantovou oblast hovězího IgG1 (přístupové číslo: x62916.1) k C-konci E2 s ordinální polohou E2-syntetického flexibilního peptidu-pantové oblasti -CH2-doména CH3-6 × His [20]. Genová sekvence je uvedena v doplňkovém materiálu S2. Plazmid E2Ft byl zkonstruován navázáním E2 na feritin Helicobacter pylori (zbytky 5–167) přes linker (Gly)3Ser [34]. Genová sekvence je uvedena v doplňkovém materiálu S3. Signální peptid IL-2 byl přidán k N-konci E2, E2Fc a E2Ft, aby se usnadnila sekreční exprese [35]. Cílové geny (E2, E2Ft a E2Fc) byly klonovány do pcDNA3.1 s BamHI a Xhol, v daném pořadí.

4.4. Proteinová exprese a purifikace

Přibližně 10{{30}} ml suspendovaných buněk HEK293 v exponenciální fázi (přibližně 2~4 x 106 buněk/ml) bylo transfekováno odpovídajícími plazmidy. Stručně řečeno, 5 ml KPM (transfekční pufr) a 100 ug sterilní plazmidové DNA bylo přidáno do sterilní centrifugační zkumavky a 5 ml KPM a 500 ul TA-293 (kat. č. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, Čína ) transfekční činidla byla přidána do další sterilní centrifugační zkumavky. Poté bylo k naředěnému plazmidu přidáno zředěné transfekční činidlo a důkladně promícháno. Po inkubaci po dobu 10 minut při teplotě místnosti byl k buňkám přidán komplex DNA-transfekční činidlo, doprovázené třepáním. Buňky byly inkubovány ve zvlhčeném inkubátoru při 37 °C s 5% CO2 při rychlosti třepání 140 ot./min. Buňky byly sklizeny šest dní po transfekci centrifugací po dobu 30 minut při 12,{20} rpm/min a filtrovány přes 0,22 mm filtr, aby se odstranily zbytky buněk. Niklové afinitní chromatografické kolony (kat. č. 17531801, GE, Boston, MA, USA) byly použity pro afinitní čištění proteinů E2, E2Ft a E2Fc s histidinem (His) [36]. Stručně, 100 ml vzorky byly přidány do afinitních kolon rychlostí 1 ml/min. Kolony byly následně promyty pěti objemy kolony (CV) pufru A (0,1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) rychlostí 1 ml/min. Nakonec byly koncentrační gradienty imidazolu (od 0 do 500 mM) ponechány protékat kolonou rychlostí 1 ml/min, aby se shromáždila kapalina odpovídající hlavnímu píku. Koncentrace proteinu byly kvantifikovány pomocí soupravy pro detekci proteinů BCA. Shromážděné proteiny byly dále použity pro analýzu Western blot.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

4.5. Western Blot

Proteiny byly separovány pomocí SDS-PAGE. Po přenesení na NC filtrační membránu byly proteiny blokovány 2% sušeným odstředěným mlékem přes noc při 4 °C a následně inkubovány s anti-BVDV E2 protilátkou (kat. č. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) po dobu 2 hodin při pokojové teplotě. . Po trojnásobném promytí TBS-T byly membrány inkubovány s HRP-kozí anti-myší protilátkou (kat. č. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po trojnásobném promytí TBS-T byl chemiluminiscenční systém ECL použit k detekci imunoexprese proteinu.

4.6. Nepřímá imunofluorescence

Pro imunofluorescenční detekci imunoexprese rekombinantních proteinů byly buňky HEK293 transfekovány plasmidy exprimujícími E2, E2Ft a E2Fc; 48 hodin po transfekci byly buňky fixovány paraformaldehydem po dobu 15 minut. Po trojnásobném promytí PBS byly buňky permeabilizovány 0,5% Trition-X100 po dobu 15 minut. Po intenzivním promytí PBS byly buňky následně blokovány 2% BSA a inkubovány s 1:500 zředěnou BVDV E2 monoklonální protilátkou (připravenou v naší laboratoři) při 37 ◦C po dobu 2 hodin. Cy3 (kat. č. AS008, ABklonal, Boston, MA, USA) nebo FITC-konjugované kozí anti-myší protilátky (kat. č. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) byly aplikovány jako sekundární protilátka. Jádra byla barvena DAPI po dobu 10 minut při teplotě místnosti. Proteiny byly vizualizovány konfokální mikroskopií (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Německo) [37].

4.7. APC-cílení E2Fc rekombinantního fúzního proteinu

Pro potvrzení vazby fúzního proteinu BVDV-E2Fc na FcRI na bovinních alveolárních makrofázích (BAM) byla provedena imunofluorescenční kolokalizační analýza. Stručně, 3 ug purifikovaného E2, E2Ft nebo E2Fc byly přidány k hovězím alveolárním makrofágům. Po inkubaci po dobu 12 hodin při 37 ◦C byly buňky promyty 0,1% BSA ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) a fixovány methanolem/acetonem (1:1) při 20 ◦ C. Buňky byly následně permeabilizovány 0,5% Trition-X100 po dobu 15 minut a blokovány 2% BSA při 37 °C po dobu 2 hodin. Poté byly buňky třikrát promyty PBS a inkubovány s BVDV E2 monoklonální protilátkou (myší zdroj; připraveno v naší laboratoři) a bovinní CD64 (Fc RI) polyklonální protilátkou (kat. č. abs135850, Absin, Shanghai, Čína) po dobu 2 h. Buňky byly třikrát promyty PBS a překryty Alexa Fluor® 488 kozím anti-myším IgG (kat. č. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) a kozí anti-králičí IgG protilátkou značenou Cy3- (kat.č. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Jádra byla obarvena DAPI. Snímky byly vyfotografovány pomocí imunofluorescenční kolokalizace (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Německo).

4.8. Stanovení fagocytární rychlosti bovinních alveolárních makrofágů

Pro stanovení účinků rekombinantních proteinů E2, E2Ft a E2Fc na fagocytózu bovinních alveolárních makrofágů (BAM) byly bovinní alveolární makrofágy v koncentraci 1 × 106 buněk/ml preinkubovány s rekombinantními proteiny E2, E2Ft nebo E2Fc (všechny koncentrace byly upraveny na 350 ng/ml) po dobu 4 hodin. Po trojnásobném promytí PBS byl do každé jamky přidán 10 µL mikrokuliček konjugovaných s FITC (kat. č. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) a 990 ul média RPMI{15}} . Po 2 hodinách inkubace byly buňky promyty PBS, aby se odstranily extracelulární mikrokuličky konjugované s FITC. Adherentní makrofágy byly štěpeny trypsinem (Gibco) obsahujícím 0,05 % EDTA a štěpení bylo ukončeno kompletním médiem 1640 po úplném štěpení. Buňky byly poté přidány do horní vrstvy 10 ml PBS s 0,45 g glukózy a 0,3 g BSA, následovala gradientová centrifugace při 400 x g po dobu 10 minut. Oddělené buňky byly dvakrát promyty PBS a resuspendovány s 800 ul PBS. Intenzita fluorescence při 488 nm byla stanovena průtokovým cytometrem Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA).

4.9. Postup přípravy vakcíny a imunizace

E2, E2Ft a E2Fc exprimované HEK byly emulgovány s adjuvans IMS 1313VG (Seppic, Francie) ve stejných poměrech na konečnou koncentraci proteinu 200 µg/ml a skladovány při 4 ◦C po inspekce kvality. BVDV-E0 a BVDV-E2 protilátka-negativní (kat. č. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína), 3-měsíční telata (n=35) byla rozdělena do sedmi stejných skupin. Telata ve čtyřech skupinách byla nazálně-slizničně imunizována (in) PBS, E2, E2Ft a E2Fc, v daném pořadí. Telatům ve zbývajících třech skupinách byly intramuskulárně injikovány (im) vakcíny inaktivované E2Ft, E2Fc a BVDV jako pozitivní kontrola (kat. č. 202002003, Huaweit, Jiangsu, Čína). Telata byla vakcinována ve dnech 1, 21 a 35 experimentu a každé tele bylo naočkováno 1 ml vakcíny s koncentrací proteinu 200 ug/ml. Krev byla telatům odebrána 1., 21., 35. a 49. den experimentu pro jiné ukazatele (obrázek 3A). Všechny experimentální protokoly byly schváleny Etickou komisí pro výzkum College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Hubei, Čína (č. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Produkce IgA ve stolici a séru

Vzorky nosních výtěrů, stolice a séra telat byly odebrány 14. den po sekundární imunizaci. Čerstvé kravské výkaly byly zředěny do 15% fekální suspenze s PBS, suspenze byla centrifugována při 18,000xg při 4 °C po dobu 30 minut a supernatant byl odebrán pro pozdější použití. Nosní výtěry byly odebrány rotací sterilního vatového tamponu hluboko do nosní dutiny krávy po dobu 6–8 otáček. Výtěry byly vloženy do zkumavky PBS obsahující 1% penicilin-streptomycin a důkladně promíchány. Vzorky byly centrifugovány při 18,{10}}× g při 4 °C po dobu 10 minut a supernatant byl odebrán pro pozdější použití. Vzorky hovězí krve byly odebírány pomocí zkumavky s antikoagulačním činidlem obsahujícím kyselinu ethylendiamintetraoctovou (EDTA)-- a vzorky séra byly získány centrifugací vzorků krve při 4 °C a 400 g po dobu 5 minut. IgA (kat. č. 177090b, CAMILO, Nanjing, Čína) a SIgA byly detekovány pomocí soupravy ELISA (kat. č. 177053b CAMILO, Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce.

4.11. Analýza průtokovou cytometrií

Frekvence IFN - -produkujících CD3+ CD4+ a CD3+ CD8+ T buněk mezi CD3+ lymfocyty v krvi byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Vzorky byly odebrány 14 dní po posilovací imunizaci [36]. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly resuspendovány a zředěny na 1 × 106 buněk/ml kompletním médiem RPMI{10}}, stimulovány UV-inaktivovaným BVDV XZ02 (MOI=0.1) a inkubovány při 37 ◦C s 5% CO2 po dobu 72 hodin. Concanavalin A (Con A) (5 ug/ml; Sigma) byl použit jako pozitivní kontrola. Inhibitor transportu proteinu brefeldin A (BFA, 3 ug/ml, eBioscience) byl přidán ke všem vzorkům 12 hodin před sklizní buněk, aby se zablokovala sekrece IFN-. Množství 200 ul buněk bylo přeneseno do zkumavek FCM a barveno FITC-značenou CD4 protilátkou (kat. č. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) po dobu 30 minut při 4 °C ve tmě. Po trojnásobném promytí PBS byly buňky inkubovány s R-PE-značenou CD8 protilátkou (kat. č. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Po trojím promytí byly buňky inkubovány s myší anti-bovinní IFN- protilátkou (kat. č. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) po dobu 20 minut ve tmě pro intracelulární barvení cytokinů. Po promytí byly buňky resuspendovány v PBS obsahujícím 1 % FBS. Průtoková cytometrie byla provedena průtokovým cytometrem FACS Caliber (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a data byla shromážděna a analyzována, jak bylo popsáno dříve [38].

4.12. Proliferace lymfocytů a detekce cytokinů

Antikoagulované mononukleární buňky periferní krve (PBMC) každého telete byly izolovány za použití média pro separaci lymfocytů (kat. č. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) 49. den po imunizaci. Bovinní lymfocyty periferní krve byly zředěny 10% FBS 1640 médiem na 1 x 106 buněk/ml. Poté bylo 100 ul zředěných buněk přidáno do každé jamky 96-jamkové destičky a stimulováno UV-inaktivovaným BVDV, konkanavalinem (pozitivní kontrola) nebo kultivačním médiem (negativní kontrola). Po 72 hodinách inkubace při 37 °C s 5 % CO2 bylo do každé jamky přidáno 30 µl MTS a buňky pokračovaly v kultivaci při 37 °C po dobu 1 hodiny podle pokynů výrobce. Absorbance při 492 nm byla měřena automatickým analyzátorem mikrodestiček. Titr proliferace lymfocytů každého vzorku byl stanoven stimulačním indexem (SI). Vypočtené SI=(OD vzorku-OD slepé kontroly)/(OD negativního vzorku-OD slepé kontroly) [39]. Interferon (IFN)-, interleukin (IL)-2 a interleukin (IL)-4 byly detekovány pomocí souprav ELISA. Stručně, PBMC byly izolovány a zředěny na 4 x 106 buněk/ml médiem RPMI 1640 obsahujícím 10% FBS a umístěny do 24-jamkových destiček pro tkáňové kultury. Buňky byly stimulovány inaktivovaným BVDV XZ02 (MOI=1) po dobu 48 hodin při 37 °C a následně byl odebrán supernatant. IFN- (kat. č. 177020b, CAMILO, Nanjing, Čína), IL-2 (kat. č. 177028b, CAMILO, Nanjing, Čína) a IL-4 (kat. č. 1770131b, CAMILO, Hladiny Nanjing, Čína) byly detekovány pomocí odpovídajících souprav ELISA podle pokynů výrobce. Obsah IFN-, IL-2 a IL{41}} ve vzorku byl vypočten pomocí standardní křivky.

4.13. Sérologické testy

K detekci E2/E0 protilátek byly odebírány vzorky krve od každého telete ve dnech 0, 21, 35 a 49 po imunizaci. Vzorky séra byly odebrány centrifugací krevních vzorků při 1000 x g po dobu 20 minut. Vzorky séra byly zpracovány podle požadavků soupravy pro detekci protilátek BVDV E2 (kat. č. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína). Mikrodestičky potažené antigenem BVBV E2 byly ekvilibrovány po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Poté bylo na mikrodestičku přidáno 50 ul vzorků negativní kontroly, pozitivní kontroly a séra. Množství 50 ul detekční protilátky značené křenovou peroxidázou (HRP) bylo následně přidáno na mikrodestičku a inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut. Po pětinásobném promytí promývacím pufrem byl přidán chromogenní roztok pro měření absorbance čtečky mikrodestiček při 450 nm pro stanovení hladiny E2 protilátky v každé imunizační skupině. Pro detekci hladiny neutralizačních protilátek ve vzorcích séra byla použita metoda fixního virového ředění séra. Stručně řečeno, vzorky zcela inaktivovaného imunitního séra byly naředěny 2-1 až 2-12 a 50 ul séra v každém titru ředění bylo přidáno do 96-jamkových destiček. Následně bylo do každé jamky přidáno 50 ul zředěného virového roztoku obsahujícího 200 TCID50- BVDV XZ02 virus. Destičky byly jemně protřepány a promíchány. Po 1 hodině inkubace při 37 ◦C byly MDBK buňky o koncentraci 5 × 105 buněk/ml přidány do 96-jamkových destiček a inkubovány při 37 ◦C ve zvlhčeném inkubátoru s 5% CO2 po dobu 72 hodin. K detekci neutralizačního účinku vzorků séra byly buňky ošetřeny E2-specifickou protilátkou jako primární protilátkou (kat. č. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) a FITC-konjugovaným kozím anti-králičím IgG jako sekundární protilátka, (kat. č. AS011, ABClonal, Boston, MA, USA). Typický zelený fluorescenční signál indikoval nepřítomnost neutralizace. Fotografie byly pořízeny pod fluorescenčním mikroskopem (TE2000, Nikon, Tokio, Japonsko). Sérový neutralizační titr byl vypočten podle Reed-Muenchovy metody a maximální ředění séra, které by mohlo zcela inhibovat fluorescenci, bylo stanoveno jako neutralizační titr séra.

4.14. Specificita Detekce BVDV E2 monoklonální protilátky

Nejprve byly provedeny pre-absorpční testy BVDV E2 monoklonální protilátky, následovaly virové replikační testy a Western blot, aby se potvrdila specificita BVDV E2 mAb. Pro test virové replikace bylo 400 TCID50 BVDV preinkubováno s PBS a 100 ug nebo 200 ug E2 mAb při 37 °C po dobu 1 hodiny, v daném pořadí. Po inkubaci byl předem ošetřený BVDV naočkován do buněk MDBK a buňky byly kultivovány při 37 °C ve zvlhčeném inkubátoru. Buňky byly shromážděny při 18 nebo 24 hpi (hodina po infekci) a RNA byla extrahována činidlem TRIZOL. Pro stanovení relativní exprese genu BVDV E2 byla provedena RT-qPCR. Pro Western blot test byla E2 mAb preinkubována s Tween20, PEDV S proteinem nebo BVDV E2 proteinem v TBS-T po dobu 2 h při 4 °C, v daném pořadí. Předem ošetřená E2 mAb byla podrobena testu Western blot jako primární protilátka pro detekci reakce na BVDV E2 nebo PEDV S protein.

4.15. Statistická analýza

Pro všechny analýzy byl použit statistický program GraphPad Prism. K analýze dat a vytvoření hodnot p byl použit dvoustranný nepárový t-test (*, p < 0.05; **, p < 0.{{{{101} 8}}1;***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Pokud není uvedeno jinak, data jsou uvedena jako průměr ± SD.

5. Závěry

V naší studii byly exprimovány tři rekombinantní proteiny, BVDV-E2, BVDV-E2Ft a BVDV-E2Fc, a byly vytvořeny odpovídající podjednotkové vakcíny. Testy in vivo ukázaly, že vakcína podjednotky E2Fc byla účinnější než E2Ft a E2, a to jak při slizniční, tak intramuskulární imunizaci. Potvrdili jsme, že titry neutralizačních protilátek indukované slizničně imunizovanými E2Fc a E2Ft byly 1:64 a 1:16, v daném pořadí, což dále ukazuje, že E2Fc se vázal s FcRI na bovinních alveolárních makrofázích, aby se dosáhlo transmukózního transportu. Slizniční vakcinace multivalentní E2Fc podjednotkové vakcíny hlavního epidemického kmene BVDV významně zlepšila imunitní účinky a je vhodná pro praktické použití. Naše studie poskytuje řešení časově náročné a pracovně náročné konvenční vakcinace použitím slizniční vakcíny. Protein BVDV E2 je ideálním cílem pro neutralizaci protilátek a očekává se, že fúzní proteiny E2Fc a E2Ft zkonstruované v této studii budou dále aplikovány jako bezpečné a účinné podjednotkové vakcíny proti infekci BVDV.

Reference

1. Truyers, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Program eradikace viru bovinního virového průjmu na Orknejích 2001 až 2008. Vet. Rec. 2010, 167, 566–570. [CrossRef]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Pestivirus indukující toleranci vrozené imunitní odpovědi. Biologie 2013, 41, 39–51. [CrossRef]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Genetická typizace a epidemiologické pozorování viru bovinního virového průjmu v západní Číně. Virus Genes 2011, 42, 204–207. [CrossRef]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Genomická charakterizace izolátu viru bovinního virového průjmu 1 z prasat. Oblouk. Virol. 2014, 159, 2513–2517. [CrossRef] [PubMed]

5. Deng, Y.; Slunce, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; a kol. Vysoká prevalence viru bovinního virového průjmu 1 v čínských stádech prasat. Vet. Microbiol. 2012, 159, 490–493. [CrossRef] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Song, C.; Bao, J.; Du, J. Původ a přenos viru bovinního virového průjmu typu 1 v Číně odhalený fylodynamickou analýzou. Res. Vet. Sci. 2020, 128, 162–169. [CrossRef] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. Molekulární biologie pestivirů. Adv. Virus Res. 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. Rekombinace RNA v pestivirech: Buněčné RNA sekvence ve virových genomech zdůrazňují roli hostitelských faktorů pro virovou perzistenci a letální onemocnění. RNA Biol. 2011, 8, 216–224. [CrossRef]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Krystalová struktura glykoproteinu E2 z viru bovinního virového průjmu. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2013, 110, 6805–6810. [CrossRef]

10. Williams, LBA; Fry, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP Vakcína s vektorem rekombinantního bovinního herpesviru-4 dodávaná intranazální nebulizací vyvolává u skotu titry neutralizačních protilátek. PLoS ONE 2019, 14, e0215605. [CrossRef]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; a kol. Lidské imunitní reakce vyvolané intranazální inaktivovanou vakcínou proti chřipce H5. Microbiol. Immunol. 2020, 64, 313–325. [CrossRef] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Charakteristika nosní lymfoidní tkáně (NALT) a nosní absorpční kapacita u kuřete. PLoS ONE 2013, 8, e84097. [CrossRef] [PubMed]

13. Ye, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Účinná slizniční vakcinace zprostředkovaná neonatálním Fc receptorem. Nat. Biotechnol. 2011, 29, 158–163. [CrossRef] [PubMed]

14. Pabst, R. Slizniční vakcinace intranazální cestou. Lymfatická tkáň spojená s nosem (NALT) – Struktura, funkce a druhové rozdíly. Vakcína 2015, 33, 4406–4413. [CrossRef]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Nová vakcína s fúzním proteinem RSV F-Fc snižuje poškození plic vyvolané infekcí respiračním syncyciálním virem. Antivir. Res. 2019, 165, 11–22. [CrossRef]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Izotypově specifické výsledky v zacílení Fc gama receptoru PspA pomocí fúzních proteinů jako vakcinační strategie proti infekci Streptococcus pneumoniae. Vakcína 2020, 38, 5634–5646. [CrossRef]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Pleass, RJ Fc-fúzní proteiny: Nový vývoj a budoucí perspektivy. EMBO Mol. Med. 2012, 4, 1015–1028. [CrossRef]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optimalizace na Fc pro zlepšení stability a odolnosti proti agregaci. Curr. Pharm. Biotechnol. 2016, 17, 1353–1359. [CrossRef]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, CA; Bailey, ČR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM Bezadjuvantní imunizace fúzními proteiny hemaglutinin-Fc jako přístup k vakcínám proti chřipce. J. Virol. 2011, 85, 3010–3014. [CrossRef]

20. Li, J.; Li, X.; Ma, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; a kol. Účinná slizniční vakcinace nového fúzního proteinu E2-Fc viru klasického moru prasat zprostředkovaná neonatálním Fc receptorem. Vakcína 2020, 38, 4574–4583. [CrossRef]

21. Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritiny jako nanoplatformy pro zobrazování a dodávání léků. Expert Opin. Drug Deliv. 2014, 11, 1913–1922. [CrossRef] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Samosestavující se proteinové nanočástice při návrhu vakcín. Počítat. Struktura. Biotechnol. J. 2016, 14, 58–68. [CrossRef] [PubMed]

23. Jacob, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, ČR Vývoj a aplikace syntetických afinitních ligandů pro purifikaci chřipkových antigenů na bázi feritinu. Bioconjugate Chem. 2017, 28, 1931–1943. [CrossRef] [PubMed]

24. Ma, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Píseň, Z.; a kol. Vakcíny nanočástic založené na doméně vázající receptor (RBD) a opakování sedmičky (HR) SARS-CoV-2 vyvolávají silné ochranné imunitní reakce. Imunita 2020, 53, 1315–1330.e1319. [CrossRef] [PubMed]

25. Benedictus, L.; Bell, ČR Rizika použití alogenních buněčných linií pro výrobu vakcín: Příklad bovinní neonatální pancytopenie. Expert Rev. Vaccines 2017, 16, 65–71. [CrossRef]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, MR; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filippi, JL; Dus Santos, MJ; a kol. Bezpečnost a účinnost E2 glykoproteinové podjednotky vakcíny produkované v savčích buňkách k prevenci experimentální infekce virem bovinního virového průjmu u skotu. Vet. Res. Commun. 2012, 36, 157–164. [CrossRef]

27. Thomas, C.; Young, NJ; Heaney, J.; Collins, ME; Brownlie, J. Hodnocení účinnosti savčích a bakulovirů exprimovaných E2 podjednotkových vakcínových kandidátů na virus bovinního virového průjmu. Vaccine 2009, 27, 2387–2393. [CrossRef]

28. Aréna, TA; Harms, PD; Wong, AW Vysoce výkonná transfekce buněk HEK293 pro přechodnou produkci proteinu. Metody Mol. Biol. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hemaglutinin a neuraminidázu obsahující částice podobné viru produkované v suspenzní kultuře HEK-293: účinný kandidát na vakcínu proti chřipce. Vakcína 2016, 34, 3371–3380. [CrossRef]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Molekulární klonování a identifikace cDNA plné délky kódující vysokoafinitní Fc receptor pro hovězí IgG (Fc gama RI). Vet. Immunol. Imunopathol. 2000, 75, 151–159. [CrossRef]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. Samosestavující feritinová nanoplatforma pro navrhování klasické vakcíny proti moru prasat: Vyvolání silné neutralizační protilátky. Vaccines 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; Tu, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, MY; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; a kol. Intranazální vakcinace samotným rekombinantním antigenem-FLIPr fúzním proteinem indukuje dlouhotrvající systémové protilátkové odpovědi a široké T buněčné odpovědi. Přední. Immunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Nová vakcína podjednotky BVDV cílená na MHC-II indukuje neutralizační imunologickou odpověď u morčat a skotu. Přeshraniční. Emerg. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [CrossRef] [PubMed]

34. Ma, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Imunizace rekombinantní fúzí GP5 a feritinu modifikovaného virem reprodukčního a respiračního syndromu prasat vyvolává zvýšenou ochrannou imunitu u prasat. Virologie 2021, 552, 112–120. [CrossRef] [PubMed]

35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; a kol. Vytvoření stabilní buněčné linie CHO pro expresi vakcinačního antigenu MERS-koronaviru. Vaccine 2018, 36, 1853–1862. [CrossRef]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Colombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; a kol. Upravené feritinové nanočástice pro sledování bioluminiscence podávání nanoléčiv u rakoviny. Malý 2020, 16, e2001450. [CrossRef]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glykoprotein E2 viru klasického moru prasat exprimovaný bakulovirem indukuje ochranné imunitní reakce u králíků. Vakcína 2014, 32, 6607–6613. [CrossRef]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, AM; Zhang, W.; Saif, LJ Virus-specifické střevní IFN-gama produkující T buněčné reakce vyvolané infekcí lidským rotavirem a vakcínami korelují s ochranou proti rotavirovému průjmu u gnotobiotických prasat. Vaccine 2008, 26, 3322–3331. [CrossRef]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Zvýšená ochranná imunitní odpověď na vakcínu podjednotky PCV2 společným podáváním rekombinantního prasečího IFN-gama u myší. Vaccine 2013, 31, 833–838. [CrossRef]