Vylepšení proteomiky mozkové tkáně shora dolů pomocí FAIMS, část 4

Identifikovali jsme také četné fragmenty odvozené z nekanonických sestřihových izoforem tauproteinu, o kterých je známo, že jsou exprimovány v lidském mozku.83 Stručně, izoformy tau jsou definovány počtem N-koncových inzertů v důsledku alternativního sestřihu exonu 2 a/nebo 3 (odkaz na 0N, 1N a 2N) a počet opakování vázajících mikrotubuly v důsledku alternativního sestřihu exonu 10 (označovaného jako 3R nebo 4R).84

Tau protein je důležitý protein v neuronových buňkách, který hraje velmi důležitou roli při udržování normální struktury a funkce neuronových buněk. Studie ukázaly, že protein tau úzce souvisí s pamětí a jeho abnormální exprese může vést k poklesu kognitivních funkcí a dokonce k poruše kognitivních funkcí.

Vědci provedli mnoho výzkumů o vztahu mezi proteinem tau a pamětí. Podle výzkumu může tau protein pomáhat regulovat stabilitu nervových vláken, a tím podporovat přenos informací a tvorbu paměti mezi neuronálními buňkami. Jakmile je však tau protein abnormální, jako je akumulace proteinu, povede to ke zlomení nervových vláken a smrti velkého počtu neuronálních buněk, což ovlivní tvorbu a udržení paměti a dokonce povede k poškození paměti. Proto je udržení normální exprese a funkce tau proteinu velmi důležité pro udržení zdraví paměti.

Nedávné studie také zjistily, že živiny obsažené v některých potravinách a nápojích jsou také prospěšné pro udržení normální funkce tau proteinu. Například antioxidanty, Omega{0}} mastné kyseliny a zelenina a ovoce bohaté na kofein mohou pomoci regulovat expresi a funkci proteinu tau, který pomáhá zlepšit paměť a kognitivní funkce.

Proto bychom měli dbát na udržování dobrých životních návyků, kontrolu stravy, snižování stresu atd., abychom udrželi normální expresi a funkci tau proteinu. Udržování dobrých studijních návyků a mírné cvičení může zároveň pomoci podporovat přenos informací a tvorbu paměti mezi neuronálními buňkami. Věřím, že dokud budeme dbát na dodržování zdravého životního stylu, můžeme mít zdravou paměť a lépe si užívat života. To ukazuje, že musíme zlepšit naši paměť. Cistanche může výrazně zlepšit paměť, protože Cistanche je tradiční čínský léčivý materiál s mnoha unikátními účinky, z nichž jedním je zlepšení paměti. Účinnost Cistanche vychází z různých aktivních složek, které obsahuje, včetně kyseliny tříslové, polysacharidů, flavonoidních glykosidů atd. Tyto složky mohou podporovat zdraví mozku různými způsoby.

Klikněte na 10 způsobů, jak zlepšit paměť

Za zmínku také stojí, že endogenní fragmenty tau jsou běžným nálezem v lidské mozkové tkáni a mozkomíšním moku a diferenciální fragmentace tau může hrát roli v progresi AD.85,86

Pozorovali jsme několik fragmentů, které dokázaly jednoznačně rozlišit {{0}}}N a 1N tau (obrázky 10A, S7 a S8). Skutečnost, že pozorujeme vysoké spektrální počty pro 0N (86 PrSM) a 1N (91 PrSM), ale nepozorujeme žádné PrSM pro 2N, je v souladu s předchozím kvantitativním imunoblotingem, který zjistil, že 0N a 1N jsou dominantní formy a tvoří ∼ 91 % celkového tau, zatímco 2N tvoří pouze ~9 %.87

Pokud jde o jednoznačné přiřazení repetic vázajících mikrotubuly, pozorovali jsme spektra, která mohla být přiřazena jak 3R (obrázky 10A a S9), tak 4R tau (obrázky 10A a S10).

Opatrná inference nám umožnila dospět k závěru, že braintau je reprezentován většinou směsí 1N3R (Tau-B) následovaných 0N4R (Tau-D) sestřihovými variantami, což je v souladu s předchozími pozorováními.87,88

Zatímco jiné izoformy sestřihu měly také jedinečné fragmenty, nízký počet spektrálních shod (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Překvapivě jsou N-konce fragmentů obsahujících převažující R-doménu pokračováním od C-konců fragmentů obsahujících převládající N-doménu, nebo jinými slovy, zdá se, že jde o spojené fragmenty produkované možným proteolytickým štěpením (označované jako místo č. 1 na obrázku 10A). Kromě toho C-konce proteoforem obsahujících doménu 3R a 4R sdílejí stejné místo štěpení (označované jako místo #2 na obrázku 10A), i když samotné sekvence jsou odlišné kvůli sestřihové variaci exonu 10.

Ještě překvapivější je, že všechna tato místa štěpení leží ve třech dobře popsaných hexapeptidových motivech.89–95 Obrázek 10B ukazuje všechny jedinečné fragmenty, které jsme identifikovali z našich datových souborů a které by bylo možné mapovat na izoformu tau 1N3R, a také umístění štěpení. stránky.

Místo štěpení č. 1 leží v druhé oblasti bohaté na prolin tau, která rozděluje hexapeptidovou sekvenci KVAVVR a poskytuje jedno z nejsilnějších vazebných míst pro mikrotubuly (obrázek 10B).89–91 Místo štěpení č. 2 leží v hexapeptidových motivech 3R a 4R VQIVYK a VQIINK, u kterých bylo prokázáno, že řídí agregaci tau (obrázek 10B).92–95

Je zajímavé, že mnoho fragmentů, jak je znázorněno na obrázku 10B, začíná nebo končí v blízkosti těchto dvou míst štěpení. Je známo, že každý z těchto hexapeptidových motivů tvoří strukturu, často ve formě vlásenek, které jsou základem agregace účastnící se různých neurodegenerativních onemocnění.89,93,96 Je zajímavé, že tato pozorování zdůrazňují možnost sdílené dráhy proteolytické degradace mezi izoformami tau. schopné narušit jejich agregační oblasti.25,85,86

Nakonec jsme našli četné spektrální shody pro A, které bylo možné pozorovat pouze pomocí FAIMS.

Tyto proteoformy A, které typicky vyžadují speciální frakcionační nebo manipulační techniky ke zlepšení výtěžnosti díky svým hydrofobním vlastnostem a náchylným k agregaci,9,16,97,98 byly pozorovány neporušené pomocí FAIMS v rozsahu -40 až -50 CV.

To zahrnuje kanonické A 1–42 a A 1–40 (obrázek 11A, respektive B), jakož i několik N-koncově zkrácených forem (konkrétně A 2–42 a A 4–42, obrázek 11C, D).

Stojí za zmínku, že proteoformy A s různými N- a C-koncovými štěpeními je notoricky obtížné identifikovat v analýzách zdola nahoru kvůli extrémní hydrofobnosti tryptických produktů, což zdůrazňuje výhodu analýzy intaktních proteinů.

Věříme, že metodika FAIMS-TDP nabízí robustní způsob, jak dosáhnout neporušené identifikace těchto proteoforem A, což umožňuje snadné stanovení různých kombinací N a C-koncových produktů štěpení, které existují.

ZÁVĚRY

Popsali jsme, jak nano-LC reverzní fázová separace vysoce komplexního vzorku obsahujícího proteiny v širokém hmotnostním rozsahu může těžit z implementace frakcionace v plynné fázi pomocí FAIMS v kontextu hmotnostní spektrometrie shora dolů.

Bylo prokázáno, že FAIMS ovlivňuje přenos proteoforem velikostí a/nebo nábojem, snižuje složitost MS1 a umožňuje větší hloubku pokrytí proteomu.

FAIMS při jediném CV (-50) umožnily v průměru identifikovat 1833 ± 17 unikátních proteoforem, více než dvojnásobek ve srovnání s bez FAIMS (754 ± 35). Přidání FAIMS nevedlo ke zhoršení reprodukovatelnosti kvantifikace a zůstalo blízko 20 % RSD, což je srovnatelné s přístupy zdola nahoru bez označení.

Bylo zaznamenáno klesající CV FAIMS, aby se zvýšila molekulová hmotnost iontových druhů přenášených do přístroje (medián MW~5 kDa při -50 CV vs -15 kDa při -20 CV) a bylo také pozorováno, že modulace CV ovlivňuje přenos obálka stavu náboje proteoformy rozdílně.

Také jsme definovali optimální kombinace CV, které by mohly produkovat největší teoretické maximum pokrytí proteoforem/genů nebo proteomových sekvencí. Ve srovnání se třemi soubory dat „No FAIMS“ by externí krokování CV při -50, -40 a -30 V mohlo více než zdvojnásobit počet jedinečných proteoforem, jedinečných genů a pokrytí sekvencí proteomů.

Za zmínku také stojí, že naše práce zkoumala pouze relativně malý rozsah CV, který jsme považovali za nejvhodnější pro náš přístup TDP s použitím komplexního vzorku. Vzhledem k tomu, že FAIMS lze snadno přizpůsobit jiným metodám, analýzy MS1 s nízkým rozlišením s analyzátory Orbitrap mohou být schopny zlepšit identifikaci větších proteoforem v rozsahu CV, který jsme testovali, a také nad -20 V, kde by pravděpodobně byly pozorovány větší proteoformy.

Lze si také představit, že budoucí přístrojové vybavení hmotnostního analyzátoru, které zdokonaluje získávání větších proteoforem a je kompatibilní s FAIMS, může těžit ze zkoumání CV pod -20, přesahující do kladného rozsahu napětí.

Náš pracovní postup TDP nám umožnil identifikovat a charakterizovat jedinečné proteoformy odvozené z genů se známou rolí v neurodegenerativních onemocněních.

To zahrnovalo určení složení neznámého hmotnostního posunu přítomného v blízkosti domény vázající železo -synukleinu, což bylo použito k určení umístění potenciálních domén vázající železo v - a také synukleinu. Bylo také zjištěno, že PARK7 je modifikován sukcinylovou skupinou na svém aktivním místě Cys zbytku.

Byli jsme schopni jednoznačně rozlišit tau fragmenty odpovídající 0N, 1N, 3R a 4R sestřihovým variantním izoformám jednotlivě a popsat nová proteolytická štěpná místa umístěná uvnitř nebo v blízkosti několika hexapeptidových opakování se zaočkováním agregace.

Nakonec FAIMS umožnil identifikaci několika intaktních proteoforem A, včetně A 1–42 náchylných k agregaci, bez potřeby složitých frakcionačních nebo purifikačních technik.

Stručně řečeno, věříme, že přidání FAIMS k objevení TDP poskytne robustní a reprodukovatelnou metodu pro zvýšení proteomu dostupného pro detekci a charakterizaci.

Doplňkový materiál

Doplňkový materiál naleznete ve webové verzi na PubMed Central.

PODĚKOVÁNÍ

Autoři by rádi poděkovali Tao Liu a Richardu Smithovi za jejich rady a užitečné diskuse.

Tato práce byla podporována U01 AG061356 (PLDJ) a R01 AG015819 (DAB). Část výzkumu byla provedena pomocí EMSL (grid.436923.9), uživatelského zařízení DOE Office of Science, sponzorovaného programem Biological and Environmental Research. Grafické abstrakty a obrazové podklady na obrázku 1 byly vytvořeny pomocí Biorender.com.

ODKAZY

(1). Nichols E; Szoeke CEI; Vollset SE; Abbasi N; Abd-Alláh F; Abdela J; Aichour MTE; AkinyemiRO; Alahdab F; Asgedom SW; Awasthi A; Barker-Collo SL; Baune BT; Béjot Y; BelachewAB; Bennett DA; Biadgo B; Bijani A; Bin Sayeed MS; Brayne C; Tesař DO; Carvalho F; Catalá-López F; Cerin E; Choi J-YJ; Dang AK; Degefa MG; Djalalinia S; Dubey M; Duken EE;Edvardsson D; Endres M; Eskandarieh S; Faro A; Farzadfar F; Fereshtehnejad SM; FernandesE; Filip I; Fischer F; Gebre AK; Geremew D; Ghasemi-Kasman M; Gnedovskaya EV; GuptaR; Hachinski V; Hagos TB; Hamidi S; Hankey GJ; Haro JM; Seno SI; Irvani SSN; Jha RP; Jonáš JB; Kalani R; Karch A; Kasaeian A; Khader YS; Khalil IA; Khan EA; Khanna T;Khoja TAM; Khubchandani J; Kisa A; Kissimova-Skarbek K; Kivimäki M; Koyanagi A; KrohnKJ; Logroscino G; Lorkowski S; Majdan M; Malekzadeh R; März W; Massano J; MengistuG; Meretoja A; Mohammadi M; Mohammadi-Khanaposhtani M; Mokdad AH; Mondello S; Moradi G; Nagel G; Naghavi M; Naik G; Nguyen LH; Nguyen TH; Nirayo YL; Nixon MR; Ofori-Asenso R; Ogbo FA; Olagunju AT; Owolabi MO; Panda-Jonas S; Passos VM d. A.;Pereira DM; Pinilla-Monsalve GD; Piradov MA; Rybník CD; Poustchi H; Qorbani M; Radfar A; Reiner RC; Robinson SR; Roshandel G; Rostami A; Russ TC; Sachdev PS; Safari H; SafiriS; Sahathevan R; Salimi Y; Satpathy M; Sawhney M; Saylan M; Sepanlou SG; ShafieesabetA; Shaikh MA; Sahraian MA; Shigematsu M; Shiri R; Shiue I; Silva JP; Smith M; SobhaniS; Stein DJ; Tabarés-Seisdedos R; Tovani-Palone MR; Tran BX; Tran TT; Tsegay AT; UllahI; venketasubramanské N; Vlassov V; Wang YP; Weiss J; Westerman R; Wijeratne T; WyperGMA; Yano Y; Yimer EM; Yonemoto N; Yousefifard M; Zaidi Z; Zare Z; Vos T; Feigin VL;Murray CJL Globální, regionální a národní zátěž Alzheimerovou chorobou a jinými demencemi, 1990–2016: systematická analýza pro studii Global Burden of Disease 2016. Lancet Neurol.2019, 18, 88–106. [PubMed: 30497964]

(2). Beyreuther K; Masters CL Amyloid prekurzorový protein (APP) a beta A4 amyloid v etiologii Alzheimerovy choroby: vztahy prekurzor-produkt při narušení neuronálních funkcí. Mozkový patol. 1991, 1, 241–251. [PubMed: 1669714]

(3). Hardy J; Higgins G. Alzheimerova choroba: hypotéza amyloidní kaskády. Science 1992, 256,184–185. [PubMed: 1566067]

(4). Goedert M. Tau protein a neurofibrilární patologie Alzheimerovy choroby. Trends Neurosci.1993, 16, 460–465. [PubMed: 7507619]

(5). Iqbal K; Liu F; Gong CX Tau a neurodegenerativní onemocnění: dosavadní příběh. Nat. Rev. Neurol.2016, 12, 15–27. [PubMed: 26635213]

(6). Musiek ES; Holtzman DM Tři dimenze amyloidní hypotézy: čas, prostor a 'wingmen'. Nat. Neurosci. 2015, 18, 800–806. [PubMed: 26007213]

(7). Propagace Takeda S. Tau jako diagnostický a terapeutický cíl pro demenci: Potenciály a nezodpovězené otázky. Přední. Neurosci. 2019, 13, 1274. [PubMed: 31920473]

(8). Gregorich ZR; Ge Y. Proteomika shora dolů ve zdraví a nemoci: výzvy a příležitosti. Proteomika 2014, 14, 1195–1210. [PubMed: 24723472]

(9). Zakharova NV; Bugrová AE; Kononikhin AS; Indeykina, Autoři deklarují žádný konkurenční finanční zájem. MI; Popov IA; Nikolaev EN Hmotnostní spektrometrická analýza diverzity peptidů Abeta: potíže a budoucí perspektivy pro objevování biomarkerů AD. Expert Rev.Proteomics 2018, 15, 773–775. [PubMed: 30253669]

(10). Grasso G. Hmotnostní spektrometrie je mnohostranná zbraň, kterou lze použít v boji proti Alzheimerově chorobě: Amyloidní beta peptidy a další. hmotnostní spektrum. Rev. 2019, 38, 34–48.[PubMed: 29905953]

(11). Andrejev VP; Petyuk VA; Sládek HM; Karpievitch YV; Xie F; Clarke J; Tábor D; Smith RD; Lieberman AP; Albin RL; Nawaz Z; El Hokayem J; Myers AJ Kvantitativní LC-MS proteomika Alzheimerovy choroby a normálně stárnoucích lidských mozků bez označení. J. Proteome Res. 2012, 11,3053–3067. [PubMed: 22559202]

(12). Zhang Q; Ma C; Ozubení M; Wang PG; brada LS; Li L. Integrovaná proteomika a síťová analýza identifikují proteinová centra a síťové změny u Alzheimerovy choroby. ActaNeuropathol. Commun. 2018, 6, 19. [PubMed: 29490708]

For more information:1950477648nn@gmail.com