Účinky doplňku stravy s glycinem na růstové, imunologické a antioxidační parametry erytrocytů u kapra obecného, ​​Cyprinus Carpio

Jednoduché shrnutí:

Aminokyseliny mají různé zásadní role v růstu a zdraví ryb. Mezi nimi byly neesenciální aminokyseliny v akvakultuře studovány méně, ale mají mnoho fyziologických rolí. Glycin je neesenciální aminokyselina, která se podílí na struktuře glutathionu a je také zapojena do antioxidačního systému ryb. Glycin navíc stimuluje imunitní systém. Tato studie ukazuje, že období 8 týdnů krmení dietami doplněnými o 5 g/kg glycinu může zlepšit růstovou výkonnost, stabilitu erytrocytů a humorální a slizniční imunitu u kapra obecného. Současné výsledky lze tedy využít při výrobě kapří stravy k podpoře vyššího růstu a zdraví.

Abstraktní:

Účinky suplementace glycinu ve stravě, 0 (kontrola), 5 (5 GL) a 10 (10 GL) g/kg, byly zkoumány na růstovou výkonnost, hematologické parametry, antioxidační kapacitu erytrocytů, humorální a slizniční imunitu u kapra obecného, ​​Cyprinus carpio. Po osmi týdnech krmení vykazovalo ošetření 5 GL významné zlepšení růstu a účinnosti krmiva ve srovnání s kontrolním ošetřením. Počet červených krvinek (RBC) a bílých krvinek (WBC), hemoglobin, hematokrit, počet/procenta neutrofilů a monocytů, snížený obsah glutathionu (GSH) v červených krvinkách a aktivity alkalické fosfatázy, peroxidázy, proteázy a lysozymu v kůži byly podobné u ryb ošetřených glycinem a významně vyšší než u kontrolního ošetření. Procento krevních lymfocytů se snížilo u ryb ošetřených glycinem, ale počet lymfocytů se zvýšil ve srovnání s kontrolními rybami. Aktivity RBC glutathionreduktázy u ryb ošetřených glycinem byly podobné a významně nižší než u kontrolního ošetření. Nejvyšší aktivity plazmatického lysozymu a alternativního komplementu byly pozorovány při léčbě GL.

Ryby ošetřené glycinem, zvláště 5 GL, významně zlepšily odolnost vůči osmotické křehkosti červených krvinek. Dietní glycin neměl žádný významný vliv na aktivitu glutathionperoxidázy červených krvinek, plazmatický imunoglobulin, procento/počet eozinofilů a hematologické indexy. Závěrem lze říci, že většina výhod suplementace glycinem může být zprostředkována zvýšenou syntézou glutathionu a antioxidační silou.

Klíčová slova: aminokyselina; glutathion; výživa; krvinky; kožní hlen.

Plazmatické imunoglobuliny jsou jednou z nejdůležitějších složek imunitního systému těla. Imunoglobuliny dokážou rozpoznat a vázat patogeny, a tím podporovat jejich eliminaci, vykonávat imunitní funkce a udržovat zdraví. Imunoglobuliny v plazmě zahrnují především tři typy: IgG, IgM a IgA a jejich obsah a poměr úzce souvisí s lidskou imunitou. Za normálních okolností je obsah imunoglobulinů u zdravých lidí relativně vysoký a poměr je koordinovaný. Tento vyvážený stav může účinně odolávat invazi vnějších patogenů. Když je tělo v imunitním stavu, změny v obsahu a poměru imunoglobulinů mohou poskytnout důležitý základ pro prevenci a léčbu nemocí. Například IgM hraje důležitou roli v počátečním rozpoznání a navázání akutní patogenní infekce, takže jeho zvýšení může znamenat akutní infekci nebo období zotavení. Trvalá a stabilní hladina IgG odráží, že fyziologický stav těla je lepší a má lepší schopnost udržovat a zlepšovat imunitní funkce.

Imunita těla tedy úzce souvisí s obsahem a poměrem plazmatického imunoglobulinu a pečlivé sledování a úprava obsahu a poměru plazmatického imunoglobulinu je jedním z důležitých opatření k udržení dobrého zdraví a silné imunity. Z toho je vidět, že je potřeba dbát na zlepšení naší imunity. Kromě zdravé stravy a pohybu v každodenním životě může cistanche také zlepšit imunitu. Cistanche obsahuje celou řadu biologicky aktivních složek, jako jsou polysacharidy, houby, Huangli atd. Tyto složky mohou stimulovat různé buňky imunitního systému a zvýšit jejich imunitní aktivitu.

Klikněte na zdravotní přínosy cistanche

1. Úvod

Aminokyseliny v potravě hrají důležitou roli v růstu a zdraví ryb. Ryby jsou závislé na přísunu potravy, aby splnily požadavek určitých aminokyselin, nazývaných esenciální aminokyseliny. Tyto aminokyseliny nemohou být v těle ryby syntetizovány [1]. Ryby však mohou syntetizovat i jiné aminokyseliny, pokud jsou k dispozici určité substráty, enzymy a kofaktory. Většina studií o požadavcích na aminokyseliny u ryb se zaměřila na esenciální aminokyseliny, ale měly by se zaměřit i na neesenciální aminokyseliny. Tyto aminokyseliny, i když mohou být syntetizovány v těle ryb, mají mnoho důležitých fyziologických rolí životně důležitých pro zdraví a welfare ryb [2,3]. Konvenční definice esenciálních/neesenciálních aminokyselin byla tedy nedávno zpochybněna výzkumníky.

Glycin je jednou z neesenciálních aminokyselin v rybách jako ostatní zvířata, ale má mnoho důležitých fyziologických funkcí [2]. Glycin se podílí na tvorbě kolagenu a 33 procent kolagenu je vyrobeno z této aminokyseliny [4]. Glycin se navíc ve spolupráci s glutamátem a cysteinem podílí na syntéze glutathionu, silné a důležité antioxidační molekuly [5]. Glycin tedy moduluje antioxidační systém. Tato aminokyselina má různé role v imunitní funkci. Bylo zjištěno, že pokles koncentrace glycinu v krevním séru zvyšuje sérovou rezistenci různých lidských patogenů [6]. Studie o nilské tilapii, Oreochromis niloticus, odhalila, že metabolické dráhy glycinu jsou nejdůležitějšími cestami v prevenci úmrtnosti ryb infikovaných Edwardsiella tarda [7].

Existuje několik studií týkajících se účinků dietního glycinu na ryby, ale výsledky nejsou konzistentní. Například tilapie nilská vykazovala výrazné zvýšení růstového výkonu, když byla krmena stravou doplněnou 5 g/kg glycinu. Dietní glycin nedokázal ovlivnit různé hladiny metabolitů v plazmě a/nebo jaterních metabolitech, aktivity antioxidačních enzymů, aktivity lysozymu/myeloperoxidázy a obsah malondialdehydu (MDA). Experimentální výzva se Streptococcus iniae ukázala, že glycin nezlepšil odolnost vůči onemocnění a ostatní antioxidační/imunologické odpovědi byly podobné jako před výzvou, s výjimkou zvýšení plazmatické superoxiddismutázy (SOD), glutathionreduktázy (GR) a myeloperoxidázy. činnosti [8].

Studie na okouně velkoústém, Micropterus salmoides, odhalila, že rostlinná strava doplněná 20 g/kg glycinu byla prospěšná pro prevenci zpomalení růstu a nedostatku střevních klků ve srovnání s dietou založenou na rybí moučce. Žádná změna v jaterní SOD a aktivitě glutathionperoxidázy (GPx) a zvýšení obsahu MDA v játrech a plazmatické aktivity alaninaminotransferázy naznačují možné jaterní problémy u ryb [9]. Hoseini a Moghaddam [10] prokázali, že suplementace glycinu nemá žádný významný vliv na růstovou výkonnost beluga, Huso huso. Počet bílých krvinek (WBC), hladina glutathionu (GSH) snížená v plazmě, aktivity GPx, lysozymu a komplementu se zvýšily při hladinách glycinu 2,5 a/nebo 5 g/kg, což naznačuje antioxidační a imunomodulační účinky glycinu; nicméně významné zvýšení obsahu MDA v plazmě při 5 a 10 g/kg glycinu ztěžuje uvěřit antioxidačním účinkům glycinu na tento druh.

Naše předchozí studie na kaprovi, Cyprinus carpio, ukázala, že 3-týdenní období krmení 2,5–10 g/kg glycinu je prospěšné pro zlepšení plazmatického lysozymu (5 a 10 g/kg glycinu), GPx ( 2,5–10 g/kg glycinu), aktivity glutathion-s-transferázy (GST; 10 g/kg glycinu) a obsah GSH (5 a 10 g/kg glycinu), ale snižuje plazmatickou katalázu (CAT; 5 a 10 g /kg glycinu) a nemá žádný významný vliv na plazmatickou MDA [11]. 8-týdenní krmení stejnými dietami ukázalo, že glycin neměl na ryby žádné účinky na podporu růstu, ačkoli bylo pozorováno numerické zlepšení o ~10,5 % a 12,5 procenta v rychlosti růstu ryb a účinnosti krmiva. Plazmatická SOD, CAT, GPx a GST zůstala nezměněna, ale plazmatické GSH a MDA se zvýšily a snížily [12]. Tyto studie naznačují, že jsou zapotřebí další hodnocení ke zlepšení současných znalostí o účincích glycinu v potravě u ryb.

Výše uvedené studie se například soustředily na omezený počet parametrů humorální vrozené imunity (lysozym, komplement, myeloperoxidáza, aktivity respiračního vzplanutí a WBC) a opomíjely další, jako jsou imunitní parametry kožní sliznice. Toto je důležité téma s ohledem na několik imunologických rolí glycinu uváděných u savců [13] a jeho konkrétní roli ve slizniční imunitě pozorované u prasat [14]. Navíc antioxidační účinky glycinu byly hodnoceny pouze v rybí krvi a játrech, ale bylo prokázáno, že červené krvinky (RBC), jak u savců, tak u ryb, aktivně pumpují glycin do své cytoplazmy [15,16], aby podpořily syntézu glutathionu. a udržovat vnitřní antioxidační kapacitu. Glycin je také klíčovou složkou syntézy hemu tím, že se podílí na produkci 5-aminolevulové kyseliny; inhibice importu glycinu erytroidem vedla k narušené syntéze hemu u savců [17].

Vzhledem k omezeným informacím o úloze glycinu v potravě u ryb (ve srovnání se savci) byla tato studie navržena tak, aby zhodnotila účinky glycinu v potravě na růstovou výkonnost, kožní slizniční a humorální imunitní parametry, hematologické parametry, antioxidační kapacitu červených krvinek a sklon k hemolýza u kapra obecného.

2. Materiály a metody

2.1. Diety

Ve světle předchozích studií [11,12] jsme pro suplementaci zvolili 5 (5 GL) a 10 (10 GL) g/kg glycinu, ale snížili jsme bazální (endogenní) hladinu glycinu (z 19,8 na 16,1 g/kg) snížením množství vedlejších produktů z drůbeže ve stravě, aby se zjistilo, zda suplementace glycinu v rostlinné stravě (nízký obsah vedlejších produktů z drůbeže) může podpořit maximální růst. Zahrnuta byla také kontrolní dieta bez suplementace glycinem (CTL). Krmivo (kukuřičný šrot, pšeničný šrot, sójový šrot, bavlníkový šrot, vedlejší produkt konzervování ryb a vedlejší produkt z drůbeže) bylo proséváno (200 u) a smícháno v požadovaných poměrech (tabulka 1).

Poté byly ke směsi přidány sojový olej, vitamínové/minerální premixy, aminokyseliny, celulóza a glycin. Ke směsi bylo přidáno asi 400 ml/kg vody a bylo připraveno těsto, které bylo peletováno pomocí mlýnku na maso. Přibližné složení stravy bylo stanoveno (tři vzorky na dietu) na základě standardních metod (Kjeldahlova metoda pro protein; etherová extrakce pro lipid; sušení v sušárně při 70 ◦C pro vlhkost; spalování v peci pro popel a kyselé/zásadité trávení pro vlákninu), jak je popsáno od Hoseini, Moghaddam [10]. Profil aminokyselin v potravě byl stanoven systémem HPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Vzorky byly odtučněny n-hexanem a štěpeny HCl, následovala derivatizace pomocí fenyisothiokyanasy a separace na koloně PICO.TAG a detekce v duálním λ absorbančním detektoru [10].

2.2. Chov ryb

Dvě stě mláďat kapra obecného bylo zakoupeno z místní farmy a umístěno v jedné 1 m3 nádrži na 7 dní, během kterých byli krmeni CTL dietou. Poté bylo vybráno 9 0 zdravých ryb (24,5 ± 0,21 g) jednotné velikosti a náhodně rozděleno do 9 skleněných akvárií. Akvária byla naplněna 50-l dechlorovanou vodovodní vodou s nepřetržitým provzdušňováním. Hustota obsádky byla založena na předchozí studii na stejném druhu ryb [12]. Ryby byly krmeny jednou z výše uvedených diet dvakrát denně (2 procenta biomasy) po dobu 8 týdnů. Každý druhý týden byly ryby z každého akvária odloveny ve velkém a umístěny do nádrže naplněné vodou na digitální váze, aby se zaznamenala biomasa nádrže a úprava množství krmiva. Voda v akváriích se obnovovala o 30 procent každý den a odpady byly odsávány. Teplota vody, pH, rozpuštěný kyslík a celkový amoniak byly 23,8 ± 0,85 ◦C, 7,74 ± 0,68, 6,78 ± 0,74 mg/l, respektive 1,53 ± 0,33 mg/l .

Po 8 týdnech odchovu byly přírůstky hmotnosti (WG), specifická rychlost růstu (SGR) a konverzní poměr krmiva (FCR) zaznamenány následovně:

2.3. Odběr a zpracování vzorků

Na konci období odchovu byly z každého akvária chyceny tři ryby a anestetizovány v 100 µL/L eugenolu. Poté byly odebrány vzorky krve (1 ml na rybu) z rybí kaudální žíly pomocí heparinizovaných injekčních stříkaček. Část 300 ul vzorků čerstvé krve byla použita pro hematologická vyšetření. Další část 200 ul vzorků čerstvé krve byla použita pro test osmotické křehkosti červených krvinek. Pro vytvoření buněčného lyzátu byly sbalené RBC vzorků zmrazené na -70 ◦C a byly přidány dva objemy fosfátového pufru (pH 7,0). Po vortexování byly suspenze odstředěny (6000 x g; 7 min; 4 °C) a supernatanty byly udržovány při -70 °C až do analýzy RBC GSH, GR a GPx. Pro získání plazmy bylo 350 µl vzorků čerstvé krve odstředěno (6000× g; 7 min; 4 °C) a vzorky plazmy byly uchovávány při teplotě -70 °C až do analýzy lysozymu, alternativního komplementu (ACH50) a celkového imunoglobulinu. (Ig).

Vzorky kožního hlenu byly odebrány od tří ryb na nádrž. Ryby byly anestetizovány, jak je uvedeno výše, a vzorky hlenu byly odebrány z dorzolaterálního povrchu drhnutím špachtle. Odebrané vzorky hlenu byly smíchány se stejným objemem fyziologického roztoku pufrovaného Tris (TBS, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Po vortexování byly směsi centrifugovány (13,000× g; 15 min; 4 °C) a supernatanty byly udržovány při -70 °C až do slizničních imunologických testů.

2.4. Analýza

2.4.1. Hematologická vyšetření

RBC a WBC byly počítány pomocí Neubauerovy komory, po zředění roztokem Dacie. Hematokrit (Hct) a hemoglobin (Hb) byly měřeny centrifugací a kyanomethemoglobinovými metodami, v daném pořadí. Střední korpuskulární objem (MCV), průměrný korpuskulární hemoglobin (MCH) a průměrná koncentrace korpuskulárního hemoglobinu (MCHC) byly vypočteny podle Dacie a Lewise [18]. Byl proveden diferenciální počet leukocytů přípravou krevních sklíček obarvených Giemsou.

2.4.2. Plazmatické imunologické parametry

Plazmatická aktivita lysozymu byla stanovena na základě turbidimetrické metody, jak popisuje Ellis [19]. Jako cíl byl použit Micrococcus luteus a suspendován ve fosfátovém pufru (pH 6,2). K 1 ml této suspenze bylo přidáno 25 ul vzorku plazmy a průměrný pokles optické hustoty za minutu byl zaznamenán během 5 minut při 450 nm. Každý pokles optické hustoty o 0,001 za minutu byl považován za jednu jednotku aktivity lysozymu

Plazmatická ACH50 aktivita byla měřena na základě hemolytické metody [20] s použitím ovčích RBC jako cíle ve veronálním pufru obsahujícím hořčík a želatinu (pH 7,0). Sériově zředěné vzorky plazmy byly přidány k suspenzi RBC v pufru a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 60 minut. Bylo odhadnuto množství plazmy vedoucí k 50% hemolýze a použito pro výpočet aktivity ACH50 na ml plazmy.

Plazmatická koncentrace celkového Ig byla stanovena po precipitaci polyethylenglykolem [21]. Stejná množství plazmy a roztoku polyethylenglykolu (12 procent) byla smíchána a udržována za míchání při teplotě místnosti. Po 2 hodinách byla směs odstředěna (6000 x g; 7 min; 4 °C), aby se vysrážel Ig. Rozdíl v proteinu vzorku před a po centrifugaci byl roven celkové koncentraci Ig ve vzorku.

2.4.3. Antioxidační enzymy RBC

Antioxidační parametry červených krvinek byly hodnoceny podle Yousefiho a Hoseiniho [22]. Lyzáty buněk RBC byly rozmraženy a roztoky byly odstředěny, aby se vysrážely jakékoli derby. Supernatanty byly použity pro enzymatické testy. Komerční soupravy (Zellbio Co., GmbH, Deutschland, Německo) byly použity k testování aktivity enzymů. Koncentrace GSH byla měřena na základě reakce s 5,50 -dithiobis-(2-nitrobenzoovou kyselinou) při 412 nm. Princip stanovení GPx byl založen na přidání GSH do vzorků a konverzi GSH na oxidovaný glutathion (GSSG) vzorkem GPx. Výsledný GSSG je recyklován na GSH aktivitou GR, která využívá NADPH. Pokles koncentrace NADPH je úměrný aktivitě GPx a je měřitelný při 340 nm. Pro stanovení aktivity GR se používá stejný protokol, ale místo GSH se do vzorků přidává GSSG. Byla měřena hladina hemoglobinu v roztoku a na jejím základě byly vyjádřeny aktivity enzymů.

2.4.4. Test osmotické křehkosti

Test osmotické fragility RBC byl proveden podle Gao, Liu [23]. Stručně řečeno, 25 µl zabaleného čerstvého RBC bylo přidáno do 1 ml 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{ 11}}.5, 0.6, 0.7, 0.85% roztok chloridu sodného a ponechán při pokojové teplotě po dobu 90 minut. Poté byly suspenze odstředěny (6000 x g; 7 min; 4 °C) a byla měřena absorbance supernatantů při 492 nm. Optické hustoty byly korigovány na základě počtu červených krvinek a MCH. Nejvyšší optická hustota byla považována za 100% hemolýzu a na jejím základě byly vypočteny rychlosti hemolýzy ostatních optických hustot.

2.4.5. Imunologické parametry kožního hlenu

Koncentrace rozpustných proteinů ve vzorcích kožního hlenu byly stanoveny na základě Bradforda [24]. Aktivita peroxidázy kožního hlenu byla stanovena podle Quadea a Rotha [25] s použitím 3,30,5,50 -tetramethylbenzidinu hydrochloridu a peroxidu vodíku jako substrátů při 450 nm. Aktivita proteázy kožního hlenu byla stanovena podle Zhanga, Hu [26] s použitím AZOkaseinu jako substrátu při 350 nm. Aktivita lysozymu kožního hlenu byla stanovena tak, jak je popsáno výše. Aktivita alkalické fosfatázy v kožním hlenu (ALP) byla stanovena pomocí soupravy Parsazmun Co. (Tehran, Iran), podle Hoseinifar, Roosta [27].

2.5. Statistická analýza

Před analýzou byly vypočteny průměry dat na akvárium a použity pro statistickou analýzu (n {{0}}). Po potvrzení normální distribuce dat Shapiro–Wilkovým testem a homogenity rozptylu Leveneovým testem byla data podrobena jednocestné ANOVA. Významné rozdíly mezi ošetřeními byly stanoveny Tukeyovým testem. p < 0,05 bylo považováno za významné a všechny analýzy byly provedeny v SPSS v.22.

3. Výsledky

Výkonnost růstu ryb je uvedena v tabulce 2. FCR při ošetření 5 GL a 10 GL byly významně nižší než u ošetření CTL. Konečná hmotnost, WG a SGR při léčbě 5 GL byly významně vyšší než při léčbě CTL. Mezi léčbami nebyla žádná úmrtnost.

Antioxidační parametry RBC jsou uvedeny v tabulce 3. Obsah GSH se významně zvýšil, protože aktivita GR se významně snížila u ošetření 5 GL a 10 GL ve srovnání s ošetřením CTL. Mezi jednotlivými léčbami nebyl žádný významný rozdíl v aktivitě GPx.

Výsledky testu osmotické fragility jsou uvedeny v tabulce 4. Mezi ošetřeními při koncentracích NaCl 0,1, 0,2, 0 nebyly žádné významné rozdíly v rychlosti hemolýzy. 7 a 0,85 procent . Při koncentraci NaCl 0,3–0,5 procenta byla rychlost hemolýzy při léčbě 5 GL významně nižší než při léčbě CTL. Rychlosti hemolýzy ryb ošetřených glycinem při koncentraci NaCl 0,6 procenta byly významně nižší než při léčbě CTL.

Imunologické parametry kůže slizniční ryb jsou uvedeny v tabulce 6. Nebyly žádné významné rozdíly v obsahu slizničního rozpustného proteinu, lysozymu, peroxidázy, proteázy a aktivit ALP mezi ošetřeními 5 GL a 10 GL; obě vykazovaly významně vyšší hodnoty ve srovnání s léčbou CTL.

4. Diskuze

Glycin přispívá k syntéze strukturálních proteinů a tvoří téměř 9 procent celotělových proteinů u kapra obecného [28]. V této studii suplementace glycinu ve stravě významně zlepšila růstovou výkonnost a účinnost krmiva u kapra obecného, ​​což není podobné naší předchozí studii na stejném druhu [12]. Přesné důvody pro takový rozdíl nejsou jasné; očekávalo se, že rozdíl způsobila nižší hladina glycinu v kontrolní dietě této studie (1,61 procenta) ve srovnání s předchozí (1,98 procenta). Růstový výkon kontrolních ryb ve dvou studiích byl však přibližně podobný.

K takovému rozdílu tedy mohou přispět i jiné faktory. Jedním z vysvětlení může být změna složení aminokyselin mezi těmito dvěma studiemi. Lysin a methionin, dvě hlavní aminokyseliny omezující růst, byly v této studii vyšší než v předchozí studii a suboptimální hladiny těchto aminokyselin ve stravě mají za následek nižší retence dusíku, aminokyselin a glycinu [29,30]. . Současné výsledky jsou v souladu s předchozími studiemi o tilapii nilské [8] a okouně velkoústé [9], že suplementace glycinem ve stravě zlepšila růst ryb. Ačkoli neesenciální aminokyseliny mohou být syntetizovány v tělech ryb, jejich rychlost syntézy může být nedostatečná pro splnění biologických požadavků. Zlepšený růstový výkon při léčbě glycinem v této studii tedy může být způsoben vyšší dostupností glycinu pro splnění požadavků na růst a údržbu.

Hematologické studie poskytují pohled na zdraví ryb a stav mobilizace plynů. Snížení počtu červených krvinek a obsahu hemoglobinu brání okysličení tkání a clearance oxidu uhličitého [31]. Několik studií proto posoudilo roli nutričních manipulací [32–34], včetně suplementace aminokyselin [35–37], na hematologické parametry u různých druhů ryb. Málo je známo o úloze glycinu v hematologických parametrech u ryb. Studie na kanálovém sumci, Ictalurus punctatus, odhalila, že RBC aktivně transportuje glycin do cytoplazmy, který může být použit pro syntézu glutathionu [15], jak bylo pozorováno u savců [17]. Vzhledem k přítomnosti hemoglobinu jsou erytrocyty neustále ohroženy oxidací a glutathion má zásadní roli v prevenci oxidačního stresu červených krvinek [15].

Podle současných výsledků může být zlepšení antioxidačních parametrů souvisejících s glutathionem (zvýšení obsahu GSH a snížení aktivity GR) zodpovědné za vyšší počet červených krvinek a odolnost vůči hemolýze u ryb ošetřených glycinem. Bylo zjištěno, že rybí erytrocyty jsou velmi citlivé na oxidační podmínky, za kterých dochází k významnému poklesu obsahu GSH (který je způsoben oxidací) a ke zvýšení GPx, peroxidaci lipidů a hemolýze [38–40]. Žádná změna v aktivitě GPx v této studii pravděpodobně nenaznačuje žádný rozdíl v oxidačních podmínkách mezi léčbou. Vyšší obsah GSH při ošetření 5 GL a 10 GL může být způsoben zlepšenou syntézou glutathionu za dostupnosti glycinu. Zvýšení syntézy GSH může splnit biologické požadavky buňky, takže není potřeba další recyklace GSSG, což vysvětluje pokles aktivity GR při ošetření 5 GL a 10 GL.

Leukocyty jsou důležité imunitní buňky s různými funkcemi, které pomáhají hostiteli bojovat s cizími zárodky [41]. Bylo zjištěno, že zvýšení WBC po doplňcích stravy zvyšuje odolnost vůči chorobám u různých druhů ryb [42,43]. Pokud jde o glycin, bylo zjištěno, že suplementace stravy zvyšuje počet WBC u beluga [10], podobně jako současné výsledky. Neutrofily jsou první obranné leukocyty, když se ryby setkají s útoky patogenů. Zabíjejí patogeny fagocytózou, která vede k tvorbě reaktivních molekul [44]. Monocyty jsou další imunitní buňky s fagocytární funkcí [45].

Vzhledem k produkci různých prooxidačních molekul těmito buňkami potřebují k přežití silný antioxidační systém. Studie na lidských buňkách odhalily, že glutathion je zásadně nezbytný pro životaschopnost a funkci neutrofilů a monocytů [46,47], ale u ryb jsou k tomuto tématu omezené informace. Studie na kapru odhalily, že obsah glutathionu se zvyšuje v neutrofilech během fagocytózy nebo indukce lipopolysacharidů [48]. Vystavení monocytů nilské tilapie prooxidačnímu činidlu (nanočástice mědi) vyvolalo apoptózu, oxidační stres a vyčerpání obsahu GSH [45].

V souladu s tím se spekuluje, že vyšší počet/procento krevních neutrofilů a monocytů u ryb ošetřených glycinem v této studii byl důsledkem zlepšení obsahu GSH v buňce. Glycin však nemá žádné významné účinky na populaci krevních lymfocytů a snížení procenta lymfocytů u ryb ošetřených glycinem bylo výsledkem zvýšení procenta jiných typů leukocytů. Celkově tyto výsledky naznačují, že suplementace glycinem ve stravě zlepšuje sílu vrozeného imunitního systému.

Lysozym působí jako baktericidní činidlo, které je vylučováno krevními neutrofily v oběhu [49]. Proto se spekuluje, že zvýšení plazmatického lysozymu u ryb ošetřených glycinem bylo způsobeno zvýšením populace krevních neutrofilů nebo jejich produkcí lysozymu. Podobně zvýšení plazmatické aktivity lysozymu bylo doprovázeno zvýšením populace krevních neutrofilů po přidání různých krmných aditiv do stravy ryb [50,51].

Podobně jako v této studii suplementace glycinem ve stravě významně zvýšila aktivitu plazmatického lysozymu u belugy [10] a kapra obecného [11]. Systém komplementu působí u ryb jako činidlo zabíjející a opsonizující zárodky, které se skládá z několika proteinů produkovaných v játrech [52]. Bylo zjištěno, že suplementace glycinem ve stravě zvyšuje aktivitu ACH50 v plazmě u belugy [10]; avšak krátkodobé krmení dietami doplněnými glycinem nevyvolalo žádné významné změny v plazmatické aktivitě ACH50 u kapra obecného [11]. Přesný mechanismus, kterým glycin zlepšuje aktivitu ACH50 v plazmě, není jasný, ale GSH může přispět, protože suplementace glutathionem ve stravě významně zvýšila koncentraci proteinů komplementu v hemolymfě kraba palčáka, Eriocheir sinensis, což může být důsledkem vyššího zdraví hepatopankreatu a syntéza proteinů způsobená dostupností GSH [53].

Proto se spekuluje, že dietní glycin může zvýšit koncentraci GSH, což může být odpovědné za vyšší aktivitu ACH50 v této studii. V různých tkáních ryb, jako jsou játra, kůže, neutrofily a monocyty, byl navíc identifikován properdin, molekula bohatá na glycin, která up-reguluje aktivitu komplementu [54,55]. Tato molekula byla identifikována u kapra obecného [56], takže se spekuluje, že dostupnost glycinu by mohla v této studii podporovat vyšší produkci properdinu a zvýšenou aktivitu ACH50.

Slizniční imunita kůže je velmi důležitá pro prevenci onemocnění v praxi akvakultury, protože voda slouží jako hlavní přenašeč patogenů a silná slizniční imunita může zabránit vstupu patogenů do nových ryb [57]. Lysozym kožní sliznice působí jako baktericidní činidlo, podobně jako plazmatický lysozym [49]. Proteáza v kožním hlenu zabíjí patogeny, snižuje integritu hlenu, zvyšuje odlupování vrstvy hlenu a aktivuje další imunitní parametry [58]. Kožní slizniční peroxidáza se podílí na tvorbě komplexu peroxidáza–H2O2–halogenid, silného baktericidního a cytotoxického činidla [58]. Aktivita ALP v kožním hlenu může detoxikovat prozánětlivé sloučeniny vytvořené mikroby [59]. Neexistují žádné podobné studie pro srovnání, ale současné výsledky naznačují, že suplementace glycinem ve stravě může zlepšit imunitu kožní sliznice u kapra obecného.

5. Závěry

Závěrem lze říci, že suplementace glycinem ve stravě může podporovat syntézu GSH, která zlepšuje antioxidační kapacitu a odolnost proti hemolýze v RBC. Navíc suplementace glycinem ve stravě zvyšuje populaci krevních neutrofilů a monocytů, což může být způsobeno ochrannou úlohou GSH v těchto buňkách. Je zajímavé, že glycin může zlepšit vidění vstupující do rybích těl. Na základě těchto výhod je doporučena dietní suplementace glycinem 5 g/kg pro suplementaci krmiva pro běžné kapry.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, ATM, SMH a HVD; metodika, MA a HR; software, SHH; formální analýza, SHH a SMH; vyšetřování, MA a SMH; správa dat, bankomat; psaní – příprava původního návrhu, MA a SMH; psaní—recenze a editace, SMH; vizualizace, HR; dozor, SMH; administrace projektů, ATM, SMH; získání finančních prostředků, HVD Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Na tuto studii nebyly získány žádné finanční prostředky.

Prohlášení institucionální revizní komise:

Protokol studie na zvířatech byl schválen Institutional Review Board of Inland Waters Aquatics Resources Research Center (ET.CG/2; 9. září 2021).“ pro studie zahrnující zvířata.

Prohlášení o informovaném souhlasu:

Nelze použít.

Prohlášení o dostupnosti dat:

Údaje této studie jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Poděkování:

Tato výzkumná práce byla částečně podporována Univerzitou Chiang Mai.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Mai, K.; Xue, M.; On, G.; Xie, SQ; Kaushik, SJ Kapitola 4 – Bílkoviny a aminokyseliny. In Výživa ryb, 4. vydání; Hardy, RW, Kaushik, SJ, Eds.; Academic Press: Oxford, Spojené království, 2022; s. 181–302.

2. Li, P.; Mai, KS; Trushenski, J.; Wu, GY Nový vývoj ve výživě ryb s aminokyselinami: Směrem k funkčním a ekologicky orientovaným vodním krmivům. Aminokyseliny. 2009, 37, 43–53. [CrossRef] [PubMed]

3. Hoseini, SM; Reverter, M. Zdraví prospěšné účinky aminokyselin v rybách. In Biotechnologické pokroky v managementu zdraví akvakultury; Gupta, SK, Giri, SS, Eds.; Springer Singapur: Singapur, 2021; s. 493–533.

4. Li, P.; Wu, G. Role dietního glycinu, prolinu a hydroxyprolinu při syntéze kolagenu a růstu zvířat. Aminokyseliny. 2018, 50, 29–38. [CrossRef] [PubMed]

5. Pérez-Torres, I.; María Zuniga-Munoz, A.; Guarner-Lans, V. Příznivé účinky aminokyseliny glycinu. Mini. Med. Chem. 2017, 17, 15–32. [CrossRef] [PubMed]

6. Kou, T.-S.; Wu, J.-H.; Chen, X.-W.; Chen, Z.-G.; Zheng, J.; Peng, B. Exogenní glycin podporuje oxidaci glutathionu a obnovuje citlivost bakteriálních patogenů na sérem indukovanou buněčnou smrt. Redox Biol. 2022, 58, 102512. [CrossRef]

7. Yang, D.-X.; Yang, M.-J.; Yin, Y.; Kou, T.-S.; Peng, L.-T.; Chen, Z.-G. Metabolismus serinu ladí imunitní reakce tak, aby podporovaly přežití Oreochromis niloticus po infekci Edwardsiella tarda. mSystems. 2021, 6, e00426-21. [CrossRef]

8. Xie, S.; Zhou, W.; Tian, ​​L.; Niu, J.; Liu, Y. Účinek suplementace N-acetylcysteinu a glycinu na růstovou výkonnost, syntézu glutathionu, antioxidační a imunitní schopnost tilapie nilské, Oreochromis niloticus. Ryby Korýši. Immunol. 2016, 55, 233–241. [CrossRef]

9. Rossi, W., Jr.; Allen, KM; Habte-Tsion, H.-M.; Meesala, K.-M. Suplementace glycinu, prebiotik a nukleotidů ve stravě na bázi sójové moučky pro okouna tolstolobika (Micropterus salmoides): Účinky na produkční výkonnost, složení a retenci živin v celém těle a histopatologii střev. Akvakultura 2021, 532, 736031. [CrossRef]

10. Hoseini, SM; Moghaddam, AA; Ghelichpour, M.; Pagheh, E.; Haghpanah, A.; Gharavi, B. Suplementace glycinem ve stravě moduluje antioxidační a imunitní reakce beluga, Huso huso, juvenilních jedinců. Aquac. Rep. 2022, 23, 101026. [CrossRef]

11. Hoseini, SM; Paolucci, M.; Arghideh, M.; Hosseinpour Delavar, F.; Zavvar, F.; Hoseinifar, SH Účinky dietního podávání glycinu na biochemické reakce na toxicitu amoniaku u kapra obecného, ​​Cyprinus carpio. Aquac. Res. 2022, 53, 2185–2194. [CrossRef]

12. Hoseini, SM; Majidiyan, N.; Mirghaed, AT; Hoseinifar, SH; Van Doan, H. Dietní suplementace glycinem zmírňuje transportem vyvolaný stres u kapra obecného, ​​Cyprinus carpio. Akvakultura. 2022, 551, 737959. [CrossRef]

13. Li, P.; Yin, Y.-L.; Li, D.; Woo Kim, S.; Wu, G. Aminokyseliny a imunitní funkce. Br. J. Nutr. 2007, 98, 237–252. [CrossRef]

14. Ji, Y.; Fan, X.; Zhang, Y.; Li, J.; Dai, Z.; Wu, Z. Glycin reguluje slizniční imunitu a střevní mikrobiální složení u odstavených selat. Aminokyseliny. 2021, 54, 385–398. [CrossRef] [PubMed]

15. Angermeier, SM; Shepard, MD; Tunnicliff, G. Transport glycinu červenými krvinkami kanálových sumců. Umět. J. Zool. 1996, 74, 688-692. [CrossRef]

16. Kim, KM; Kingsmore, SF; Han, H.; Yang-Feng, TL; Godinot, N.; Seldin, MF Klonování lidského glycinového transportéru typu 1: Molekulární a farmakologická charakterizace nových izoformních variant a chromozomální lokalizace genu v lidském a myším genomu. Mol. Pharmacol. 1994, 45, 608.

17. Winter, M.; Funk, J.; Körner, A.; Alberati, D.; Christen, F.; Schmitt, G. Účinky inhibice GlyT1 na erytropoézu a homeostázu železa u potkanů. Exp. Hematol. 2016, 44, 964–974.e4. [CrossRef]

18. Dacie, J.; Lewis, S. Praktická hematologie; Churchill a Livingston: Londýn, Velká Británie, 1996.

19. Ellis, AE Lysozymové testy. In Techniques in Fish Immunology; Stolen, JS, Ed.; SOS publikace: Fair Haven, NJ, USA, 1990; s. 101–103.

20. Yano, T. Testy aktivity hemolytického komplementu. In Techniques in Fish Immunology; Stolen, JS, Ed.; SOS publikace: Fair Haven, NJ, USA, 1992; s. 131–141.

21. Siwicki, A.; Anderson, D. Test nespecifických obranných mechanismů u ryb: II. Potenciální zabíjející aktivita neutrofilů a makrofágů, aktivita lysozymu v séru a orgánech a celková hladina imunoglobulinů v séru. In Diagnostika a metody prevence onemocnění ryb; Siwicki, A., Anderson, D., Waluga, J., Eds.; Wydawnictwo Instytutu Rybactwa Srodladowego: Olsztyn, Polsko, 1993; s. 105–112.

22. Yousefi, M.; Hoseini, SM; Vatnikov, YA; Nikishov, AA; Kulikov, EV Thymol jako nové anestetikum u kapra obecného (Cyprinus carpio): Účinnost a fyziologické účinky ve srovnání s eugenolem. Akvakultura 2018, 495, 376–383. [CrossRef]

23. Gao, Y.-J.; Liu, Y.-J.; Chen, X.-Q.; Yang, H.-J.; Li, X.-F.; Tian, ​​L.-X. Účinky odstupňovaných hladin histidinu na růstovou výkonnost, aktivity trávených enzymů, osmotickou fragilitu erytrocytů a toleranci k hypoxii juvenilního amura Ctenopharyngodon idella. Akvakultura 2016, 452, 388–394. [CrossRef]

24. Bradford, MM Rychlá a citlivá metoda pro kvantifikaci mikrogramových množství proteinu využívající princip vazby protein-barvivo. Anal Biochem. 1976, 72, 248–254. [CrossRef]

25. Quade, MJ; Roth, JA Rychlý, přímý test pro měření degranulace primárních granulí bovinních neutrofilů. Vet Immunol. Imunopathol. 1997, 58, 239–248. [CrossRef]

26. Zhang, W.-W.; Hu, Y.-H.; Wang, H.-L.; Sun, L. Identifikace a charakterizace proteázy asociované s virulencí z patogenního kmene Pseudomonas fluorescens. Vet Microbiol. 2009, 139, 183–188. [CrossRef]

27. Hoseinifar, SH; Roosta, Z.; Hajimoradloo, A.; Vakili, F. Účinky Lactobacillus acidophilus jako doplňku krmiva na imunitní parametry kožní sliznice, střevní mikrobiotu, odolnost vůči stresu a růstovou výkonnost mečovky černé (Xiphophorus helleri). Fish Shellfish Immunol. 2015, 42, 533–538. [CrossRef] [PubMed]

28. Fu, C.; Cui, Y.; Hung, SSO; Zhu, Z. Celotělový aminokyselinový vzor genu lidského růstového hormonu F4-transgenního kapra obecného (Cyprinus carpio) krmeného dietami s různými hladinami bílkovin. Akvakultura 2000, 189, 287–292. [CrossRef]

29. Gan, L.; Liu, YJ; Tian, ​​LX; Yue, YR; Yang, HJ; Liu, FJ Účinky rozpuštěného kyslíku a hladiny lysinu v potravě na růstovou výkonnost, poměr konverze krmiva a složení těla amura, Ctenopharyngodon idella. Akvakult. Nutr. 2013, 19, 860–869. [CrossRef]

30. Yun, Y.; Píseň, D.; On, Z.; Mi, J.; Wang, L.; Nie, G. Účinky suplementace methioninu ve stravě založené na rostlinných bílkovinách na růstovou výkonnost a kvalitu filé mláďat kapra žlutého říčního (Cyprinus carpio haematopterus). Akvakultura 2022, 549, 737810. [CrossRef]

31. Fazio, F. Analýza hematologie ryb jako důležitý nástroj akvakultury: Přehled. Akvakultura 2019, 500, 237–242. [CrossRef]

32. Mohseni, M.; Hamidoghli, A.; Bai, SC Organický a anorganický dietní zinek u jesetera beluga (Huso huso): Účinky na růst, hematologii, koncentraci tkání a oxidační kapacitu. Akvakultura 2021, 539, 736672. [CrossRef]

33. Mohseni, M.; Saltanat, NL; Rastravan, ME; Golalipour, Y. Účinky suplementace betainu ve stravě na bázi rostlinných proteinů na růstovou výkonnost, hemato-imunologické parametry, antioxidační stav a aktivity trávicích enzymů juvenilních pstruhů kaspických (Salmo trutta, Kessler, 1877). Akvakult. Nutr. 2021, 27, 2132–2141. [CrossRef]

34. Aftabgard, M.; Salarzadeh, A.; Mohseni, M.; Bahri Shabanipour, AH; Zorriehzahra, MEJ Kombinovaná účinnost dietních izomaltooligosacharidů a Bacillus spp. na indexy růstu, hemato-sérologické a střevní mikrobioty pstruha obecného kaspického (Salmo trutta caspius Kessler, 1877). Probiotika Antimikrob. Proteiny 2019, 11, 198–206. [CrossRef]

35. Michelato, M.; Zaminhan, M.; Boscolo, WR; Nogaroto, V.; Vicari, M.; Artoni, RF Dietní potřeba histidinu u juvenilních tilapií nilských na základě růstového výkonu, exprese genů souvisejících se svalovým růstem a hematologických odpovědí. Akvakultura 2017, 467, 63–70. [CrossRef]

36. Machado, M.; Azeredo, R.; Fontinha, F.; Fernández-Boo, S.; Conceição, LEC; Dias, J. Methionin ve stravě zlepšuje imunitní stav okouna obecného (Dicentrarchus labrax), zánětlivou odpověď a odolnost vůči chorobám. Přední. Immunol. 2018, 9, 2672. [CrossRef]

37. Sharf, Y.; Khan, MA Požadavek na lysinu v potravě Channa punctatus (Bloch) na základě růstu, konverze krmiva a účinnosti zadržování lysinu, poměru RNA/DNA, hematologických parametrů a antioxidační aktivity v séru. Akvakult. Nutr. 2021, 27, 140–150. [CrossRef]

38. Li, H.-T.; Feng, L.; Jiang, W.-D.; Liu, Y.; Jiang, J.; Li, S.-H. Parametry oxidačního stresu a antiapoptotická odpověď na hydroxylové radikály v rybích erytrocytech: Ochranné účinky glutaminu, alaninu, citrulinu a prolinu. Aquat. Toxicol. 2013, 126, 169–179. [CrossRef] [PubMed]

39. Gwo´zdzi ´ski, K.; Roche, H.; Pérès, G. Srovnání účinků iontů těžkých kovů na aktivity antioxidačních enzymů v lidských a rybích erytrocytech Dicentrarchus labrax. Comp. Biochem. Physiol. Část C Comp. Pharmacol. 1992, 102, 57–60. [CrossRef] [PubMed]

40. Janssens, BJ; Le Gall, R.; Rees, JF Peroxidem spouštěná hemolýza erytrocytů jako model pro studium oxidačního poškození u mořských ryb. J. Fish Biol. 2002, 61, 71–84. [CrossRef]

41. Maisey, K.; Imarai, M. Diverzita molekul leukocytů teleost: Role alternativního sestřihu. Fish Shellfish Immunol. 2011, 31, 663–672. [CrossRef] [PubMed]

42. Koch, JFA; de Oliveira, CAF; Zanuzzo, FS Dietní -glukan (MacroGard®) zlepšuje vrozené imunitní reakce a odolnost vůči chorobám u nilské tilapie bez ohledu na dobu podávání. Fish Shellfish Immunol. 2021, 112, 56–63. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com