Zvýšení biosyntézy fenylethanoidních glykosidů v buněčných kulturách Cistanche Deserticola osmotickým stresem

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

AbstraktníVliv osmotického stresu na buněčný růst a biosyntézu fenylethanoidních glykosidů (PeGs) byl zkoumán v buněčných suspenzních kulturáchCistanche deserticolaYC Ma, pouštní léčivá rostlina pěstovaná v západní oblasti Číny. Různé počáteční koncentrace sacharózy významně ovlivnily buněčný růst a biosyntézu PeGs v suspenzních kulturách a nejvyšší suchá hmotnost a akumulace PeGs dosáhly 15,9 gl–1-DW a 20,7 mg g–1-DW v tomto pořadí na počáteční osmotické napětí 300 mOsm kg–1, kde koncentrace sacharózy byla 175,3 mM. Stechiometrická analýza s různými kombinacemi sacharózy a nemetabolického cukru (mannitol) nebo necukrových osmotických činidel (PEG a NaCl) odhalila, že samotný osmotický stres byl důležitým faktorem pro zvýšení biosyntézy PeGs v buněčných suspenzních kulturách.Cistanche deserticola. Maximální obsahy PeGs 26,9 a 23,8 mg g–1-DW byly získány po 21 dnech při kombinaci 87,6 mM sacharózy se 164,7 mM mannitolu (303 mOsm kg–1) nebo 20 mM PEG, což bylo vyšší než kultivace buněčných kultur C. deserticola pěstovaných při počáteční koncentraci sacharózy 175,3 mM po 30 dnech. Stimulovaná akumulace PeGs v kulturách buněčné suspenze byla korelována se zvýšením aktivity fenylalanin amonium lyázy (PAL) indukované osmotickým stresem.

Klíčová slova Cistanche deserticola, Pouštní léčivá rostlina, Fenylethanoidové glykosidy, Osmotický stres, Fenylalanin-amonium-lyáza

Cistanchetubulosamá mnoho efektů, klikněte sem a dozvíte se více

Úvod

Cistanche deserticolaYC Ma, vzácná čínská bylina, parazituje na kořenech haloxylonu ammodendrunu a roste v pouštních oblastech západní Číny. Fenylethanoidové glykosidy (PeG), hlavní bioaktivní složky izolované z C. deserticola, mají výrazné aktivity při vychytávání volných radikálů, posilování imunity, zlepšování sexuálních funkcí atd. (Zong et al. 1996; Lu 1998; Wang et al. 2001). Kvůli nekontrolovanému využívání a využíváníCistanche deserticola, přírodní zdrojCistanche deserticola byl na pokraji vyčerpání. Vzhledem k těmto problémům byla produkce PeGs buněčnými suspenzními kulturami C. deserticola považována za slibnou alternativu k vyřešení nedostatkuCistanche deserticolarostlinné materiály (Lu a Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Osmotický stres je důležitým faktorem ovlivňujícím růst rostlin, vývoj, morfogenezi a tvorbu sekundárních metabolitů. U několika druhů léčivých rostlin byla hlášena zvýšená produkce sekundárních metabolitů z tkáňových kultur in vitro za optimálního osmotického stresu (Kim a kol. 2001; Wang a kol. 1999; Wu a kol. 2005). Sacharóza je obvyklé činidlo osmotického stresu používané v těchto případech a slouží také jako životně důležitý zdroj uhlíku a energie. Proto je velmi obtížné oddělit vliv osmotického stresu a nutriční roli cukrů jako zdrojů uhlíku. Zvýšení počátečního osmotického stresu s nemetabolickým mannitolem, sorbitolem a PEG také zlepšilo akumulaci paklitaxelu v buněčných kulturách Taxus Chinensis, akumulaci saponinu a polysacharidů v buněčných kulturách Panax notoginseng a akumulaci eleuterosidů v embryogenních kulturách Eleutherococcus sessiliflorus (Zhang et 95). a kol., 2001; Shohael a kol., 2006). Jejich výsledky ukázaly, že účinky koncentrace sacharidů a osmotického stresu byly různé podle rostlinných druhů a sekundárních metabolitů.

Cíl této studie je zaměřen na osmotické účinky sacharózy, mannitolu, PEG a NaCl na buněčný růst a biosyntézu PeGs vCistanche deserticolabuněčné suspenzní kultury. Aktivita PAL v suspenzních kulturách byla zkoumána pod různými kombinacemi výchozích osmotických činidel a je diskutován možný mechanismus zlepšené akumulace PeGs zvýšením osmotického stresu.

Materiály a metody

Rostlinné materiály a indukce kalusu

Semena zCistanche deserticolaYC Ma byly shromážděny z pouštních oblastí v provincii Xinjiang v Číně a před použitím uloženy ve 4C. Botanická identita byla potvrzena srovnáním s referenčními standardy v Botanickém ústavu Čínské akademie věd, PR Čína. Semena byla povrchově sterilizována ponořením do 70% ethanolu po dobu 30 s, poté byla ponořena do 20% vodného roztoku 5,4% chlornanu sodného ve vodě na 20 minut a následně třikrát opláchnuta sterilní destilovanou vodou. Kalusy byly indukovány z povrchově sterilizovaných semenCistanche deserticolana MS (Murashige a Skoog 1962) médiu doplněném 1.0 mg l–1 kyseliny naftalenoctové (NAA), 2.0 mg l–1 6-benzyl adeninu ({{7} }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-kyselina dichlorfenoxyoctová (2, 4-D), 6 gl–1 agaru (PhytoTechnology LaboratoriesTM, ID produktu: A181) a 30 gl-1 sacharózy po dobu 60 dnů v růstové skříni ve tmě při 25 °C. Kultury kalusu indukované ze semenných explantátů byly následně subkultivovány do výše uvedeného pevného média v intervalu 30 dnů (Cheng et al. 2005a).

Zakládání a udržování buněčných suspenzních kultur

Suspenzní kalusové kultury (3,{1}} g čerstvé hmotnosti), které byly filtrovány přes síto 1,000 lm mesh a uchovány na sítu 200 lm mesh, byly subkultivovány na 500-ml Erlenmeyerově sítu baňka obsahující 100 ml výše uvedeného kapalného média na rotační třepačce při 110 otáčkách za minutu při 25 °C ve tmě v intervalu subkultivace 18 dnů. pH média bylo před autoklávováním upraveno na 5,8 pomocí 1 M NaOH nebo 1 M HC1. Suspenzní kalusové kultury subkultivované desetkrát byly použity jako inokulum pro následující experimentální kultivaci v baňkách. Všechny baňkové experimenty byly prováděny v 250 ml Erlenmeyerových baňkách obsahujících 50 ml kapalného média s 30 gl-1 sacharózy a naočkováno 1,5 g čerstvé hmotnosti 18-den starých kultur buněčné suspenze. Tyto Erlenmeyerovy baňky byly inkubovány na rotační třepačce (110 otáček za minutu) při 25 °C ve tmě.

Experiment s osmotickým stresem

Zkoumat vliv počáteční koncentrace sacharózy narůst buněk a akumulace PeGs,Cistanche deserticolasuspenzní kultury byly kultivovány v médiu MS s 87,6,175,3 a 262,9 mM sacharózy. Pro podmínky osmotického stresu,Cistanche deserticolasuspenzní kultury byly inkubovány v MSmédiem obsahujícím 87,6 mM sacharózy v kombinaci s164,7 mM mannitolu. Jiná osmotická činidla (PEG 4, 000 aNaCl) byly přidány v ekvivalentu osmolarity87,6 mM sacharózy. Osmotické ekvivalentní koncentraceosmotických činidel bylo experimentálně stanoveno jako PEG4, 000 20 mM a NaCl 50 mM, v daném pořadí. Ve všech experimentech a všech hodnotách byly použity trojité baňkybyly průměry z trojitých baněk ± SD.

Analýza

Cistanche deserticolakultivované buňky pod různým osmotickým stresem byly pozorovány světelným mikroskopem Nikon AFX-DX (Nikon, Japonsko) při 400-násobném zvětšení. Osmolarita kultivačního média byla měřena osmometrem pro tlak par (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). Pro stanovení čerstvé hmotnosti (FW) jeCistanche deserticolabuňky byly jemně přitlačeny na filtrační papír k odstranění přebytečné vody a zváženy. Následně byly buňky sušeny v sušárně při 60 °C po dobu 24 hodin a byla zaznamenána suchá hmotnost (DW). Koncentrace zbytkového cukru byla stanovena pomocí fenolu a koncentrované kyseliny sírové, za použití glukózy jako standardu (Dubois et al. 1956).

PeG byly extrahovány z vysušených buněk methanolem po dobu 15 minut při 60 °C v ultrazvukové vodní lázni (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Čína) s frekvencí 40 kHz a výkonem 100 W. Filtrát byl zahuštěn a zbytek se rozpustí v destilované vodě a poté se nechá projít kolonou s makroretikulární pryskyřicí (AB-8, chemický produkt univerzity Nankai, Tianjin, Čína). Methanolový eluát byl shromážděn a celkový obsah PeGs byl testován při 333 nm za použití echinakosidu jako standardu (Du a Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Životaschopnost buněk byla odhadnuta redukcí 2, 3, 5-trifenyltetrazoliumchloridu (TTC) (Steponkus a Lanphear 1967). Index životaschopnosti je definován jako absorbance měřená na gram čerstvé tkáně. Stanovení aktivity PAL bylo založeno na metodě Koukola a Conna (1961). Jedna jednotka aktivity PAL (U) je definována jako velikost variace absorbance 0,01.

Výsledky a diskuse

Vliv počáteční koncentrace sacharózy na buněčný růst a biosyntézu PeGs v buněčných suspenzních kulturáchCistanche deserticola.Odezva naCistanche deserticolabyly testovány buněčné suspenzní kultury na počáteční koncentraci sacharózy mezi 87,6 a 262,9 mM. Jak je znázorněno na obr. 1, buňky rostly a akumulovaly rychle PeGs při nízké počáteční koncentraci sacharózy 87,6 mm a buněčný růst a akumulace PeG byly zjevně potlačeny při vysoké počáteční koncentraci sacharózy 262,9 mM. Poměr čerstvé hmotnosti k suché hmotnosti se snížil, když se počáteční koncentrace sacharózy zvýšila z 87,6 z 262,9 mM (data nejsou uvedena). Maximální sušina 15,9 gl–1 a obsah PeGs 20,7 mg g–1-DW byly získány 30. den při počáteční koncentraci sacharózy 175,3 mM, jejíž osmolarita byla asi 300 mOsm kg–1. Pod mikroskopickým pozorováním byly buněčné stěny odděleny od jejich cytoplazmy při nejvyšším osmotickém stresu 388 mOsm kg–1, kdy počáteční koncentrace sacharózy byla 262,9 mM (obr. 2), a nejvyšší osmotický stres by mohl narušit metabolismus buněk a vést k závažné potlačení růstu a pokles biosyntézy PeGs. Podobný jev byl také pozorován v suspenzních kulturách suspenzních buněčných kultur T. Chinensis a optimální koncentrace sacharózy pro produkci paclitaxelu byla 175,3 mM (Kim et al. 2001). Nicméně počáteční koncentrace sacharózy 204,5 mM byla prospěšná pro růst buněčných kultur E. sessiliflorus. Vyšší koncentrace sacharózy 262,9 mM zvýšila biosyntézu eleuterosidů, fenolu a flavonoidů v kulturách Eleutherococcus (Shohael et al. 2006). Je zřejmé, že počáteční koncentrace sacharózy je důležitá pro růst a akumulaci sekundárních metabolitů rostlinných buněčných kultur a její účinek souvisí se specifickou buněčnou linií.

Vliv různých osmotických činidel na buněčný růst a biosyntézu PeGs v buněčných suspenzních kulturách C. deserticola

Pochopit osmotickou roli metabolické sacharózy a dalších nemetabolických chemických substrátů na biosyntézu PeGs v buněčných suspenzních kulturáchCistanche deserticolabyla provedena řada experimentů s použitím sacharózy kombinované s nemetabolickými osmotickými činidly (mannitol, PEG a NaCl). V těchto experimentech bylo do média obsahujícího 87,6 mM sacharózy přidáno 164,7 mM manitolu, 20 mM PEG a 50 mM NaCl a počáteční osmolarita byla přibližně 300 mOsm kg–1, což byly ekvivalentní osmotické podmínky srovnatelné s médiem s 175,3 mM. sacharóza.

Jak je znázorněno na obr. 3a, b, přidání mannitolu (nemetabolické osmotické činidlo) a PEG (nepermeabilní osmotické činidlo) mírně inhibovalo rychlost buněčného růstu, ale významně zvýšilo biosyntézu PeGs vCistanche deserticolabuněčné suspenzní kultury. Maximální obsahy PeGs 26,9 a 23,8 mg g–1-DW byly získány 21. den, kdy byly buňky pěstovány v kombinacích 87,6 mM sacharózy se 164,7 mM manitolu (303 mOsm kg–1) nebo 20 mM PEG (299 mOsm kg-1). Částky PeG byly vyšší než částkyCistanche deserticolabuněčné kultury pěstované v kapalném médiu MS s počáteční koncentrací sacharózy 175,3 mM v den 30. Cukr byl spotřebován postupně v průběhuCistanche deserticolabuněčná kultura, a pak cukrem indukovaný osmotický stres odpovídajícím způsobem poklesl (obr. 3c, d). Osmotický stres kapalného média s počáteční koncentrací sacharózy 175,3 mM klesl z 280 na 110 mOsm kg-1, když se PeG v buněčných kulturách začaly hromadit v den 9 a dosáhly svého maxima v den 30 (data nejsou uvedena). Nemetabolické osmotické látky (mannitol a PEG) nebyly v průběhu buněčné kultury spotřebovány, což umožnilo udržet osmotický stres kapalného média mezi 200 a 280 mOsm kg–1, což je osmotický tlak příznivý pro biosyntézu PeGs. Tyto výsledky ukázaly, že samotný osmotický stres hrál důležitou roli ve zvýšení biosyntézy PeGs vCistanche deserticolabuněčné kultury.

Bylo popsáno, že přidání NaCl zlepšilo biosyntézu indolových alkaloidů a saponinů v buněčných kulturách Catharanthus roseus a Panax ginseng (Smith et al. 1987; Wu et al. 2005), ale léčba NaCl potlačila buněčný růst T. Chinensis nevykazují žádný rozdíl v biosyntéze palitaxelu (Kim et al. 2001). Proto je u každého případu nutné podrobné vyšetření. Přidání osmotického ekvivalentu 50 mM NaCl potlačilo buněčný růst a biosyntézu PeGs. Tento výsledek může být způsoben propustnou povahou NaCl, která není prospěšná pro buněčné kultury tohoto pouštního rostlinného druhu, který velmi dobře snáší stres ze sucha.

Obr. 3 Vliv kombinací sacharózy a dalších nemetabolických osmotických činidel na buněčný růst (a), akumulaci PeGs (b), spotřebu cukru (c) a změnu osmotického stresu (d) v průběhu buňky C. deserticola kultura. Hodnoty jsou průměry z trojitých baněk ± SD

Vliv různých osmotických činidel na životaschopnost buněk a aktivitu PAL v buněčných suspenzních kulturách Cistanche deserticola

V našich předchozích studiích (Cheng et al. 2005b, 2006) přidání elicitoru dramaticky stimulovalo biosyntézu PeGs vCistanche deserticolabuněčných kultur a stimulace byla korelována se zvýšenou aktivitou PAL, prvního klíčového enzymu v biosyntéze PeGs (Hahlbrock a Grisebach 1979). Jak je znázorněno na obr. 4, přidání nemetabolického 164,7 mM manitolu nebo 20 mM PEG do MS kapalného média obsahujícího 87,6 mM sacharózy mírně snížilo životaschopnost buněk, ale významně zvýšilo aktivitu PAL, která byla vyšší než aktivita vyvolaná počáteční koncentrací sacharózy 175,3 mM. Zvýšená akumulace PeGs vCistanche deserticolabuněčných suspenzních kultur souvisí se zvýšením aktivity PAL stimulované samotným osmotickým stresem. Počáteční koncentrace sacharózy 175,3 mM v kapalném médiu MS způsobila pokles životaschopnosti buněk za 15 dní a inhibovala aktivitu PAL za 21 dní. Po období konzumace cukru pěstovánímCistanche deserticolabuněčných kultur, jak buněčná životaschopnost, tak PAL aktivita kultivovaných buněk vzrostly a dosáhly svého maxima 24. a 30. den, v daném pořadí. Bylo také pozorováno, že zvýšená aktivita PAL osmotickým stresem zlepšuje biosyntézu saponinů v buněčných kulturách P. ginseng a akumulaci alkaloidů v buňkách kultivovaných C. roseus (Godoy-Hernandez et al. 2000; Wu et al. 2005). Nicméně přidání propustného NaCl do MS kapalného média obsahujícího 87,6 mM sacharózy snížilo životaschopnost buněk a inhibovalo aktivitu PAL během celé kultivační periody. Výsledkem bylo, že jak buněčný růst, tak biosyntéza PeGs byly zjevně potlačeny.

Obr. 4 Variace buněčné životaschopnosti (a) a aktivity PAL (b) v buněčných kulturách C. deserticola při různém osmotickém stresu v průběhuCistanche deserticolabuněčná kultura. Hodnoty jsou průměry z trojitých baněk ± SD

Cistanche deserticolaje pouštní druh a výzkum pouštních druhů in vitro buněčných kultur přinesl nové výzvy a příležitosti pro pochopení fyziologie rostlin a ekologických adaptací. V této studii jsme vyvinuli systém s potenciálem studovat dráhu biosyntézy signální transdukce zprostředkovanou osmotickým stresem a systém poskytl základ pro produkci PeG ve velkém měřítku pomocíCistanche deserticolabuněčné kultury prostřednictvím nové strategie regulované osmotickým stresem.

Poděkování

Autoři děkují za finanční podporu z Programu výzkumu inovací Čínské akademie věd.

Z: "Zvýšení biosyntézy fenylethanoidních glykosidů v buněčných kulturách Cistanche deserticola osmotickým stresem" od Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Reference

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolabuněčné suspenzní kultury: Biosyntéza fenylethanoidních glykosidů a antioxidační aktivita. Process Biochem 40:3119–3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Opakovaná elicitace zvyšuje akumulaci fenylethanoidových glykosidů v buněčných suspenzních kulturáchCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Zlepšení biosyntézy fenylethanoidových glykosidů v suspenzních kulturách buněk Cistanche deserticola elicitorem chitosanu. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Stanovení fenylethanoidových glykosidů vCistanche deserticolamakroretikulární pryskyřicovou spektrofotometrií. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Izolace a identifikace fenylethanoidových glykosidů zCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Kolorimetrické metody pro stanovení cukru a příbuzných látek. Anal Chem 28:350-357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Expozice kyselině trans-skořicové osmoticky stresovaných buněk Catharanthus roseus kultivovaných v 14-l bioreaktoru zvyšuje akumulaci alkaloidů. Biotechnol Lett 22:921-925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Enzymové kontroly v biosyntéze liginu a flavonoidů. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Vliv osmotického tlaku na produkci paclitaxelu v suspenzních buněčných kulturách Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Metabolismus aromatických a vlastnosti fenylalanindeaminázy z Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692-2698
Lu MC (1998) Studie o sedativním účinkuCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Zlepšení produkce fenylethanoidových glykosidů houbovým elicitorem v buněčné suspenzní kultuřeCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Revidované médium pro rychlý růst a biologické testy s kulturami tabákové tkáně. Plant Physiol 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Vliv prvků vzácných zemin na růstCistanche deserticolabuňky a produkci fenylethanoidových glykosidů. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Zvýšení produkce eleuterosidů v embryogenních kulturách Eleutherococcus sessiliflorus v reakci na osmotický stres vyvolaný sacharózou. Process Biochem 41:512–518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Použití organických a anorganických sloučenin ke zvýšení akumulace indolových alkaloidů v suspenzních kulturách buněk Catharanthus roseus (L.) Don. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Zdokonalení trifenyltetrazoliumchloridové metody stanovení poškození chladem. Plant Physiol 42:1423–1426Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Významné zlepšení produkce taxanu v suspenzních kulturách Taxus Chinensis strategií krmení sacharózou. Process Biochem 35:479–483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Scavenging effect of glykosidůCistanche deserticolana volné radikály a její ochranu před poškozením DNA indukovaným OH in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Zvýšení produkce saponinů v buněčné kultuře ženšenu Panax osmotickým stresem a krmením živinami. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Vliv osmotického tlaku na buněčný růst a produkci ženšenového saponinu a polysacharidu v suspenzních kulturách Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Srovnání meziCistanche deserticolaYC Ma a Cistanche tubulosa (Scheak) Mají některé farmakologické aktivity. Tradit Chin Med J 21:436–438