Hodnocení expozice amoniaku dusíku v imunitní obraně přítomné na slezině a hlavě a ledvinách cejna obecného (Megalobrama Amblycephala)
Nov 13, 2023
Abstraktní:Amoniak je jedním z nejdůležitějších environmentálních faktorů ve vodních ekosystémech. Existují však omezené studie o účincích chronického nebo dlouhodobého stresu z amoniaku a jeho potenciálního molekulárního mechanismu u ryb. Cílem této studie bylo prozkoumat imunitní odpověď a molekulární mechanismy ve slezině a hlavě a ledvinách ryb po chronické expozici amoniaku.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}}.48 g) byl vystaven různým koncentracím celkového amoniakálního dusíku (0–30 mg/l) po dobu 30 dnů. Expozice amoniaku způsobila významné zvýšení hladin kortizolu a snížení lysozymu a 3/4 koncentrací komplementu v séru, což ukazuje na inhibiční účinky stresu amoniakem na vrozené imunitní reakce. Expozice amoniaku také vyvolala na koncentraci závislé zvýšení koncentrací amoniaku ve tkáni, patologické poškození a indexy sleziny a hlavy a ledvin. Navíc obsah imunoglobulinu M (IgM), interleukinu 1 (IL-1 ) a tumor nekrotizující faktor (TNF- ) a také hladiny mRNA signálních molekul nezávislých na receptorech podobných toll (TLR)/myeloidnímu diferenciačnímu faktoru 88 (MyD88) ve slezině a hlavě a ledvinách byly po expozici amoniaku významně sníženy. Naše zjištění naznačují, že chronická expozice amoniaku způsobila potlačení vrozených a adaptivních imunitních odpovědí prostřednictvím downregulace TLR/MyD88-nezávislé signalizace. Nežádoucí vlivy chronického amoniakálního stresu byly závažnější ve slezině než v hlavové ledvině.
Klíčová slova: amoniak; stres; toll-like receptory; slezina; hlava-ledvina; imunita
KLIKNĚTE ZDE A ZÍSKEJTE BYLINNÉ CISTANCHE PRO LEDVINY
1. Úvod
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/l) občas kvůli neúčinnému nebo neexistujícímu čištění odpadních vod nebo z jiných důvodů [9,10].
Bylo prokázáno, že imunosupresivní účinky amoniaku u ryb přispívají k propuknutí onemocnění [11,12]. V některých studiích na Takifugu rubripes, Scophthalmus maximus a Pelteobagrus fulvidraco by akutní expozice amoniaku mohla zvýšit hladinu genové exprese aktivačního faktoru B-buněk, proteinu tepelného šoku 70/90, tnf- a interleukinu- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang a kol. také uvedli, že aktivity sérového lysozymu byly významně sníženy u Acanthopagrus schlegelii po 24 hodinách expozice amoniaku [16]. Podobně byly pozorovány snížené hladiny mRNA komplementu C3 a IgM ve slezinách Pelteobagrus vachellii a Rhynchocypris lagowski při akutní expozici amoniaku [17,18]. Přestože byla věnována velká pozornost účinkům akutní expozice amoniaku na imunitu ryb, existují pouze omezené studie o účincích chronického nebo dlouhodobého stresu z amoniaku a jeho potenciálního molekulárního mechanismu. Někteří výzkumníci navíc prostřednictvím transkripční analýzy uvádějí nepříznivé účinky amonného dusíku na expresi mRNA TLR [16,19–22]. V důsledku toho předpokládáme, že přetrvávající expozice amoniaku by také mohla ovlivnit imunitu ryb, ve které může hrát důležitou roli signální dráha TLR.
Slezina a hlavová ledvina jsou hlavními imunitními orgány u teleostových ryb, které jsou odpovědné za zachycování a odstraňování cizích částicových materiálů a udržování stabilního vnitřního prostředí [23,24]. Jsou také hlavními místy, kde se tvoří imunitní protilátky [25–27]. U ryb se navíc vrozený imunitní systém skládá z pevných a mobilních buněk a také ze široké škály obranných molekul (jako je lysozym, komplement a cytokiny) [28,29]. Cejn Wuchang (Megalobrama amblycephala) je kaprovitá ryba pocházející z povodí Yangtze v Číně, která byla v roce 2014 na 11. místě na světě v celkové roční produkci této ryby [30]. Jako hlavní akvakulturní druh je M. amblycephala relativně citlivým druhem na amoniakální dusík a často trpí stresem vyvolaným amoniakálním dusíkem [31–33]. Ve světle výše uvedeného byl v cejnu Wuchang proveden experiment s chronickou expozicí, aby se objasnily rysy imunitních reakcí po chronické expozici amoniaku a mechanismus za těmito účinky prostřednictvím detekce změn sérových imunitních parametrů, histologie a molekul souvisejících s dráhou TLR. ve slezině a hlavě-ledvinách. Naše výsledky rovněž přispívají ke sledování zdravotního stavu a welfare M. amblycephala v systémech intenzivní akvakultury.
2. Výsledky
2.1. Obsah amoniaku ve slezině a hlavě a ledvinách
Obrázek 1 ukazuje obsah amoniaku ve slezině a hlavové ledvině M. amblycephala po 30 dnech vystavení různým úrovním amoniaku. Významné zvýšení hladiny amoniaku bylo pozorováno ve slezině ryb vystavených 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0,05). Mezi všemi skupinami léčenými amoniakem a kontrolní skupinou nebyl žádný statistický rozdíl v hladinách amoniaku v hlavě ledviny (p > 0,05).
Obrázek 1. Účinky chronické expozice amoniaku na akumulaci amoniaku ve slezině a hlavové ledvině M. amblycephala. Každý sloupec představuje průměr ± SE ze šesti duplikátů. Hodnoty p < 0,05 jsou znázorněny jako "*" nad sloupcem, což znamená významné rozdíly oproti kontrole.
2.2. Sérový kortizol, lysozym, hladiny C3 a C4
Jak je znázorněno na obrázku 2, hladiny kortizolu v séru se významně zvýšily ve všech skupinách léčených amoniakem ve srovnání s kontrolní skupinou (p < 0.05). Naopak aktivity sérového lysozymu byly významně sníženy u ryb vystavených vyšším koncentracím amoniaku (20 a 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku) (p < 0,05). Hladiny komplementu C3 a C4 v séru byly významně sníženy ve skupinách léčených 10 až 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku (p < 0,01).
Obrázek 2. Účinky chronické expozice amoniaku na hladiny sérového kortizolu, lysozymu, C3 a C4(AD) u M. amblycephala. Každý sloupec představuje průměr + SE ze šesti duplikátů. Hodnoty p < 0.05 a 0.0l jsou uvedeny jako „“ a „“ nad sloupcem, což znamená významné rozdíly oproti kontrole.
2.3. Indexy imunitních orgánů
Indexy sleziny i hlavy a ledvin se zvýšily se zvýšením koncentrací celkového amoniakálního dusíku po expozici (obrázek 3). Ve srovnání s kontrolní skupinou byl index sleziny významně zvýšený u ryb léčených vyšším celkovým amoniakálním dusíkem (20 a 30 mg/l) (p < 0,05). Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v indexu hlava-ledviny mezi všemi skupinami léčenými amoniakem a kontrolní skupinou (p > 0,05).
Obrázek 3. Účinky chronické expozice amoniaku na indexy sleziny (A) a hlavy a ledvin (B) u Mamblycephala. Hodnoty jsou vyjádřeny jako Min až Max (n=18). Hodnoty p < 0.05 a 0,01 jsou uvedeny jako "" a "u" nad sloupcem, což znamená významné rozdíly oproti kontrole.
2.4. Patologické hodnocení
Slezina cejna wuchangského v kontrolní skupině vykazovala normální vzhled s hojnými erytrocyty a leukocyty (obrázek 4A). Po vystavení amoniaku po dobu 30 dnů bylo zaznamenáno mírné zvýšení počtu erytrocytů spolu s výskytem melanomakrofágových center ve slezině ryb vystavených 5 mg/l celkového amoniakálního dusíku (obrázek 4B, tabulka 1). Podobné, ale závažnější změny byly pozorovány u ryb ošetřených 10 až 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku, jako je zvýšení počtu a velikosti melanom-makrofágových center a rovněž výrazně zvýšený počet erytrocytů (obrázek 4C,D). Kromě toho byla také detekována vakuolizace cytoplazmy ve slezině ryb vystavených 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku (obrázek 4E, tabulka 1).
Pokud jde o hlavu-ledviny, obrázek 5A ukazuje normální strukturu tkáně hlava-ledviny u kontrolních ryb po expozici. V hlavě a ledvinách ryb vystavených nižšímu celkovému amoniakálnímu dusíku (5 mg/l) nebyly zaznamenány žádné zjevné patologické známky (obrázek 5B, tabulka 1). Mírné zvýšení počtu melanom-makrofágových center bylo pozorováno u ryb vystavených 10 a 20 mg/l celkového amoniakálního dusíku (obrázek 5C, D, tabulka 1). Velikost a počet melanom-makrofágových center byly zvýšeny ve skupině 30 mg/l celkového amoniakálního dusíku (obrázek 5E, tabulka 1).
2.5. Analýza tkáňových imunitních parametrů
Hladiny parametrů vrozené imunity (TNF-, IL-1) a získaných imunitních parametrů (IgM) ve slezině a hlavě ledviny se snížily spolu se zvýšením hladin expozice amoniaku (obrázek 6, doplňková tabulka S1). Ve slezině byly obsahy a hladiny mRNA TNF- a IgM významně sníženy ve všech skupinách léčených amoniakem ve srovnání s kontrolami (p < 0.{{10}}5). Mezitím byl obsah IL-1 ve slezině a hladiny exprese mRNA významně sníženy u ryb vystavených více než 20 mg/l celkového amoniakálního dusíku (p < 0,05). Naproti tomu pouze obsah a hladina mRNA IL-1, stejně jako hladina exprese tnf- v hlavě-ledvinách byly výrazně sníženy ve skupinách léčených amoniakem ve srovnání s kontrolami (p < 0,05). Mezi skupinami léčenými amoniakem a kontrolní skupinou nebyly žádné signifikantní rozdíly v hladinách exprese proteinu IgM a genu ani v koncentraci TNF- v hlavě ledviny (p > 0,05).
Obrázek 6. Relativní hladiny mRNA genů signální dráhy TLR a také obsah TNF-, IL- 1 a IgM ve slezině a hlavě-ledvinách M. amblycephala. Hodnoty vyjádřené jako průměr ± SE ze šesti duplikátů. igm: imunoglobulin M, il-1: interleukin 1, tnf-: tumor nekrotizující faktor, jnk1: c-Jun N terminální kináza1, erk1: extracelulárně regulovaná proteinkináza 1, p38: mitogenem aktivovaná proteinkináza p38, nf-κb1 /2: nukleární faktor-κ-genová vazba 1/2, pi3 k: fosfatidylinositol 3-kináza, akt: proteinkináza B, myd88: myeloidní diferenciační faktor 88, traf6: faktor 6 spojený s receptorem nádorového nekrotického faktoru, tlr1 /2/3/4/5: mýtný receptor 1/2/3/4/5. Hodnoty p < 0.05 a 0,01 jsou uvedeny jako „*“ a „**“ nad sloupcem, což znamená významné rozdíly oproti kontrole
K objasnění molekulárního mechanismu chronické toxicity amoniaku na imunitní systém byly stanoveny transkripční změny klíčových genů zapojených do signální dráhy TLR spolu s hladinami TNF-, IL-1 a IgM. Ve slezině byly hladiny mRNA genů toll-like receptorů (tlr2, tlr4), genu traf6 spojeného s nezávislou dráhou MyD, genu nf-κb2 spojeného se signální dráhou NF-κB a genu erk1 spojeného se signální dráhou MAPK významně nižší -regulované ve skupinách léčených amoniakem ve srovnání s kontrolou (p < 0.05), zatímco v expresi tlr1, tlr3, tlr5, pi3k, akt, myd88 nebyly zaznamenány žádné významné změny , nf-κbl, jnk1 a p38 a (p > 0.05). Podobně hladiny transkripce tlr1, tlr2, tlr5, akt, traf6, nf-κb1, erk1 a jnk1 byly významně červené, žádné významné rozdíly v expresi tlr3, tlr4, myd88, pi3 k, nf-κb2 a p38 v hlavě a ledvinách mezi skupinami léčenými amoniakem a kontrolní skupinou (p > 0,05).
2.6. Korelační analýza
Jak je znázorněno na obrázku 7 a v doplňkové tabulce S2, koncentrace vystavení amoniaku významně negativně korelovala s obsahem TNF-, IL-1 a IgM, stejně jako s transkripčními hladinami tnf-, il-1, igm, tlr2, traf6, nf-кb2 a jnk1 ve slezině. Mezitím obsah a úrovně transkripce TNF-, IL-1 a IgM ve slezině vykazovaly významné pozitivní vzájemné korelace (p < 0.05). Koncentrace IgM ve slezině vykazovala významnou pozitivní korelaci s tlr2 a nf-кb2 a TNF- stejně jako IL-1 vykazovaly významné pozitivní korelace s tlr2, traf6 a nf-кb2 (p < 0). 53}}5). Avšak v hlavové ledvině byly hladiny expozice amoniaku pouze pozoruhodně negativně korelovány s obsahem IL-1 a expresí genů tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt, nf-кb1, jnk1 a erk1 (p < 0,05). Hlava-ledvina IL-1 pozitivně korelovala s IgM, igm, il-1, tlr4, myd88, traf6, akt, nf-кb1, erk1 a jnk1, zatímco IgM a TNF- vykazovaly pozitivní korelaci s p38a, respektive tlr2 (p < 0,05).
Obrázek 7. Spearmanovy korelační koeficienty® mezi koncentrací expozice amoniaku a imunitními parametry zapojenými do signální dráhy TLR ve slezině a hlavě-ledvinách M. amblycephala po chronické expozici amoniaku. Hodnoty p < 0.05 a 0,01 jsou uvedeny jako „*“ a „**“ nad sloupcem, což znamená významné rozdíly oproti kontrole, resp.
2.7. Indexy IBR
Hodnoty IBR byly vypočteny ze standardizovaných dat 22 biomarkerů ve slezině a hlavě-ledvinách u cejna wuchangského pod různými hladinami okolního amoniaku po 30-denní expozici (tabulka 2, obrázek 8). S rostoucími expozičními koncentracemi amoniaku měly hodnoty IBR tendenci se zvyšovat jak v slezině, tak v hlavové ledvině. Hodnoty IBR byly vyšší ve slezině
Supporting Service Of Wecistanche-Největší vývozce cistanche v Číně:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Nakupujte pro další specifikace Podrobnosti:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
