Účinky Glyeosidů Cistanche na učení kognice a synaptickou plasticitu u modelových krys s nedostatkem spánku

ABSTRAKTNÍ

Objektivní:Prozkoumat, zda glykosidy cistanche mohou zlepšit učení a kognitivní funkce modelových krys s deprivací spánku regulací synaptické plasticity.

Metody: Padesát samců potkanů ​​Wistar bylo náhodně rozděleno do slepé kontrolní skupiny (kontrola), kontrolní skupiny na platformě (PC), modelové skupiny (model),glykosidy cistanche skupiny (GC)a estazolamová skupina (Est). Model spánkové deprivace krys byl připraven modifikovanou multiplatformní metodou vodního prostředí. Morrisovo vodní bludiště a test v otevřeném poli byly použity k detekci prostorových kognitivních funkcí a emočních změn potkanů. Nissl barvení bylo použito k pozorování změn v morfologii a množství nervových buněk vhipokampální CAL oblast krys. Western blot a R'T - PCR byly použity k detekci hladin exprese synaptofysinu (SY'N), postsynaptické membránově denzní substance 95 (PSD -95) aneurotrofický faktor odvozený z mozku (BDNF). 

Výsledky;Výsledky Morrisova vodního bludiště ukázaly, že ve srovnání s kontrolní skupinou,schopnost učení a kognitivní schopnosti krysve skupině Model byl významně snížen (P<0. 05 ), and the learning and memory function of rats waszlepšená léčba GC ( P <0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05 ), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05 ), the resting time increased ( P <0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T - PCR showed that the hladiny proteinové a genové exprese BDNF, SYN a PSD -95ve skupině Mlodel byly významně sníženy (P<0. 05 ), while after treatment with GCs, the expression levels ofBDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05). Conclusion: Glycosides of cistanche may af. feet synaptic plasticity by regulating the expression of synaptic-related markers, thereby improving the learning and cognitive function of sleep deprivation model rats.

BYLINNÉ DOPLŇKY PŘÍPRAVKU CISTANCHE PROZLEPŠENÍ UČENÍ A KOGNITIVNÍ FUNKCE

KLÍČOVÁ SLOVAGlykosidy cistanche; hippocampus; Spánková deprivace; Učení a paměť; Úzkost; Synaptická plasticita

Porucha spánku (SD)je afunkční porucha abnormálního spánkuzpůsobené řadou složitých faktorů, jako je napřnespavost, zasněnostasnadné probuzení. v posledních letechvýskyt SDse postupně zvyšuje. Související studie uvádějí, že SD může způsobitkardiovaskulární onemocnění,metabolická dysfunkce,imunitní onemocněníacentrální nervový systémdegenerativní onemocnění, jako je Alzheimerova choroba [1]. SD může způsobit oxidační poškození hipokampálních neuronů, způsobit kognitivní dysfunkci a způsobit změny nálady, jako je úzkost a deprese [2]. Cistanche deserticola je vzácný léčivý materiál, který lze v Číně používat jako lék i jako potravinu. Má účinky tonizace ledvin a doplňování qi, zvlhčuje střeva, podporuje pohyby střev a posiluje jang. Hlavní extrakt z Cistanche deserticola, glykosidy cistanche (GC), má antioxidační, antiapoptotické, játra chránící a neuroprotektivní účinky [3]. Náš předchozí výzkum zjistil, že GC mohou zlepšit učení a kognitivní funkce myší SAMP8 tím, že hrají antioxidační a antiapoptotické role [4].

Související studie ukázaly, že kognitivní dysfunkce způsobená SD úzce souvisí se synaptickou plasticitou [5]. Existuje však jen málo zpráv o mechanismu, kterým GC regulují synaptickou plasticitu a zlepšují poruchy učení a paměti a kognitivní pokles u potkanů ​​vyvolaný spánkovou deprivací. Tato studie si proto klade za cíl prozkoumat, zda GC ovlivňují synaptickou plasticitu regulací exprese synaptických markerů, a tím zlepšují učení a kognitivní funkce potkanů ​​s modely spánkové deprivace, a poskytují nové léčebné nápady a plány pro GC k léčbě učení a kognitivních funkcí. poškození způsobené poruchami spánku.

1 Materiály a metody

1.1 Pokusná zvířata

Samci potkanů ​​Wistar ve věku 6 až 8 týdnů o hmotnosti 280 až 300 g byli zakoupeni od Beijing Sibeifu s licencí na živočišnou výrobu [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Všechna zvířata byla chována ve Animal Experiment Center of Baotou Medical College za následujících podmínek: teplota (24 ± 1) stupeň, vlhkost 50 % až 55 %, 12 h světlo a 12 h tma a bez omezení na jídlo a vodu. Tento experiment schválila školní etická komise [Baoyi Lunshen 2022 č. (63)].

1. 2 Hlavní činidla a přístroje

Celkové glykosidy Cistanche deserticola byly zakoupeny od Chengdu Xiyu Cistanche Biotechnology Co., Ltd. (číslo šarže: KSM20220609011); Estazolamové tablety byly zakoupeny od CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (číslo šarže: 044220343); proteinový nanášecí pufr (P1015), RIPA lyzační pufr (R0010), chemiluminiscenční roztok (PE0010) atd. byly zakoupeny od Beijing Solebao; protilátka postsynaptické hustoty v 95 (PSD-95) (AB192757) a protilátka synaptofyzin (SYN) (ab32127) byly zakoupeny od Abcam, USA Company; mozkový neurotrofní faktor (BDNF) (48503-2) a -aktin (52901) byly zakoupeny od SAB Company, USA; kozí anti-králičí IgG sekundární protilátka (SA00001-20) byla zakoupena od Proteintech Company, USA; potkaní melatonin (MT) a ELISA Scientific Research Kit (MM-0657R1) byly zakoupeny od Jiangsu Enzyme Immunoassay Industry Co., Ltd. Paraffin slicer (Leica, Německo); optický mikroskop (Leica, Německo);

Morrisovo vodní bludiště, testovací box v otevřeném poli (Shanghai Xinruan); zařízení pro vertikální elektroforézu (Beijing Liuyi Company); odbarvovací třepačka (Beijing Liuyi Company); proteinový zobrazovací analytický systém (Shanghai Tanon Technology); fluorescenční kvantitativní PCR přístroj (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1.3 Experimentální metody

1.3.1 Seskupování zvířat a podávání léků

50 samců potkanů ​​Wistar bylo náhodně rozděleno do slepé kontrolní skupiny (kontrolní skupina), kontrolní skupiny platformy (kontrola na platformě, skupina PC), modelové skupiny (skupina modelů), celkové glykosidy ze skupiny Cistanche deserticola (skupina GCs , 50 mg/kg) a estazolinovou skupinu (Est skupina, 0,54 mg/kg), s 10 krysami v každé skupině. Kontrolní skupině a skupině PC byl podán 0,9% fyziologický roztok žaludeční sondou. Všem skupinám byla sonda podávána každý den v 7 hodin ráno po začátku modelování a sonda trvala 21 dní.

1.3. 2. Příprava zvířecího modelu spánkové deprivace

Model spánkové deprivace byl vytvořen pomocí modifikované multiplatformní metody vodního prostředí [6]. Experimentálním zařízením byla obdélníková nádrž na vodu z polyetylenové pryskyřice o rozměrech 130 cm × 50 cm × 45 cm. Do vodní nádrže byla umístěna malá plošina o průměru 5 cm a výšce 20 cm. Plošina PC skupiny měla průměr 10 cm a výšku 20 cm. Nádrž na vodu byla naplněna vodou do hloubky asi 18 cm a teplota vody byla udržována na (20 ± 1) stupni. Týden před začátkem experimentu byly krysy umístěny každý den do spánkového boxu na 60 minut, aby se seznámily s prostředím. Po vytvoření modelu, s výjimkou kontrolní skupiny, byly krysy každé skupiny umístěny na malou plošinu v čase od 8:00 do 20:00 každý den kvůli nedostatku spánku po dobu 21 po sobě jdoucích dnů.

Všechny krysy měly volný přístup k potravě a vodě a volně se pohybovaly na plošině. Cyklus světla a tmy byl každý den 12 hodin.

1. 3. 3 Morrisův pokus s vodním bludištěm

Morrisovo vodní bludiště bylo rozděleno do 4 oblastí, naplněno vodou a platforma byla umístěna do 4. kvadrantu. Vodní plocha byla asi 2 cm nad plošinou. Do vody byl přidán jedlý melanin potravinářské kvality a teplota vody byla udržována na (25 ± 1) stupni. (1) Experiment s polohovou navigací: Byl vybrán střed každé oblasti a krysy byly jemně umístěny do vody. Bylo jim dovoleno volně prozkoumávat. Byla zaznamenána doba, za kterou krysy během 60 sekund našli cílovou platformu. Krysy, které plošinu nenašly, byly navedeny na plošinu a zůstaly tam 20 sekund. Školení pokračovalo po dobu 5 dnů. (2) Test prostorového průzkumu: 6. den byla plošina odstraněna a krysy byly umístěny do vody ze středu 2. kvadrantu ke stěně. Zaznamenával se, kolikrát krysy prošly plošinou během 120 s a doba, po kterou zůstaly ve 4. kvadrantu.

1. 3. 4 Experiment v otevřeném terénu

Byla použita experimentální krabice o rozměrech 100 cm × 100 cm × 50 cm a dno krabice bylo rozděleno na 9 mřížek. Každá skupina krys byla předem umístěna do otevřené experimentální místnosti, aby se adaptovala na vnitřní prostředí po dobu 60 minut. Na začátku experimentu byly testované krysy umístěny do pevných rohů experimentálního boxu v otevřeném poli a počet dob ​​stání, vzdálenost pohybu a statický čas krys během 5 minut byly zaznamenány pomocí softwaru pro analýzu chování. Během experimentu bylo požadováno, aby bylo prostředí klidné a experimentální zařízení bylo mezi dvěma experimenty otřeno vodou a alkoholem, aby se zabránilo tomu, že pach první krysy ovlivní úsudek chování další krysy.

1. 3. 5 Enzymově vázaný imunosorbentní test (ELISA)

Detekce hladin MT v séru u krys Krysy byly anestetizovány intraperitoneální injekcí a z břišní aorty bylo odebráno 5 ml krve. Po čekání 30 minut při teplotě místnosti byla krev odstředěna, aby se získalo sérum. Do každé jamky bylo přidáno 40 μl ředidla vzorků a poté bylo přidáno 10 μl vzorku, který měl být testován. Po uzavření těsnící fólií byla destička inkubována při 37 stupních po dobu 30 minut. Promyto 5krát, bylo přidáno 50 ul roztoku pro značení enzymů a destička byla uzavřena těsnící fólií a inkubována při 37 stupních po dobu 30 minut. Pětkrát promyto a poté byly postupně přidány roztok vyvíjející barvu a roztok pro ukončení reakce. Hodnota OD každé jamky byla měřena enzymovým značkovačem při vlnové délce 450 nm.

1. 3. 6 Barvení Nissl

Z každé skupiny byly vybrány tři krysy a mozková tkáň byla odstraněna dekapitací a fixována 4% roztokem polyoxyethylenu. Tkáň byla dehydratována, ponořena do voskového roztoku, zalita a rozřezána běžnými metodami. Řezy byly udržovány v tloušťce 5 μm, opláchnuty PBS, obarveny 0,1% toluidinovou modří po dobu 0,5 h, diferencovány 95% alkoholem, dehydratovány 100% alkoholem, zprůhledněny xylenem a utěsněno neutrální gumou. Změny v morfologii a počtu neuronů v oblasti CA1 krysího hipokampu byly pozorovány pod mikroskopem a byly shromážděny snímky.

1. 3. 7 Experiment Western blot

Z každé skupiny byly vybrány čtyři krysy a hippocampus byl izolován dekapitací. Tkáň hippocampu byla smíchána s lyzačním pufrem RIP A v prostředí ledové lázně a tkáň byla odstředěna, aby se získal supernatant. Koncentrace proteinu byla detekována metodou BCA. 20 ug proteinu bylo přidáno s proteinovým nanášecím pufrem pro elektroforézu. Po dokončení elektroforézy proteinu byla membrána přenesena při konstantním průtoku 300 mA, blokována 5% sušeným odstředěným mlékem, primární protilátka byla inkubována při 4 stupních přes noc a sekundární protilátka byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po použití roztoku pro vyvolání barvy byly proteinové pásy statisticky analyzovány pomocí chemiluminiscenčního zobrazovacího analytického systému.

1. 3. 8 Experiment RT-PCR

Z každé skupiny byly vybrány tři krysy pro přípravu homogenátu hipokampální tkáně. Celková RNA v tkáňovém moku byla extrahována metodou Trizol a byla měřena koncentrace. Pro reverzní transkripci byla použita souprava pro syntézu fastking cDNA a byla provedena fluorescenční kvantitativní amplifikační reakce s použitím fluorescenční kvantitativní soupravy pro detekci relativní hladiny exprese synaptického proteinu mRNA. Výsledky byly analyzovány pomocí 2-ΔΔCt. Sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1 Sekvence primerů RT-PCR

1.4 Statistické metody

Výsledky dat, které odpovídaly normální distribuci, byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (x ± s) a statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism 9.5. Pro srovnání mezi více vzorky byla použita jednosměrná analýza rozptylu a P < 0,05 indikovala, že rozdíl byl statisticky významný.