Zvýšení antiangiogenních účinků delfinidinu při zapouzdření v malých extracelulárních váčcích Část 2

Kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comDalší informace

3.2 Metabolity delfinidinu v SEV

Kromě delfinidinu (obrázek 2A), peonidin-3-galaktosid(Retenční čas = 11,11 min, [M]' m/z = 463,12404) (Obrázek 2B) adelphinidin3-O-β-rutinosid (Retenční čas = 12,34 min, [M] m / z = 611,16121) (Obrázek 2C) byly detekovány za těchto experimentálních podmínek u sEV. Stopy těchto metabolitů byly také detekovány ve standardním roztoku delfinidinu. Analýza byla založena na přesné hmotnosti, i když pro potvrzení tohoto pozorování je nutný autentický standardní roztok.

Klikněte prosím zde a dozvíte se více

3.3 Účinky delfinidinu a delfinidinu s obsahem sEV na šíření HAoEC

Delphinidin samotný nebo vložený do SEV nezměnil životaschopnost HAoECs po dobu 24 hodin při koncentracích 1 až 10 μg/ml (obrázek 3A).

VEGF (20 ng/ml), používaný jako pozitivní kontrola, významně nezvýšila proliferaci endoteliálních buněk (obrázek 3B). Nativní sEV (10 ug/ml) neměly žádný účinek. Delfinidin inhiboval proliferaci endoteliálních buněk způsobem závislým na koncentraci s maximálním účinkem dosaženým při 10ug/ml (obrázek 3B). Stejným způsobem delfinidin zatížený sEV vyvolal inhibici závislou na koncentraciendoteliálníbuněčná proliferace. Zajímavé je, že maximální inhibice byla dosažena při koncentraci 5 ug/ml delfinidinu zatíženého sEV, což je koncentrace dvakrát nižší než koncentrace samotného delfinidinu. Tyto výsledky naznačují, že delfinidin nabitý sEV byl dvakrát účinnější než delphinidindelphinidinsám.

3.4.Účinky delfinidinu a delfinidinu s obsahem sEV na výrobu NO

Jak je znázorněno na obrázku 4, ATP(10μM) vyvolal zvýšení DAF-2fluorescenceilustrující NO produkci v endoteliálních buňkách. Nativní sEV neovlivnily hladinu NO. Delphinidin sám o sobě zvýšil produkci NO v závislosti na koncentraci, přičemž maximálního účinku bylo dosaženo při 10ug/ml. Delfinidinem nabité SEV také vyvolaly koncentraci závislé zvýšení produkce endoteliálního NO. Zajímavé je, že maximální účinek delfinidinu nabitého sEV byl dosažen při 1 ug /ml, zatímco volný delfinidin dosáhl tohoto účinku při 10 ug/ml. Delphinidin nabitý sEV byl tedy při zvyšování produkce NO 10krát účinnější než samotný delfinidin.

3.5 Účinky delfinidinu a delfinidinu s obsahem sEV na angiogenezi

HAoEC restrukturalizovaly a vytvořily kapilární struktury (obrázek 5A,B). Nativní sEV neměly žádný vliv na tvorbu kapilárních struktur. Jak již bylo popsáno [6], delfinidin sám snížil počet větvení kapilárních struktur způsobem závislým na koncentraci, přičemž maximálního účinku bylo dosaženo při 10 ug/ml se 40% redukcí. Zajímavé je, že sEV nabité delfinidinem silně snížily počet kapilárních větví. Delphinidin při dávce 0,1 ug/ml zatížený v rámci sEV již snížil počet větvení o 60 % a tento účinek byl větší než účinek dosažený při 10 μg/ml samotného delfinidinu. Delfinidin nabitý sEV byl tedy více než 100krát účinnější při inhibici angiogeneze než samotný delfinidin.

Obrázek 5. In vitro angiogeneze test. (A) Reprezentativní fázově kontrastní mikrografy tubulárních struktur v kultivovaném HAoEXiponované po dobu 24 hodin delfinidinu nebo SEV zatížené delfinidinem v různých koncentracích. Zvětšení: 40×. Byly analyzovány čtyři oblasti z každé studny. (B) Sloupcový graf znázorňoval významný pokles procenta bodů větvení po léčbě ve srovnání s PBS ošetřenou (kontrola). Údaje jsou uvedeny jako střední ±SEM šesti nezávislých experimentů ve srovnání s kontrolou: a: p<0.0001><0.0001 vs.del=""><0.0001 vs.="" del=""><0.001 vs.=""><><0.05vs.del5;g:><0.05 vs.sev=""><0.001 vs.sevdel0.5="" and=""><0.0001 vs.sevdel="">

4. Diskuse

Současná studie ukazuje, že delfinidin uložený v SEV byl zjevně účinnější než volný delfinidin, pokud jde o jeho schopnost uvolňovat endoteliální NO, inhibovat endoteliální proliferaci a snižovat kapilární struktury. Kromě delfinidinu nalezeného v SEV analýza metabolitů delfinidinu v sEV ukázala přítomnost dvou metabolitů (tj.delphinidin3-O--rutinosid a peonidin-3-galaktosid)přítomný ve vzorcích delfinidinu. Delfinidin se tedy rozkladl na stejné metabolity ve své volné formě nebo při zatížení do SEV; ty však byly účinnější při působení na endoteliální buňky. Důležité je, že při zapouzdření v sEV byl delphinidin (používaný jako obecný termín a zahrnující přirozené metabolity delfinidin 3-O-ß-rutinosid a peonidin-3-galaktosid) 2krát, 10krát a 100krát účinnější než volný delfinidin, pokud jde o endoteliální proliferaci, produkci endoteliální NO a kapilární tvorbu. Delfinidin nabitý sEV má tedy účinky na různé kroky vedoucí k angiogenezi. Tyto výsledky naznačují, že sEV lze považovat za slibnou dodávku delfinidinu jako inovativní přístup k cílovým onemocněním spojeným se zvýšenou angiogenezí, včetně rakoviny, aterosklerózy a diabetické retinopatie.

Cistanche může zlepšit imunitu

Zapouzdření polyfenolů k jejich ochraně před degradací je přirozeným jevem. Ve skutečnosti bylo prokázáno, že rostliny bohaté na polyfenoly produkují EV nesoucí tyto molekuly. Například flavonoid glykosid naringin a jeho metabolit naringenin se nacházejí v EV odvozených od grapefruitu [12]. Kromě toho mohou být nanočástice odvozené z rostlin použity jako vektory pro jiné molekuly, které je zajímají. Ve skutečnosti bylo hlášeno, že nanočástice odvozené z grapefruitu nabité inhibitorem STAT3 inaktivují STAT3 v nádorových buňkách GL26 a zlepšují míru přežití myší [19]. Další strategií pro zapouzdření polyfenolů je použití vezikulů odvozených ze savčích buněk. Nedávná zpráva hodnotila exozomální formulaci antokyanidinů proti různým typům rakoviny [19]. sEV sklizené ze syrového bovinního mléka naplněného směsí kyanidinu, delfinidinu, petunidinu, peonidinu a malvidinu zvyšují antiproliferační aktivitu antokyanidinů proti šesti různým typům rakovinných buněk prostřednictvím inhibice aktivace NF-kB indukované TNFo [20]. Účinky sEV zatížených antokyanidiny jsou skutečně účinnější než účinky volných antokyanidinů. Tato metoda má výhody; zůstává však riskantní. Použití EV ze savčích buněk může skutečně způsobit imunitní reakce.sEV odtrhané od nezralých lidských dendritických buněk nevyvolaly žádnou toxicitu a nezralá povaha dendritických buněk vyvolala nízkou imunogenitu [21,22]. Pokud je nám známo, je to poprvé, kdy byla popsána účinnost nakládání delfinidinu v rámci jaws II.I sEV. Zatížení delfinidinu do sEV (9 %) chrání a pravděpodobně omezuje jeho degradaci na metabolity za použitých experimentálních podmínek. Příslušné mechanismy vyžadují další studium. Metabolity nalezené v SEV, jako je delfinidin 3-O-β-rutinosid nebo peonidin-3-galaktosid, se také nacházejí v experimentech in vivo s delfinidinem 14,15]. Předchozí práce uváděly, že produkty degradace delfinidinu mají silnou biologickou aktivitu, včetně protirakovinných a protizánětlivých aktivit [20]. Mezi fenolovými kyselinami je kyselina gallová většinou tvořena degradací delfinidinu v kultivačním médiu [23]. V této studii jsme zjistili, že metabolity detekované v delfininidinu nabitém sEV byly identické s metabolity detekovanými z volného delfinidinu [18]. Ačkoli přesný podíl metabolitů zapouzdřených v těchto sEV nebyl stanoven, byly na cílových buňkách účinnější než samotné metabolity. Delfinidin a jeho metabolity byly tedy pravděpodobně stabilnější a chráněné před degradací.

Dříve jsme uvedli, že v endoteliálních buňkách bovinní aorty delfinidin stimuluje uvolňování NO zvýšením intracelulárních koncentrací Ca2+ zvýšením tvorby superoxidových aniontů. To bylo spojeno se zvýšenou fosforylací tyrosinu několika intracelulárních proteinů, což vedlo k vazodilataci závislé na endotelu (24,25). Delphinidin interaguje přímo s aktivačním místem ERα, což vede k aktivaci endoteliální NO-syntázy, produkce NO a vazorelaxe závislé na endotelu 4]V této studii byl delfinidin nabitý sEV 10krát účinnější než volný delphinidin; proto by byl pravděpodobně účinnější při korekci NO-endoteliální dysfunkce spojené s kardiovaskulárními chorobami, včetně hypertenze, mrtvice nebo metabolických onemocnění [3].

Již dříve jsme uvedli, že upregulace no dráhy není zodpovědná za antiproliferativní účinek delfinidinu. Delfinidin skutečně inhibuje proliferaci endoteliálních buněk aktivací dráhy ERK-1/-2, což vede k zástavě buněčného cyklu a akumulaci buněk ve fázi G0/G1 prostřednictvím down-regulace exprese cyklinu A a D1 a upregulace p27kip1 [6,7]. Také jsme zjistili, že delphinidin snižuje růst nádoru melanomových buněk in vivo tím, že působí specificky na proliferaci endoteliálních buněk prostřednictvím inhibice signalizace VEGFR2, MAPK, PI3K a na úrovni transkripce na faktorech CREB / ATF1 a inhibici fosfodiesterázy 2 [9]. V této studii byly sEV nabité delfinidinem dvakrát účinnější než volný delfinidin v inhibici endoteliální proliferace. Tyto výsledky tedy naznačují, že sEV nabité delfinidinem jsou slibným přístupem k patologickým stavům před ventilací spojeným s nadměrnou endoteliální proliferací, a tedy s tvorbou cévní sítě, jako je vývoj plaku a stabilita aterosklerózy a vývoj nádorů u rakoviny.

V souladu s těmito nálezy ukazujeme, že delfinidin snižuje kapilární tvorbu v experimentálním modelu angiogeneze. Zajímavé je, že při zapouzdření v sEV (dokonce i při zatížení pouhých 9%) byl delphinidin 100krát účinnější než volný delphinidin při snižování tvorby kapilár.

Omezení studie: Antiangiogenní potenciál, který vykazuje mnoho přírodních sloučenin obsažených v mnoha složkách středomořské stravy, včetně delfinidinu, činí tento dietní vzorec obzvláště zajímavým jako zdroj chemopreventivních látek, definovaných v rámci strategie angioprevence. To bylo nedávno přezkoumáno Martinez-Podeva et al. [26]. Delphinidin se zdá být stejně účinný jako jiné flavonoidy při indukci antiangiogenních vlastností. Ačkoli hojné ve stravě, antokyany obecně, a delphinidin zvláště, jsou špatně absorbovány. Jedním z důsledků špatné biologické dostupnosti antokyanů je, že mnoho účinků pozorovaných in vitro (např. inhibice COX-2) se pravděpodobně nevyskytne in vivo, což není případ delfinidinu, na základě našich předchozích studií [6-10]. K potvrzení zvýšení antiangiogenních vlastností tohoto přístupu in vivo jsou však zapotřebí další studie používající delfinidin zapouzdřený v sEV.

Stručně řečeno, delfinidin nabitý sEV zvýšil účinnost delfinidinu 100krát pro proliferaci, 10krát pro NO a 2krát pro kapilární tvorbu. Proto byly sEV buď chráněny delfinidin a jeho metabolity před degradací, nebo některé neidentifikované metabolity delfinidinu obsažené v SEV byly účinnější. Diferenciální potence získaná pro proliferaci, produkci NO a angiogenezi podporuje hypotézu, že elektrická vozidla s delfinidinem mají vliv na různé kroky vedoucí k angiogenezi. Nicméně poskytujeme důkazy, že jsme optimalizovali účinnost delfinidinu, pravděpodobně snížením jeho degradace a zvýšením jeho dodávky při zapouzdření v EV. Delfinidinem nabité SEV tedy představují výkonný dávkovací systém pro snížení angiogeneze v endoteliálních buňkách bez nežádoucích vedlejších účinků, s vědomím nízké biologické dostupnosti této sloučeniny. Zdůrazňujeme inovativní terapeutickou strategii založenou na bioinženýrských EV jako vektorech delfinidinu, které pomáhají zvýšit jeho potenciální přínos pro zdraví a zaměřují se na onemocnění související s angiogenezí, včetně rakoviny, která by mohla být nakonec rozšířena na další nemoci s nadměrnou vaskularizací.

Tento článek je extrahován z Živiny 2021, 13, 4378. https://doi.org/10.3390/nu13124378 https://www.mdpi.com/journal/nutrients